전 비보 망막 조직 샘플에서 미토콘드리아 호흡 및 글리코리시스의 결정
Summary
여기에 기재된 미토콘드리아 응력 분석기 및 글리코리질 속도 분석기의 상세한 프로토콜은 상용 생체 분석기를 이용한 전 생체 망 막 조직 샘플에서 이다.
Abstract
미토콘드리아 호흡은 모든 세포, 특히 고활성 신진 대사를 가진 망막 광수용체에서 중요한 에너지 생성 경로입니다. 또한, 광수용체는 또한 암세포와 같은 높은 유산소 글리코리시스를 나타낸다. 이러한 신진 대사 활동의 정확한 측정생리 조건 및 질병 상태에서 세포 항상성에 귀중 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 높은 처리량 마이크로 플레이트 기반 의 소사는 살아있는 세포에서 미토콘드리아 호흡 및 다양한 대사 활동을 측정하기 위해 개발되었습니다. 그러나, 이들 중 대부분은 배양 된 세포를 위해 개발 되고 그대로 조직 샘플 및 응용 프로그램 ex vivo에 대 한 최적화 되지 않았습니다. 여기에 설명된 상세한 단계별 프로토콜은 마이크로플레이트 기반 형광 기술을 사용하여 미토콘드리아 호흡의 지표로서 산소 소비율(OCR)을 직접 측정하고, 전 생체 망막 조직에서, 글리코리시스의 지표로서 세포외산성화율(ECAR)을 직접 측정한다. 이 방법은 성공적으로 성인 마우스 망막에서 신진 대사 활동을 평가하고 노화와 질병의 세포 메커니즘을 조사에 그것의 응용 프로그램을 입증하는 데 사용되었습니다.
Introduction
미토콘드리아는 여러 가지 중요한 생리적 과정을 조정하여 세포 대사, 신호, 항상성 및 세포 사멸을 조절하는 필수 세포기관입니다1. 미토콘드리아는 산화 인산화(OXPHOS)를 통해 아데노신 삼위산염(ATP)을 생성하고 거의 모든 세포 이벤트를 지원하는 에너지를 제공하는 세포의 강국역할을 합니다. 세포 산소의 대다수는 유산소 호흡 도중 전자 수송 사슬 (ETC)에 있는 최종 전자 수용자로 작용하는 미토콘드리아에서 대사됩니다. 낮은 양의 ATP는 또한 포도당이 피루바테로 변환되는 시토솔의 글리코리시스로부터 생산될 수 있으며, 이는 젖산으로 더 변환되거나 미토콘드리아로 이송되고 삼환산성 사이클(TCA 사이클)의 기판인 아세틸-코아로 산화될 수 있다.
망막은 포유류에서 가장 신진 대사 활성 조직 중 하나입니다2, 미토콘드리아 호흡의 높은 수준을 표시하 고 매우 높은 산소 소비3. 막대와 콘 광수용체는 미토콘드리아4의 고밀도를 함유하고 있으며, OXPHOS는 망막5에서 대부분의 ATP를 생성한다. 또한, 망막은 또한 유산소 글리코리시스6,7에 크게 의존하여 포도당을 락테이트5로 변환합니다. 미토콘드리아 결함은 다양한 신경 퇴행성 질환과 연관되어 있습니다8,9; 그리고 그것의 독특한 높은 에너지 요구와 함께, 망막은 미토콘드리아 OXPHOS4 및 glycolysis10에 영향을 미치는 사람들을 포함하여 신진 대사 결함에 특히 취약합니다. 글리코리시스의 미토콘드리아 기능 장애 및 결함은 망막11,12 및 황반13 퇴행성 질환, 연령 관련 황반 변성10,14,15,16 및 당뇨병 성 망막증17,18에 연루되어 있습니다. 따라서 미토콘드리아 호흡 및 글리코리시스의 정확한 측정은 망막의 무결성과 건강을 평가하기 위한 중요한 매개 변수를 제공할 수 있습니다.
미토콘드리아 호흡은 산소 소비율(OCR)의 측정을 통해 측정될 수 있다. 포도당이 피루바테로 전환되고 젖산으로 전환하여 세포 외 환경의 배설 및 세포 외 환경의 산성화를 초래한다는 점을 감안할 때, 세포외 산성화율(ECAR)의 측정은 글리코리시스 플럭스의 표시를 제공한다. 망막은 기판6의 교환을 포함하여 친밀한 관계 및 적극적인 시너지를 가진 다중 세포 모형으로 구성되기 때문에, 온전한 적층 및 회로를 가진 전체 망막 조직의 맥락에서 미토콘드리아 기능 및 물질 대사를 분석하는 것이 필수적이다. 지난 수십 년 동안, 클라크 타입 O2 전극 및 그밖 산소 미세 전극은 망막19,20,21에 있는 산소 소비를 측정하기 위하여 이용되었습니다. 이러한 산소 전극은 감도에 있는 중요한 한계, 큰 견본 부피의 요구 사항 및 일반적으로 세포 및 조직 문맥의 중단으로 이끌어 내는 일시 중단 견본의 연속적인 교반을 위한 필요를 가지고 있습니다. 여기서 설명된 프로토콜은 마이크로플레이트 계의 형광 기술을 사용하여 새로 해부된 전 생체 내 마우스 망막 조직에서 미토콘드리아 에너지 대사를 측정하여 개발되었다. 그것은 서스펜션 및 연속 교반의 필요성을 피하면서 전 생체 망막 조직의 작은 샘플 (1mm 펀치)를 사용하여 동시에 OCR과 ECAR모두의 중간 처리량 실시간 측정을 허용합니다.
여기에 입증된 미토콘드리아 스트레스 분석 및 글리코리질 속도 분석시 에 대한 실험 절차로, 갓 해부된 망막 펀치 디스크에 대한 분석. 이 프로토콜은 전 생체 조직 맥락에서 미토콘드리아 관련 대사 활동의 측정을 허용한다. 배양된 세포를 사용하여 수행된 애서와는 달리, 여기서 얻은 수치는 조직 수준에서 결합된 에너지 대사를 반영하고 조직 내의 상이한 세포 유형 간의 상호 작용에 의해 좌우된다. 이 프로토콜은 이전에 게시된 버전22,23에서 수정되어 Islet Capture 플레이트를 사용하여 애질런트 해마 세포 외 플럭스 24-wells(XFe24) 분석기의 새로운 세대에 적응합니다. 분석 매체, 주사 화합물 농도, 및 분석 주기의 수/기간 또한 망막 조직에 대 한 최적화 되었습니다. 망막 펀치 디스크의 준비를 위해 자세한 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 프로그램 설정 및 데이터 분석에 대한 자세한 내용은 제조업체의 사용자 가이드24,25,26에서 얻을 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제공된 미토콘드리아 호흡 및 글리코리시스 활성의 마이크로플레이트 기반 의 작용을 전 생체, 갓 해부한 망막 펀치 디스크를 사용하여 수행하기 위한 자세한 지침이 있습니다. 프로토콜은 최적화되었습니다 : 1) 전 생체 망막 조직에 적합한 분석 매체의 사용을 보장; 2) 장비의 최적의 검출 범위에 속하는 OCR 및 ECAR 판독값을 얻기 위해 망막 펀치 디스크의 적절한 크기를 고용;…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 안과 연구소 (ZIAEY000450 및 ZIAEY000546)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원됩니다.
Materials
| 1X PBS | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| 2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution | Sigma | D6134 | Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time |
| 30-gauge needle | BD Precision Glide | 305106 | |
| Antimycin A, 10 mM stock solution | Sigma | A8674 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Bam15, 10 mM stock solution | TimTec | ST056388 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Biopsy puncher, 1 mm | Integra Miltex | 33-31AA | |
| Cell-Tak | Corning Life Sciences | CB40240 | |
| CO2 asphyxiation chamber | |||
| Dissection forceps-Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-10 | Stright tip |
| Dissection forceps-Dumont #7 | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved tip |
| Dissection microscope | |||
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | Curved, Serrated tip |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15004-08 | Curved tip |
| NaOH solution, 1 M | Sigma-Aldrich | S8263 | Aqueous solution, prepare ahead of time |
| Rotenone, 10 mM stock solution | Sigma | R8875 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Seahorse calibration medium | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose | Agilent | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pyruvate | Agilent | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine | Agilent | 103579-100 | |
| Seahorse XF DMEM medium | Agilent | 103575-100 | pH 7.4, with 5 mM HEPES |
| Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak | Agilent | 103518-100 | Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate |
| Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer | Agilent | ||
| Sodium bicarbonate solution, 0.1 M | Sigma-Aldrich | S5761 | Aqueous solution, prepare ahead of time |
| Superfine eyelash brush | Ted Pella | 113 |
Riferimenti
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye Brain. 2, 99-116 (2010).
- Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease. Progress in Retina and Eye Research. 20, 175-208 (2001).
- Barot, M., Gokulgandhi, M. R., Mitra, A. K. Mitochondrial dysfunction in retinal diseases. Current Eye Research. 36 (12), 1069-1077 (2011).
- Joyal, J. S., Gantner, M. L., Smith, L. E. H. Retinal energy demands control vascular supply of the retina in development and disease: The role of neuronal lipid and glucose metabolism. Progress in Retina and Eye Research. 64, 131-156 (2018).
- Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of Neuroscience Research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
- Haydinger, C. D., Kittipassorn, T., Peet, D. J. Power to see-Drivers of aerobic glycolysis in the mammalian retina: A review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1057-1071 (2020).
- Wright, A. F., et al. Lifespan and mitochondrial control of neurodegeneration. Nature Genetics. 36, 1153-1158 (2004).
- Bossy-Wetzel, E., Schwarzenbacher, R., Lipton, S. A. Molecular pathways to neurodegeneration. Nature Medicine. 10, 2-9 (2004).
- Leveillard, T., Philp, N. J., Sennlaub, F. Is retinal metabolic dysfunction at the center of the pathogenesis of age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), (2019).
- Vlachantoni, D., et al. Evidence of severe mitochondrial oxidative stress and a protective effect of low oxygen in mouse models of inherited photoreceptor degeneration. Human Molecular Genetics. 20 (2), 322-335 (2011).
- Grenell, A., et al. Loss of MPC1 reprograms retinal metabolism to impair visual function. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (9), 3530-3535 (2019).
- Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews in Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).
- Jarrett, S. G., Boulton, M. E. Consequences of oxidative stress in age-related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 399-417 (2012).
- Rozing, M., et al. Age-related macular degeneration: A two-level model hypothesis. Progress in Retina Eye Research. 76, 100825 (2020).
- Yokosako, K., et al. Glycolysis in patients with age-related macular degeneration. Open Ophthalmology Journal. 8, 39-47 (2014).
- Bek, T. Mitochondrial dysfunction and diabetic retinopathy. Mitochondrion. 36, 4-6 (2017).
- Yumnamcha, T., Guerra, M., Singh, L. P., Ibrahim, A. S. Metabolic dysregulation and neurovascular dysfunction in diabetic retinopathy. Antioxidants. 9 (12), (2020).
- Futterman, S., Kinoshita, J. H. Metabolism of the retina. I. Respiration of cattle retina. Journal of Biological Chemistry. 234 (4), 723-726 (1959).
- Linsenmeier, R. A. Effects of light and darkness on oxygen distribution and consumption in the cat retina. Journal of General Physiology. 88 (4), 521-542 (1986).
- Medrano, C. J., Fox, D. A. Oxygen consumption in the rat outer and inner retina: light- and pharmacologically-induced inhibition. Experiments in Eye Research. 61 (3), 273-284 (1995).
- Kooragayala, K. Quantification of oxygen consumption in retina ex vivo demonstrates limited reserve capacity of photoreceptor mitochondria. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
- Adlakha, Y. K., Swaroop, A. Determination of mitochondrial oxygen consumption in the retina ex vivo: applications for retinal disease. Methods in Molecular Biology. 1753, 167-177 (2018).
- . Agilent Mitocondrial stress test user guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021)
- . Agilent Glycolytic rate assay user guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf (2021)
- . Agilent wave 2.6 user guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf (2021)
- . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals Available from: https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf (2021)
- . Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology Available from: https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf (2021)
- . Report Generator User Guide Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf (2021)
- . Agilent Seahorse XF Buffer Factor Protocol Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf (2021)
- . Agilent sensor cartridges and cell culture microplates Available from: https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf (2021)
- . Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021)
- Fan, Y. Y. A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309, 1-9 (2015).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (10), 3890-3895 (2006).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).
- Corso-Diaz, X., et al. Genome-wide profiling identifies DNA methylation signatures of aging in rod photoreceptors associated with alterations in energy metabolism. Cell Reports. 31 (3), 107525 (2020).
- Berkowitz, B. A., et al. Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).
- Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).
