Bestimmung der mitochondrialen Atmung und Glykolyse in Ex-vivo-Netzhautgewebeproben
Summary
Hier beschrieben ist ein detailliertes Protokoll zur Durchführung eines mitochondrialen Stresstests und eines Glykolytika-Rate-Assays in ex vivo Netzhautgewebeproben unter Verwendung eines kommerziellen Bioanalytikers.
Abstract
Die mitochondriale Atmung ist ein kritischer energieerzeugender Weg in allen Zellen, insbesondere in retinalen Photorezeptoren, die einen hochaktiven Stoffwechsel besitzen. Darüber hinaus weisen Photorezeptoren auch eine hohe aerobe Glykolyse wie Krebszellen auf. Präzise Messungen dieser Stoffwechselaktivitäten können wertvolle Einblicke in die zelluläre Homöostase unter physiologischen Bedingungen und in Krankheitszuständen liefern. Hochdurchsatz-Mikroplatten-basierte Assays wurden entwickelt, um die mitochondriale Atmung und verschiedene Stoffwechselaktivitäten in lebenden Zellen zu messen. Ein Großteil davon wird jedoch für kultivierte Zellen entwickelt und ist nicht für intakte Gewebeproben und für die Anwendung ex vivo optimiert. Hier wird ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll unter Verwendung der Mikroplatten-basierten Fluoreszenztechnologie beschrieben, um die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) als Indikator für die mitochondriale Atmung sowie die extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) als Indikator für die Glykolyse in intaktem Ex-vivo-Netzhautgewebe direkt zu messen. Diese Methode wurde verwendet, um die Stoffwechselaktivitäten in der Netzhaut der erwachsenen Maus erfolgreich zu bewerten und ihre Anwendung bei der Untersuchung zellulärer Mechanismen des Alterns und der Krankheit zu demonstrieren.
Introduction
Mitochondrien sind essentielle Organellen, die den Zellstoffwechsel, die Signalübertragung, die Homöostase und die Apoptose regulieren, indem sie mehrere entscheidende physiologische Prozesse koordinieren1. Mitochondrien dienen als Kraftpaket in der Zelle, um Adenosintriphosphat (ATP) durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) zu erzeugen und Energie bereitzustellen, die fast alle zellulären Ereignisse unterstützt. Der Großteil des zellulären Sauerstoffs wird in Mitochondrien metabolisiert, wo er während der aeroben Atmung als letzter Elektronenakzeptor in der Elektronentransportkette (ETC) dient. Geringe Mengen an ATP können auch aus der Glykolyse im Zytosol hergestellt werden, wo Glukose in Pyruvat umgewandelt wird, das weiter in Laktat umgewandelt oder in Mitochondrien transportiert und zu Acetyl-CoA, einem Substrat im Tricarbonsäurezyklus (TCA-Zyklus), oxidiert werden kann.
Die Netzhaut ist eines der metabolisch aktivsten Gewebe bei Säugetieren2 und weist eine hohe mitochondriale Atmung und einen extrem hohen Sauerstoffverbrauch auf3. Die Stäbchen- und Zapfenphotorezeptoren enthalten eine hohe Dichte an Mitochondrien4, und OXPHOS erzeugt das meiste ATP in der Netzhaut5. Darüber hinaus stützt sich die Netzhaut auch stark auf die aerobe Glykolyse6,7, indem sie Glukose in Laktat umwandelt5. Mitochondriale Defekte sind mit verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert8,9; und mit ihrem einzigartigen hohen Energiebedarf ist die Netzhaut besonders anfällig für Stoffwechseldefekte, einschließlich solcher, die mitochondriales OXPHOS4 und Glykolyse10 betreffen. Mitochondriale Dysfunktion und Defekte in der Glykolyse sind an degenerativen Erkrankungen der Netzhaut11,12 und Makula 13, altersbedingter Makuladegeneration10,14,15,16 und diabetischer Retinopathie 17,18 beteiligt. Daher können genaue Messungen der mitochondrialen Atmung und Glykolyse wichtige Parameter für die Beurteilung der Integrität und Gesundheit der Netzhaut liefern.
Die mitochondriale Atmung kann durch die Bestimmung der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) gemessen werden. Da die Umwandlung von Glukose in Pyruvat und anschließend in Laktat zur Extrusion von Protonen in die extrazelluläre Umgebung und zur Versauerung der extrazellulären Umgebung führt, liefern Messungen der extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR) einen Hinweis auf den Glykolysefluss. Da die Netzhaut aus mehreren Zelltypen mit intimen Beziehungen und aktiver Synergie besteht, einschließlich des Austauschs von Substraten6, ist es unerlässlich, die mitochondriale Funktion und den Stoffwechsel im Kontext des gesamten Netzhautgewebes mit intakter Laminierung und Schaltkreise zu analysieren. In den letzten Jahrzehnten wurden die Clark-O2-Elektroden und andere Sauerstoffmikroelektroden verwendet, um den Sauerstoffverbrauch in der Netzhaut zu messen19,20,21. Diese Sauerstoffelektroden haben große Einschränkungen in der Empfindlichkeit, die Anforderung eines großen Probenvolumens und die Notwendigkeit eines kontinuierlichen Rührens der suspendierenden Probe, was normalerweise zur Störung des Zell- und Gewebekontexts führt. Das hier beschriebene Protokoll wurde unter Verwendung einer Mikroplatten-basierten Fluoreszenztechnik entwickelt, um den mitochondrialen Energiestoffwechsel in frisch seziertem Ex-vivo-Netzhautgewebe der Maus zu messen. Es ermöglicht Echtzeitmessungen von OCR und ECAR im mittleren Durchsatz gleichzeitig mit einer kleinen Probe (1 mm Stempel) von Ex-vivo-Netzhautgewebe, wobei die Notwendigkeit einer Suspension und eines kontinuierlichen Rührens vermieden wird.
Demonstriert wird hier das experimentelle Verfahren für den mitochondrialen Stresstest und den glykolytischen Geschwindigkeitstest auf frisch sezierten netztinalen Stanzscheiben. Dieses Protokoll ermöglicht die Messung von mitochondrienbedingten Stoffwechselaktivitäten in einem ex vivo Gewebekontext. Im Gegensatz zu den Assays, die mit kultivierten Zellen durchgeführt werden, spiegeln die hier erhaltenen Messwerte den kombinierten Energiestoffwechsel auf Gewebeebene wider und werden durch Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Zelltypen innerhalb des Gewebes beeinflusst. Das Protokoll wurde gegenüber einer zuvor veröffentlichten Version22,23 modifiziert, um es an die neue Generation des Agilent Seahorse Extracellular Flux 24-Wells (XFe24) Analysators mit Islet Capture Platte anzupassen. Das Assay-Medium, die Konzentrationen der Injektionsverbindungen und die Anzahl/Dauer der Assay-Zyklen wurden ebenfalls für das Netzhautgewebe optimiert. Für die Herstellung von netztinalen Lochscheiben wird ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll gegeben. Weitere Informationen zum Programmaufbau und zur Datenanalyse finden Sie im Benutzerhandbuch des Herstellers24,25,26.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier finden Sie detaillierte Anweisungen zur Durchführung von Mikroplatten-basierten Assays der mitochondrialen Atmung und Glykolyseaktivität unter Verwendung von ex vivo, frisch sezierten netztinalen Lochscheiben. Das Protokoll wurde optimiert, um: 1) die Verwendung eines geeigneten Assay-Mediums für ex vivo Netzhautgewebe sicherzustellen; 2) Verwenden Sie die richtige Größe von netztinalen Stanzscheiben, um OCR- und ECAR-Messwerte zu erhalten, die in den optimalen Erfassungsbereich der Maschine f…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird durch das Intramurale Forschungsprogramm des National Eye Institute (ZIAEY000450 und ZIAEY000546) unterstützt.
Materials
| 1X PBS | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| 2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution | Sigma | D6134 | Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time |
| 30-gauge needle | BD Precision Glide | 305106 | |
| Antimycin A, 10 mM stock solution | Sigma | A8674 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Bam15, 10 mM stock solution | TimTec | ST056388 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Biopsy puncher, 1 mm | Integra Miltex | 33-31AA | |
| Cell-Tak | Corning Life Sciences | CB40240 | |
| CO2 asphyxiation chamber | |||
| Dissection forceps-Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-10 | Stright tip |
| Dissection forceps-Dumont #7 | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved tip |
| Dissection microscope | |||
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | Curved, Serrated tip |
| Microscissors | Fine Science Tools | 15004-08 | Curved tip |
| NaOH solution, 1 M | Sigma-Aldrich | S8263 | Aqueous solution, prepare ahead of time |
| Rotenone, 10 mM stock solution | Sigma | R8875 | Dissolve in DMSO, prepare ahead of time |
| Seahorse calibration medium | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose | Agilent | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pyruvate | Agilent | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine | Agilent | 103579-100 | |
| Seahorse XF DMEM medium | Agilent | 103575-100 | pH 7.4, with 5 mM HEPES |
| Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak | Agilent | 103518-100 | Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate |
| Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer | Agilent | ||
| Sodium bicarbonate solution, 0.1 M | Sigma-Aldrich | S5761 | Aqueous solution, prepare ahead of time |
| Superfine eyelash brush | Ted Pella | 113 |
Riferimenti
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