JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

Ex Vivo Retinal Doku Örneklerinde Mitokondriyal Solunum ve Glikoliz Tayini

Published: August 04, 2021
doi:
10.3791/62914
, ,
1Neurobiology, Neurodegeneration & Repair Laboratory, National Eye Institute,National Institutes of Health

Summary

Burada, ticari bir biyoanalizör kullanarak ex vivo retinal doku örneklerinde mitokondriyal stres tahlilini ve glikolitik oran tahlilini yapmak için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır.

Abstract

Mitokondriyal solunum, tüm hücrelerde, özellikle de oldukça aktif bir metabolizmaya sahip retina fotoreceptörlerinde kritik bir enerji üreten yoldur. Ek olarak, fotoreceptörler de kanser hücreleri gibi yüksek aerobik glikoliz sergiler. Bu metabolik aktivitelerin hassas ölçümleri, fizyolojik koşullar altında ve hastalık durumlarında hücresel homeostaz hakkında değerli içgörüler sağlayabilir. Canlı hücrelerde mitokondriyal solunumu ve çeşitli metabolik aktiviteleri ölçmek için yüksek verim mikro plaka bazlı tahliller geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bunların büyük bir çoğunluğu kültürlü hücreler için geliştirilmiştir ve bozulmamış doku örnekleri ve uygulama ex vivo için optimize edilmiştir. Burada açıklanan, mikro plaka tabanlı floresan teknolojisini kullanarak, mitokondriyal solunumun bir göstergesi olarak oksijen tüketim oranını (OCR) ve glikoliz göstergesi olarak hücre dışı asitleşme oranını (ECAR) doğrudan ölçmek için sağlam ex vivo retina dokusunda ayrıntılı bir adım adım protokoldür. Bu yöntem, yetişkin fare retinasında metabolik aktiviteleri başarılı bir şekilde değerlendirmek ve yaşlanma ve hastalığın hücresel mekanizmalarını araştırmadaki uygulamasını göstermek için kullanılmıştır.

Introduction

Mitokondriler, birden fazla önemli fizyolojik süreci koordine ederek hücresel metabolizmayı, sinyalizasyon, homeostaz ve apoptoz düzenleyen temel organeldir1. Mitokondri, oksidatif fosforilasyon (OKSOFS) yoluyla adenozin trifosfat (ATP) üretmek ve hemen hemen tüm hücresel olayları destekleyen enerji sağlamak için hücredeki güç merkezi olarak hizmet vermektedir. Hücresel oksijenin çoğunluğu, aerobik solunum sırasında elektron taşıma zincirinde (ETC) son elektron kabul edicisi olarak hizmet ettiği mitokondrilerde metabolize edilir. Düşük miktarda ATP, glikozun piruvata dönüştürüldüğü, laktata daha fazla dönüştürülebilen veya mitokondrilere taşınabilen ve trikarboksilik asit döngüsünde (TCA döngüsü) bir substrat olan asetil-CoA’ya oksitlenebilen sitozoldeki glikolizden de üretilebilir.

Retina, memelilerde metabolik olarak en aktif dokulardan biridir2, yüksek düzeyde mitokondriyal solunum ve son derece yüksek oksijen tüketimi gösterir3. Çubuk ve koni fotoreceptörleri yüksek yoğunlukta mitokondri4 içerir ve OXPHOS retinada çoğu ATP üretir5. Ek olarak, retina ayrıca glikozu laktatata dönüştürerek aerobik glikoliz6,7’ye de dayanır5. Mitokondriyal defektler çeşitli nörodejeneratif hastalıklarla ilişkilidir8,9; ve benzersiz yüksek enerji talepleri ile retina, mitokondriyal OKSPHOS4 ve glikoliz10’u etkileyenler de dahil olmak üzere metabolik kusurlara karşı özellikle savunmasızdır. Glikolizdeki mitokondriyal disfonksiyon ve defektler retina11,12 ve maküler13 dejeneratif hastalıklarda, yaşa bağlı makula dejenerasyonunda10,14,15,16 ve diyabetik retinopatide ilişkilidir17,18. Bu nedenle, mitokondriyal solunum ve glikolizin doğru ölçümleri retinanın bütünlüğünü ve sağlığını değerlendirmek için önemli parametreler sağlayabilir.

Mitokondriyal solunum, oksijen tüketim oranının (OCR) belirlenmesi ile ölçülebilir. Glikozun piruvata ve daha sonra laktata dönüştürülmesinin protonların hücre dışı ortama ekstrüzyonuna ve asitleşmesine neden olduğu göz önüne alındığında, hücre dışı asitleşme oranının (ECAR) ölçümleri glikoliz akısının bir göstergesini sağlar. Retina, substrat değişimi de dahil olmak üzere samimi ilişkilere ve aktif sinerjiye sahip birden fazla hücre tipinden oluştuğundan6, mitokondriyal fonksiyonu ve metabolizmayı tüm retina dokusu bağlamında bozulmamış laminasyon ve devre ile analiz etmek zorunludur. Son birkaç on yıldır, Clark tipi O2 elektrotları ve diğer oksijen mikroelektodları retinadaki oksijen tüketimini ölçmek için kullanılmıştır19,20,21. Bu oksijen elektrotları hassasiyette büyük sınırlamalara, büyük bir numune hacmine ve genellikle hücresel ve doku bağlamının bozulmasına yol açan askıda numunenin sürekli karıştırılması ihtiyacına sahiptir. Burada açıklanan protokol, yeni parçalanmış ex vivo fare retina dokusunda mitokondriyal enerji metabolizmasını ölçmek için mikro plaka bazlı, floresan tekniği kullanılarak geliştirilmiştir. Süspansiyon ve sürekli karıştırma ihtiyacını önlerken, ex vivo retina dokusunun küçük bir örneğini (1 mm punch) kullanarak hem OCR hem de ECAR’ın orta verimli gerçek zamanlı ölçümlerine izin verir.

Burada, yeni parçalanmış retinal zımba disklerinde mitokondriyal stres tahlili ve glikoliptik oran tahlil için deneysel prosedür gösterilmiştir. Bu protokol, mitokondri ile ilgili metabolik aktivitelerin eks vivo doku bağlamında ölçülenine izin verir. Kültürlü hücreler kullanılarak yapılan tahlillerden farklı olarak, burada elde edilen okumalar doku düzeyinde kombine enerji metabolizmasını yansıtır ve doku içindeki farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimlerden etkilenir. Protokol, Islet Capture plakalı Agilent Seahorse hücre dışı akı 24 kuyulu (XFe24) çözümleyicisinin yeni nesline uyum sağlamak için daha önce yayımlanmış bir sürüm22,23’ten değiştirilir. Tahlil ortamı, enjeksiyon bileşik konsantrasyonları ve tahlil döngülerinin sayısı/süresi de retina dokusu için optimize edilmiştir. Retina zımba disklerinin hazırlanması için ayrıntılı bir adım adım protokol verilir. Program kurulumu ve veri analizi hakkında daha fazla bilgi üreticinin kullanım kılavuzundan alınabilir24,25,26.

Protocol

Tüm fare protokolleri Ulusal Göz Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (NEI ASP# 650) tarafından onaylandı. Fareler 12 saat açık-karanlık koşullarda barındırıldı ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi, Laboratuvar Hayvan Kaynakları Enstitüsü ve Laboratuvar Hayvanlarının İnsani Bakımı ve Kullanımına ilişkin Halk Sağlığı Hizmet Politikası’nın önerilerine uyularak bakımları yapıldı. 1. Sensör kartuşunun nemlendirilmesi ve test or…

Representative Results

Burada bildirilen veriler, 4 aylık transgenik Nrl-L-EGFP mice36’dan (C57B/L6 arka plan) taze parçalanmış 1 mm retinal zımba diskleri kullanılarak gerçekleştirilen OCR izini (Şekil 1) ve OCR izini ve ECAR izini gösteren glikoliptik oran testini gösteren temsili mitokondriyal stres tahlilidir (Şekil 2). Bu fareler GFP’yi normal retina gelişimini, histolojiyi ve fizyolojiyi değiştirmeden özellikle çubuk fotoreceptö…

Discussion

Burada, ex vivo, taze parçalanmış retina zımba diskleri kullanarak mitokondriyal solunum ve glikoliz aktivitesinin mikro plaka bazlı testlerini gerçekleştirmek için ayrıntılı talimatlar verilmiştir. Protokol şu şekilde optimize edilmiştir: 1) ex vivo retina dokusu için uygun bir tahlil ortamının kullanılmasını sağlamak; 2) makinenin optimum algılama aralığına giren OCR ve ECAR okumalarını elde etmek için uygun boyutta retina delme diskleri kullanmak; 3) ölçüm döngüsü s…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Ulusal Göz Enstitüsü Intramural Araştırma Programı (ZIAEY000450 ve ZIAEY000546) tarafından desteklenmektedir.

Materials

1X PBS Thermo Fisher 14190-144
2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution Sigma D6134 Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time
30-gauge needle BD Precision Glide 305106
Antimycin A, 10 mM stock solution Sigma A8674 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Bam15, 10 mM stock solution TimTec ST056388 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Biopsy puncher, 1 mm Integra Miltex 33-31AA
Cell-Tak Corning Life Sciences CB40240
CO2 asphyxiation chamber
Dissection forceps-Dumont #5 Fine Science Tools 11251-10 Stright tip
Dissection forceps-Dumont #7 Fine Science Tools 11274-20 Curved tip
Dissection microscope
DMSO Sigma D2438
Graefe forceps Fine Science Tools 11051-10 Curved, Serrated tip
Microscissors Fine Science Tools 15004-08 Curved tip
NaOH solution, 1 M Sigma-Aldrich S8263 Aqueous solution, prepare ahead of time
Rotenone, 10 mM stock solution Sigma R8875 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Seahorse calibration medium Agilent 100840-000
Seahorse XF 1.0 M glucose Agilent 103577-100
Seahorse XF 100 mM pyruvate Agilent 103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine Agilent 103579-100
Seahorse XF DMEM medium Agilent 103575-100 pH 7.4, with 5 mM HEPES
Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak Agilent 103518-100 Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate
Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer Agilent
Sodium bicarbonate solution, 0.1 M Sigma-Aldrich S5761 Aqueous solution, prepare ahead of time
Superfine eyelash brush Ted Pella 113
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  2. Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye Brain. 2, 99-116 (2010).
  3. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease. Progress in Retina and Eye Research. 20, 175-208 (2001).
  4. Barot, M., Gokulgandhi, M. R., Mitra, A. K. Mitochondrial dysfunction in retinal diseases. Current Eye Research. 36 (12), 1069-1077 (2011).
  5. Joyal, J. S., Gantner, M. L., Smith, L. E. H. Retinal energy demands control vascular supply of the retina in development and disease: The role of neuronal lipid and glucose metabolism. Progress in Retina and Eye Research. 64, 131-156 (2018).
  6. Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of Neuroscience Research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
  7. Haydinger, C. D., Kittipassorn, T., Peet, D. J. Power to see-Drivers of aerobic glycolysis in the mammalian retina: A review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1057-1071 (2020).
  8. Wright, A. F., et al. Lifespan and mitochondrial control of neurodegeneration. Nature Genetics. 36, 1153-1158 (2004).
  9. Bossy-Wetzel, E., Schwarzenbacher, R., Lipton, S. A. Molecular pathways to neurodegeneration. Nature Medicine. 10, 2-9 (2004).
  10. Leveillard, T., Philp, N. J., Sennlaub, F. Is retinal metabolic dysfunction at the center of the pathogenesis of age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), (2019).
  11. Vlachantoni, D., et al. Evidence of severe mitochondrial oxidative stress and a protective effect of low oxygen in mouse models of inherited photoreceptor degeneration. Human Molecular Genetics. 20 (2), 322-335 (2011).
  12. Grenell, A., et al. Loss of MPC1 reprograms retinal metabolism to impair visual function. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (9), 3530-3535 (2019).
  13. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews in Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).
  14. Jarrett, S. G., Boulton, M. E. Consequences of oxidative stress in age-related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 399-417 (2012).
  15. Rozing, M., et al. Age-related macular degeneration: A two-level model hypothesis. Progress in Retina Eye Research. 76, 100825 (2020).
  16. Yokosako, K., et al. Glycolysis in patients with age-related macular degeneration. Open Ophthalmology Journal. 8, 39-47 (2014).
  17. Bek, T. Mitochondrial dysfunction and diabetic retinopathy. Mitochondrion. 36, 4-6 (2017).
  18. Yumnamcha, T., Guerra, M., Singh, L. P., Ibrahim, A. S. Metabolic dysregulation and neurovascular dysfunction in diabetic retinopathy. Antioxidants. 9 (12), (2020).
  19. Futterman, S., Kinoshita, J. H. Metabolism of the retina. I. Respiration of cattle retina. Journal of Biological Chemistry. 234 (4), 723-726 (1959).
  20. Linsenmeier, R. A. Effects of light and darkness on oxygen distribution and consumption in the cat retina. Journal of General Physiology. 88 (4), 521-542 (1986).
  21. Medrano, C. J., Fox, D. A. Oxygen consumption in the rat outer and inner retina: light- and pharmacologically-induced inhibition. Experiments in Eye Research. 61 (3), 273-284 (1995).
  22. Kooragayala, K. Quantification of oxygen consumption in retina ex vivo demonstrates limited reserve capacity of photoreceptor mitochondria. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
  23. Adlakha, Y. K., Swaroop, A. Determination of mitochondrial oxygen consumption in the retina ex vivo: applications for retinal disease. Methods in Molecular Biology. 1753, 167-177 (2018).
  24. . Agilent Mitocondrial stress test user guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021)
  25. . Agilent Glycolytic rate assay user guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf (2021)
  26. . Agilent wave 2.6 user guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf (2021)
  27. . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals Available from: https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf (2021)
  28. . Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology Available from: https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf (2021)
  29. . Report Generator User Guide Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf (2021)
  30. . Agilent Seahorse XF Buffer Factor Protocol Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf (2021)
  31. . Agilent sensor cartridges and cell culture microplates Available from: https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf (2021)
  32. . Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021)
  33. Fan, Y. Y. A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309, 1-9 (2015).
  34. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  35. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  36. Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (10), 3890-3895 (2006).
  37. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).
  38. Corso-Diaz, X., et al. Genome-wide profiling identifies DNA methylation signatures of aging in rod photoreceptors associated with alterations in energy metabolism. Cell Reports. 31 (3), 107525 (2020).
  39. Berkowitz, B. A., et al. Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).
  40. Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).

Tags

Keywords: Mitochondrial RespirationGlycolysisEx VivoSeahorse AnalysisInherited Retinal DegenerationRetinal DissectionMouse RetinaFluorophore ActivationAssay MediumRetinal Punch Preparation
check_url/it/62914?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Jiang, K., Nellissery, J., Swaroop, A. Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples. J. Vis. Exp. (174), e62914, doi:10.3791/62914 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image