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Medicina

Ein epitheliales Abriebmodell zur Untersuchung der Hornhautwundheilung

Published: December 29, 2021
doi:
10.3791/63112
, , , ,
1College of Optometry,University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center,Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID),Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Summary

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer zentralen Hornhautepithelabriebwicklung in der Maus mit einem Trephin und einem stumpfen Golfschläger-Spud beschrieben. Dieses Hornhautwundheilungsmodell ist hochgradig reproduzierbar und wird nun verwendet, um eine kompromittierte Hornhautwundheilung im Zusammenhang mit Krankheiten zu bewerten.

Abstract

Die Hornhaut ist entscheidend für das Sehen und macht etwa zwei Drittel der Brechkraft des Auges aus. Entscheidend für die Rolle der Hornhaut im Sehvermögen ist ihre Transparenz. Aufgrund ihrer äußeren Position ist die Hornhaut jedoch sehr anfällig für eine Vielzahl von Verletzungen, die zum Verlust der Hornhauttransparenz und schließlich zur Erblindung führen können. Eine effiziente Hornhautwundheilung als Reaktion auf diese Verletzungen ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Hornhauthomöostase und die Erhaltung der Hornhauttransparenz und der Brechungsfähigkeiten. Bei kompromittierter Hornhautwundheilung wird die Hornhaut anfällig für Infektionen, Ulzerationen und Narbenbildung. Angesichts der grundlegenden Bedeutung der Hornhautwundheilung für die Erhaltung der Transparenz und des Sehvermögens der Hornhaut ist ein besseres Verständnis des normalen Hornhautwundheilungsprozesses eine Voraussetzung für das Verständnis der mit Infektionen und Krankheiten verbundenen beeinträchtigten Hornhautwundheilung. Um dieses Ziel zu erreichen, haben sich murine Modelle der Hornhautwunde als nützlich erwiesen, um unser Verständnis der Hornhautwundheilungsmechanismen unter normalen physiologischen Bedingungen zu verbessern. Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung eines zentralen Hornhautepithelabriebs bei der Maus mit einem Trephin und einem stumpfen Golfschläger-Spud beschrieben. In diesem Modell wird ein kreisförmiges Trephin mit einem Durchmesser von 2 mm, zentriert über der Hornhaut, verwendet, um den Wundbereich abzugrenzen. Der Golfschläger-Spud wird mit Vorsicht verwendet, um das Epithel zu debriden und eine kreisförmige Wunde zu erzeugen, ohne die Hornhautepithel-Basalmembran zu beschädigen. Die resultierende Entzündungsreaktion verläuft als eine gut charakterisierte Kaskade von zellulären und molekularen Ereignissen, die für eine effiziente Wundheilung entscheidend sind. Dieses einfache Hornhautwundheilungsmodell ist hochgradig reproduzierbar und gut veröffentlicht und wird nun verwendet, um eine kompromittierte Hornhautwundheilung im Zusammenhang mit Krankheiten zu bewerten.

Introduction

Die Hornhaut ist das transparente vordere Drittel des Auges. Die Hornhaut erfüllt mehrere Funktionen, einschließlich des Schutzes der inneren Strukturen des Auges und der Bildung einer strukturellen Barriere, die das Auge vor Infektionen schützt1. Noch wichtiger ist, dass die Hornhaut für das Sehen entscheidend ist und etwa zwei Drittel der Brechkraft des Auges liefert 2,3. Entscheidend für die Rolle der Hornhaut im Sehvermögen ist ihre Transparenz. Aufgrund ihrer äußeren Position ist die Hornhaut jedoch täglich einer Vielzahl von Verletzungen ausgesetzt, die zu einer Störung ihrer Barrierefunktion, einem Verlust der Transparenz und schließlich zur Erblindung führen können. Der Verlust der Transparenz der Hornhaut ist weltweit eine der Hauptursachen für Sehstörungen 4,5. Hornhautabschürfungen sind ein häufiger Grund für Besuche in der Notaufnahme (ER) und machen die Hälfte der augenbezogenen Fälle aus, die in der Notaufnahme6 vorgestellt wurden. Es wird geschätzt, dass in den Vereinigten Staaten jährlich über 1 Million Menschen an Augenverletzungen leiden7. Eine effiziente Hornhautwundheilung als Reaktion auf diese Verletzungen ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Hornhauthomöostase und die Erhaltung ihrer Transparenz und Brechungsfähigkeiten. Bei kompromittierter Hornhautwundheilung wird die Hornhaut anfällig für Infektionen, Ulzerationen und Narbenbildung 8,9. Auch die zunehmende Beliebtheit von refraktiven Operationen stellt eine einzigartige traumatische Herausforderung an die Hornhaut10 dar. Angesichts der grundlegenden Bedeutung der Hornhautwundheilung für die Erhaltung der Transparenz und des Sehvermögens der Hornhaut ist ein besseres Verständnis des normalen Hornhautwundheilungsprozesses eine Voraussetzung für das Verständnis der mit Infektionen und Krankheiten verbundenen beeinträchtigten Hornhautwundheilung.

Zu diesem Zweck wurden mehrere Tiermodelle der Hornhautwundheilung entwickelt 11,12,13,14,15. Murine Modelle der Hornhautwundheilung haben sich als nützlich erwiesen, um unser Verständnis der Hornhautwundheilungsmechanismen unter normalen physiologischen Bedingungen zu verbessern. Verschiedene Arten von Hornhautwunden wurden bei der Untersuchung der Hornhautwundheilung eingesetzt, die jeweils für die Untersuchung verschiedener Aspekte des Wundheilungsprozesses geeignet sind. Die häufigsten Arten von Wundmodellen, die in Hornhautwundheilungsstudien verwendet werden, sind die mechanischen und chemischen Wundmodelle. Chemische Hornhautwunden, die meist die Entstehung von alkalischen Verbrennungen an der Hornhaut beinhalten, sind nützlich für die Untersuchung von Hornhautgeschwüren, Trübung und Neovaskularisation13. Mechanische Hornhautwunden betreffen Debridement (Abrieb) Wunden und Keratektomiewunden14,15,16. Eine intakte oder gebrochene Hornhautepithel-Basalmembran definiert Debridement- bzw. Keratektomie-Wunden. Bei Debridementwunden bleibt die epitheliale Basalmembran intakt, während bei Keratektomiewunden die Basalmembran mit Penetration meist in das vordere Stroma durchbrochen wird. Debridement-Wunden sind am nützlichsten für die Untersuchung der Re-Epithelisierung, der Epithelzellproliferation, der Immunantwort und der Nervenregeneration nach Hornhautwunden. Keratektomie-Wunden hingegen sind am nützlichsten für die Untersuchung der Hornhautnarben14,15.

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer zentralen Hornhautepithelabriebwicklung in der Maus mit einem Trephin und einem stumpfen Golfschläger-Spud beschrieben. Dieses einfache Hornhautwundheilungsmodell ist hochgradig reproduzierbar und gut publiziert und wird nun verwendet, um eine kompromittierte Hornhautwundheilung im Zusammenhang mit Krankheit17 zu bewerten.

Protocol

Alle Tierprotokolle wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees an der University of Houston und dem Baylor College of Medicine genehmigt. Die in der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) zur Verwendung von Tieren in der Seh- und Augenforschung dargelegten Richtlinien wurden bei der Handhabung und Verwendung der Mäuse befolgt. 1. Vorbereitung Herstellung von Fluoresceinlösung Bereiten Sie 1% ige Fluoresce…

Representative Results

Abbildung 3 zeigt eine Transmissionselektronenmikroskopaufnahme einer Hornhautwunde, die mit dem stumpfen Golfschläger-Spud erzeugt wurde und zeigt, dass die epitheliale Basalmembran nach einer Verletzung tatsächlich intakt ist. Abbildung 3: Die epitheliale Basalmembran bleibt nach dem Hornhautabrieb intakt. …

Discussion

Der Zweck dieses Methodenpapiers war es, ein Protokoll zur Herstellung einer zentralen Hornhautepithelabriebwunde in der Maus mit einem Trephin und einem stumpfen Golfschläger-Spud zu beschreiben. Dieses murine Modell wurde verwendet, um Hornhautentzündungen und ihren Beitrag zur Wundheilung zu untersuchen. Diese Art von Modell kann verwendet werden, um Hornhautwundheilungsmechanismen unter normalen physiologischen Bedingungen und bei Pathologien 17,28,29,41,42 zu untersuchen.<sup cla…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Finanzierung: Gefördert durch: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. und R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) und Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health oder Sigma Xi dar.

Materials

Anti-CD31 antibody BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 antibody BD Bioscience, Pharmingen 553847
Anti-Ly6G antibody BD Bioscience, Pharmingen 551459
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher scientific B14
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664
DAPI Sigma Aldrich D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope GE Life Sciences
Dissecting microscope Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale) Fisher Scientific
Ethanol ThermoFisher scientific T038181000CS
Golf-club spud Stephens instruments S2-1135
Iris curve scissors Fisher Scientific 31212
Isoflurane Patterson veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson veterinary 07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS) ThermoFisher scientific AM9624
Sodium fluorescein salt Sigma Aldrich 46970
Surgical blade (scapel blade) Fine Science tools 10022-00
Trephine Integra Miltex 33-31
TritonX -100 Fisher Scientific 50-295-34
Forcep Fine Science tools 11923-13
Xylazine Patterson veterinary 07-808-1947
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Riferimenti

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Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. J. Vis. Exp. (178), e63112, doi:10.3791/63112 (2021).
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