JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Een epitheel schuurmodel voor het bestuderen van corneawondgenezing

Published: December 29, 2021
doi:
10.3791/63112
, , , ,
1College of Optometry,University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center,Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID),Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Summary

Hier wordt een protocol beschreven voor het maken van een centrale hoornvliesepitheelslijtagewond in de muis met behulp van een trephine en een stompe golfclubspud. Dit hoornvlies wondgenezingsmodel is zeer reproduceerbaar en wordt nu gebruikt om gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing in de context van ziekten te evalueren.

Abstract

Het hoornvlies is van cruciaal belang voor het gezichtsvermogen en is goed voor ongeveer tweederde van de brekingskracht van het oog. Cruciaal voor de rol van het hoornvlies in het zicht is de transparantie ervan. Vanwege de externe positie is het hoornvlies echter zeer gevoelig voor een breed scala aan verwondingen die kunnen leiden tot het verlies van corneatransparantie en uiteindelijke blindheid. Efficiënte hoornvlieswondgenezing als reactie op deze verwondingen is cruciaal voor het behoud van corneahomeostase en het behoud van corneatransparantie en brekingsvermogen. In geval van gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing wordt het hoornvlies kwetsbaar voor infecties, ulceraties en littekens. Gezien het fundamentele belang van cornea wondgenezing voor het behoud van corneatransparantie en visie, is een beter begrip van het normale hoornvlieswondgenezingsproces een voorwaarde voor het begrijpen van verminderde hoornvlieswondgenezing geassocieerd met infectie en ziekte. In de richting van dit doel zijn murinemodellen van hoornvlieswonden nuttig gebleken bij het bevorderen van ons begrip van de genezingsmechanismen van de hoornvlieswond die onder normale fysiologische omstandigheden werken. Hier wordt een protocol beschreven voor het creëren van een centrale cornea-epitheliale slijtage bij muizen met behulp van een trephine en een stompe golfclubspud. In dit model wordt een cirkelvormige trephine met een diameter van 2 mm, gecentreerd over het hoornvlies, gebruikt om het wondgebied af te bakenen. De golfclubspud wordt met zorg gebruikt om het epitheel te debriden en een cirkelvormige wond te creëren zonder het hoornvliesepitheelkelmembraan te beschadigen. De resulterende ontstekingsreactie verloopt als een goed gekarakteriseerde cascade van cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die van cruciaal belang zijn voor efficiënte wondgenezing. Dit eenvoudige hoornvlies wondgenezingsmodel is zeer reproduceerbaar en goed gepubliceerd en wordt nu gebruikt om gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing in de context van ziekte te evalueren.

Introduction

Het hoornvlies is het transparante voorste een derde van het oog. Het hoornvlies heeft verschillende functies, waaronder het beschermen van de binnenste structuren van het oog en het vormen van een structurele barrière die het oog beschermt tegen infecties1. Wat nog belangrijker is, het hoornvlies is van cruciaal belang voor het gezichtsvermogen en levert ongeveer tweederde van de brekingskracht van het oog 2,3. Cruciaal voor de rol van het hoornvlies in het zicht is de transparantie ervan. Vanwege de naar buiten gerichte positie wordt het hoornvlies echter dagelijks blootgesteld aan een breed scala aan verwondingen die kunnen leiden tot verstoring van de barrièrefunctie, verlies van transparantie en uiteindelijke blindheid. Verlies van hoornvliestransparantie is wereldwijd een belangrijke oorzaak van slechtziendheid 4,5. Cornea-schaafwonden zijn een veel voorkomende reden voor bezoeken aan de eerste hulp (ER), goed voor de helft van de ooggerelateerde gevallen die op de ER6 worden gepresenteerd. Meer dan 1 miljoen mensen lijden naar schatting jaarlijks aan ooggerelateerd letsel in de Verenigde Staten7. Efficiënte hoornvlieswondgenezing als reactie op deze verwondingen is cruciaal voor het behoud van corneahomeostase en het behoud van de transparantie en refractieve mogelijkheden. In geval van gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing wordt het hoornvlies kwetsbaar voor infecties, ulceraties en littekens 8,9. Ook de toenemende populariteit van refractieve operaties plaatst een unieke traumatische uitdaging op het hoornvlies10. Gezien het fundamentele belang van cornea wondgenezing voor het behoud van corneatransparantie en visie, is een beter begrip van het normale hoornvlieswondgenezingsproces een voorwaarde voor het begrijpen van verminderde hoornvlieswondgenezing geassocieerd met infectie en ziekte.

Daartoe zijn verschillende diermodellen van hoornvlieswondgenezing ontwikkeld 11,12,13,14,15. Murine-modellen van hoornvlieswondgenezing zijn nuttig gebleken bij het bevorderen van ons begrip van de hoornvlieswondgenezingsmechanismen die onder normale fysiologische omstandigheden werken. Verschillende soorten hoornvlieswonden zijn gebruikt bij het bestuderen van hoornvlieswondgenezing, elk geschikt voor het onderzoeken van verschillende aspecten van het wondgenezingsproces. De meest voorkomende soorten wondmodellen die worden gebruikt in hoornvlieswondgenezingsstudies zijn de mechanische en chemische wondmodellen. Chemische hoornvlieswonden, meestal met betrekking tot het creëren van alkalische brandwonden op het hoornvlies, zijn nuttig voor het bestuderen van hoornvlieszweren, opacificatie en neovascularisatie13. Mechanische hoornvlieswonden omvatten debridement (slijtage) wonden en keratectomiewonden 14,15,16. Een intact of gebroken cornea-epitheelkelkelmembraan definieert respectievelijk debridement- en keratectomiewonden. Bij debridementwonden blijft het epitheliale keldermembraan intact, terwijl bij keratectomiewonden het keldermembraan wordt doorbroken met penetratie meestal in het voorste stroma. Debridementwonden zijn het meest nuttig voor het bestuderen van re-epithelisatie, epitheelcelproliferatie, immuunrespons en zenuwregeneratie na hoornvlieswonden. Keratectomie wonden, aan de andere kant, zijn het meest nuttig voor het bestuderen van cornea littekens14,15.

Hier wordt een protocol beschreven voor het maken van een centrale hoornvliesepitheelslijtagewond in de muis met behulp van een trephine en een stompe golfclubspud. Dit eenvoudige hoornvlies wondgenezingsmodel is zeer reproduceerbaar en goed gepubliceerd en wordt nu gebruikt om gecompromitteerde hoornvlieswondgenezing te evalueren in de context van ziekte17.

Protocol

Alle dierprotocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van de Universiteit van Houston en Baylor College of Medicine. De richtlijnen die zijn uiteengezet in de verklaring van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) over het gebruik van dieren in visie en oogheelkundig onderzoek werden gevolgd bij het hanteren en gebruiken van de muizen. 1. Voorbereiding Bereiding van fluoresceïne-oplossing Bereid 1…

Representative Results

Figuur 3 toont een transmissie-elektronenmicrograaf van een hoornvlieswond gemaakt met de stompe golfclubspud, waaruit blijkt dat het epitheliale keldermembraan inderdaad intact is na letsel. Figuur 3: Epitheliaal keldermembraan blijft intact na cornea-abrasie. Transmissie-elektronenmicrograaf van een…

Discussion

Het doel van dit methodedocument was om een protocol te beschrijven voor het maken van een centrale cornea-epitheliale schuurwond in de muis met behulp van een trephine en een stompe golfclubspud. Dit muizenmodel is gebruikt om hoornvliesontsteking en de bijdrage ervan aan wondgenezing te bestuderen. Dit type model kan worden gebruikt om hoornvlieswondgenezingsmechanismen te bestuderen onder normale fysiologische omstandigheden en bij pathologieën 17,28,29,41,42.</sup…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financiering: Ondersteund door: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S., en R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.), en Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet de officiële standpunten van de National Institutes of Health, of Sigma Xi.

Materials

Anti-CD31 antibody BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 antibody BD Bioscience, Pharmingen 553847
Anti-Ly6G antibody BD Bioscience, Pharmingen 551459
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher scientific B14
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664
DAPI Sigma Aldrich D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope GE Life Sciences
Dissecting microscope Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale) Fisher Scientific
Ethanol ThermoFisher scientific T038181000CS
Golf-club spud Stephens instruments S2-1135
Iris curve scissors Fisher Scientific 31212
Isoflurane Patterson veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson veterinary 07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS) ThermoFisher scientific AM9624
Sodium fluorescein salt Sigma Aldrich 46970
Surgical blade (scapel blade) Fine Science tools 10022-00
Trephine Integra Miltex 33-31
TritonX -100 Fisher Scientific 50-295-34
Forcep Fine Science tools 11923-13
Xylazine Patterson veterinary 07-808-1947
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Meek, K. M., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 1-16 (2015).
  3. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
  4. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  5. Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: A global problem. Clinical & Experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
  6. McGwin, G., Owsley, C. Incidence of emergency department-treated eye injury in the United States. Archives of Ophthalmology. 123 (5), 662-666 (2005).
  7. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  8. Wilson, S. L., Haj, A. J. E., Yang, Y. Control of scar tissue formation in the cornea: Strategies in clinical and corneal tissue engineering. Journal of Functional Biomaterials. 3 (3), 642 (2012).
  9. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: A review article. Medical Hypothesis, Discovery and Innovation in Ophthalmology. 8 (3), 163-176 (2019).
  10. Netto, M., et al. Wound healing in the cornea: a review of refractive surgery complications and new prospects for therapy. Cornea. 24 (5), 509-522 (2005).
  11. Friedenwald, J. S., Buschke, W. Some factors concerned in the mitotic and wound-healing activities of the corneal epithelium. Transactions of the American Ophthalmological Society. 42, 371-383 (1944).
  12. Xu, K., Yu, F. -. S. X. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  13. Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  14. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 integrin promotes corneal wound healing. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (11), 8505-8513 (2011).
  15. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of thrombospondin-1 in repair of penetrating corneal wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (9), 6262-6268 (2013).
  16. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  17. Hargrave, A., et al. Corneal dysfunction precedes the onset of hyperglycemia in a mouse model of diet-induced obesity. PLoS ONE. 15, 0238750 (2020).
  18. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
  19. Bodner, L., Dayan, D. Effect of parotid submandibular and sublingual saliva on wound healing in rats. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 100 (4), 887-890 (1991).
  20. Abbasian, B., Azizi, S., Esmaeili, A. Effects of rat’s licking behavior on cutaneous wound healing. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 13 (1), 242-247 (2010).
  21. DeLisser, H. M., et al. Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).
  22. Piali, L., et al. CD31/PECAM-1 is a ligand for alpha v beta 3 integrin involved in adhesion of leukocytes to endothelium. The Journal of Cell Biology. 130 (2), 451-460 (1995).
  23. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. The Journal of Immunology. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  24. Fleming, T. J., Malek, T. R. Multiple glycosylphosphatidylinositol-anchored Ly-6 molecules and transmembrane Ly-6E mediate inhibition of IL-2 production. The Journal of Immunology. 153 (5), 1955-1962 (1994).
  25. Phillips, D. R., Charo, I. F., Scarborough, R. M. GPIIb-IIIa: the responsive integrin. Cell. 65 (3), 359-362 (1991).
  26. Nieswandt, B., et al. Acute systemic reaction and lung alterations induced by an antiplatelet integrin gpIIb/IIIa antibody in mice. Blood. 94 (2), 684-693 (1999).
  27. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  28. Liu, Q., Smith, C. W., Zhang, W., Burns, A. R., Li, Z. NK cells modulate the inflammatory response to corneal epithelial abrasion and thereby support wound healing. American Journal of Pathology. 181 (2), 452-462 (2012).
  29. Gao, Y., et al. NK cells are necessary for recovery of corneal CD11c+ dendritic cells after epithelial abrasion injury. Journal of Leukocyte Biology. 94 (2), 343-351 (2013).
  30. Xiao, C., et al. Acute tobacco smoke exposure exacerbates the inflammatory response to corneal wounds in mice via the sympathetic nervous system. Communications Biology. 2, 33 (2019).
  31. Wang, H., et al. Epothilone B speeds corneal nerve regrowth and functional recovery through microtubule stabilization and increased nerve beading. Scientific Reports. 8 (1), 2647 (2018).
  32. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Lymphocyte function-associated Antigen-1-dependent inhibition of corneal wound healing. Cell Injury. 169, 1590-1600 (2006).
  33. Wu, M., et al. The neuroregenerative effects of topical decorin on the injured mouse cornea. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 1-14 (2020).
  34. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99 (1), 665-706 (2019).
  35. Rennard, S. I. Inflammation and repair processes in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (5), 12-16 (1999).
  36. Landén, N. X., Li, D., Ståhle, M. Transition from inflammation to proliferation: a critical step during wound healing. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (20), 3861-3885 (2016).
  37. Li, Z., Rumbaut, R. E., Burns, A. R., Smith, C. W. Platelet response to corneal abrasion is necessary for acute inflammation and efficient re-epithelialteation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47, 4794-4802 (2006).
  38. Lam, F. W., Burns, A. R., Smith, C. W., Rumbaut, R. E. Platelets enhance neutrophil transendothelial migration via P-selectin glycoprotein ligand-1. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 300 (2), 468-475 (2011).
  39. La Cruz, A. D., et al. Platelet and erythrocyte extravasation across inflamed corneal venules depend on CD18, neutrophils, and mast cell degranulation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7360 (2021).
  40. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Two waves of neutrophil emigration in response to corneal epithelial abrasion: Distinct adhesion molecule requirements. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (5), 1947-1955 (2006).
  41. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF Are Necessary for Efficient Corneal Nerve Regeneration. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  42. Xue, Y., et al. Modulation of circadian rhythms affects corneal epithelium renewal and repair in mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (3), 1865-1874 (2017).
  43. Zhang, W., Magadi, S., Li, Z., Smith, C. W., Burns, A. R. IL-20 promotes epithelial healing of the injured mouse cornea. Experimental Eye Research. 154, 22-29 (2017).
  44. Li, Z., Burns, A. R., Miller, S. B., Smith, C. W. CCL20, γδ T cells, and IL-22 in corneal epithelial healing. FASEB Journal. 25 (8), 2659-2668 (2011).
  45. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF are necessary for efficient corneal nerve regeneration. American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  46. Reins, R. Y., Hanlon, S. D., Magadi, S., McDermott, A. M. Effects of topically applied Vitamin D during corneal wound healing. PLoS ONE. 11 (4), 0152889 (2016).
  47. Gagen, D., et al. ICAM-1 mediates surface contact between neutrophils and keratocytes following corneal epithelial abrasion in the mouse. Experimental Eye Research. 91 (5), 676-684 (2010).
  48. Li, Z., Rivera, C. A., Burns, A. R., Smith, C. W. Hindlimb unloading depresses corneal epithelial wound healing in mice. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 641-647 (2004).
  49. Byeseda, S. E., et al. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of γδ T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
  50. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  51. Petrescu, M. S., et al. Neutrophil interactions with keratocytes during corneal epithelial wound healing: A role for CD18 integrins. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (11), 5023-5029 (2007).
  52. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
  53. Pal-Ghosh, S., et al. Cytokine deposition alters leukocyte morphology and initial recruitment of monocytes and γδT cells after corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2757-2765 (2014).
  54. Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  55. Kato, T., Chang, J. H., Azar, D. T. Expression of type XVIII collagen during healing of corneal incisions and keratectomy wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 78-85 (2003).
  56. Kure, T., et al. Corneal neovascularization after excimer keratectomy wounds in matrilysin-deficient mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 137-144 (2003).
  57. Lin, A., et al. Bacterial keratitis preferred practice pattern. Ophthalmology. 126 (1), 1-55 (2019).
  58. Cable, E. J., Onishi, K. G., Prendergast, B. J. Circadian rhythms accelerate wound healing in female Siberian hamsters. Physiology and Behavior. 171, 165-174 (2017).
  59. Lyons, A. B., Moy, L., Moy, R., Tung, R. Circadian rhythm and the skin: A review of the literature. Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 12 (9), 42-45 (2019).
  60. Westman, J., Grinstein, S., Marques, P. E. Phagocytosis of Necrotic Debris at Sites of Injury and Inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3030 (2020).
  61. Gaudry, M., et al. Intracellular pool of vascular endothelial growth factor in human neutrophils. Blood. 90 (10), 4153-4161 (1997).
  62. Pan, Z., et al. Vascular endothelial growth factor promotes anatomical and functional recovery of injured peripheral nerves in the avascular cornea. FASEB Journal. 7, 2756-2767 (2013).
  63. Di, G., et al. VEGF-B promotes recovery of corneal innervations and trophic functions in diabetic mice. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  64. Thomas, M. R., Storey, R. F. The role of platelets in inflammation. Thrombosis and Haemostasis. 114 (3), 449-458 (2015).
  65. Margraf, A., Zarbock, A. Platelets in inflammation and resolution. The Journal of Immunology. 203 (9), 2357-2367 (2019).

Tags

Epithelial AbrasionCorneal Wound HealingCorneal InflammationCorneal Wounding ModelFluorescein StainingWound ClosureRe-epithelializationImage Analysis
check_url/it/63112?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. J. Vis. Exp. (178), e63112, doi:10.3791/63112 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image