Summary

ניתוח ציטומטרי של זרימה של פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם ונגזרותיהם העצביות והגליליות

Published: November 08, 2021
doi:

Summary

מחקר זה מדווח על גישה חדשנית למדידת פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאליים מרובים המבוססים על ציטומטריה של זרימה והכתמה כפולה עם שני מדווחים פלואורסצנטיים או נוגדנים כדי לזהות שינויים בנפח המיטוכונדריה, פוטנציאל קרום המיטוכונדריה, רמת מיני חמצן תגובתי, הרכב שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית ודנ”א מיטוכונדריאלי.

Abstract

מיטוכונדריה חשובים בפתופיזיולוגיה של מחלות נוירודגנרטיביות רבות. שינויים בנפח המיטוכונדריה, בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (MMP), בייצור מיטוכונדריאלי של מיני חמצן תגובתי (ROS) ובמספר העתק הדנ”א המיטוכונדריאלי (mtDNA) הם לעתים קרובות מאפיינים של תהליכים אלה. דו”ח זה מפרט גישה חדשנית המבוססת על ציטומטריה של זרימה למדידת פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בסוגי תאים שונים, כולל תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs) ותאי עצב וגליה שמקורם ב-iPSC. אסטרטגיה מבוססת זרימה זו משתמשת בתאים חיים למדידת נפח המיטוכונדריה, MMP ורמות ROS, כמו גם בתאים קבועים כדי להעריך רכיבים של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית (MRC) וחלבונים הקשורים ל-mtDNA כגון גורם שעתוק מיטוכונדריאלי A (TFAM).

על ידי צביעה משותפת עם כתבים פלואורסצנטיים, כולל MitoTracker Green (MTG), טטרה-מתילרהודאמין אתיל אסטר (TMRE) ו-MitoSox Red, ניתן לכמת שינויים בנפח המיטוכונדריה, ב-MMP וב-ROS המיטוכונדריאלי וקשורים לתכולת המיטוכונדריה. צביעה כפולה עם נוגדנים כנגד תת-יחידות מורכבות של MRC וטרנסלוקאז של קרום מיטוכונדריאלי חיצוני 20 (TOMM20) מאפשרת הערכה של ביטוי תת-יחידות MRC. מכיוון שכמות ה-TFAM פרופורציונלית למספר העותקים של mtDNA, המדידה של TFAM ל-TOMM20 נותנת מדידה עקיפה של mtDNA לכל נפח מיטוכונדריאלי. הפרוטוקול כולו יכול להתבצע תוך 2-3 שעות. חשוב לציין שפרוטוקולים אלה מאפשרים מדידה של פרמטרים מיטוכונדריאליים, הן ברמה הכוללת והן ברמה הספציפית לכל נפח מיטוכונדריאלי, באמצעות ציטומטריה של זרימה.

Introduction

מיטוכונדריה הם אברונים חיוניים הנמצאים כמעט בכל התאים האאוקריוטים. המיטוכונדריה אחראים על אספקת האנרגיה על ידי ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) באמצעות זרחון חמצוני ומשמשים כמתווכים מטבוליים לביוסינתזה ולחילוף חומרים. המיטוכונדריה מעורבת עמוקות בתהליכים תאיים חשובים רבים אחרים, כגון ייצור ROS, מוות של תאים וויסות תוך-תאישל Ca 2+. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה נקשר למחלות נוירודגנרטיביות שונות, כולל מחלת פרקינסון (PD), מחלת אלצהיימר (AD), מחלת הנטינגטון (HD), אטקסיה של פרידריך (FRDA) וטרשת אמיוטרופית צידית (ALS)1. גם תפקוד לקוי מוגבר של המיטוכונדריה וחריגה ב-mtDNA נחשבים כתורמים להזדקנות האנושית 2,3.

סוגים שונים של תפקוד לקוי של המיטוכונדריה מתרחשים במחלות נוירודגנרטיביות, ושינויים בנפח המיטוכונדריה, דה-פולריזציה של MMP, ייצור ROS ושינויים במספר עותק mtDNA נפוצים 4,5,6,7. לכן, ליכולת למדוד תפקודים מיטוכונדריאליים אלה ואחרים יש חשיבות רבה כאשר חוקרים את מנגנוני המחלה ובודקים גורמים טיפוליים פוטנציאליים. יתר על כן, לאור היעדרם של מודלים חייתיים המשכפלים נאמנה מחלות נוירודגנרטיביות אנושיות, הקמת מערכות מודל in vitro מתאימות המשחזרות את המחלה האנושית בתאי המוח היא צעד חשוב לקראת הבנה טובה יותר של מחלות אלה ופיתוח טיפולים חדשים 2,3,8,9.

ניתן להשתמש בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים כדי ליצור תאי מוח שונים, כולל תאים עצביים ולא עצביים (כלומר, תאי גליה), ונזק מיטוכונדריאלי הקשור למחלות נוירודגנרטיביות נמצא בשני סוגי התאים 3,10,11,12,13. שיטות מתאימות להתמיינות iPSC לשושלות עצביות וגליאליות זמינות14,15,16. תאים אלה מספקים פלטפורמה ייחודית לבני אדם/מטופלים למידול מחלות במבחנה ולבדיקת תרופות. יתר על כן, מכיוון שאלה נגזרים מחולים, נוירונים שמקורם ב- iPSC ותאי גליה מספקים מודלים של מחלות המשקפים את מה שקורה בבני אדם בצורה מדויקת יותר.

נכון להיום, קיימות מעט שיטות נוחות ואמינות למדידת פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאליים מרובים בתאי גזע פלוריפוטנטיים, במיוחד תאי עצב חיים ותאי גלייה. השימוש בציטומטריה של זרימה מספק למדען כלי רב עוצמה למדידת פרמטרים ביולוגיים, כולל תפקוד מיטוכונדריאלי, בתאים בודדים. פרוטוקול זה מספק פרטים ליצירת סוגים שונים של תאי מוח, כולל תאי גזע עצביים (תאי גזע עצביים), נוירונים ואסטרוציטים גליאליים מתאי גזע פלוריפוטנטיים, כמו גם גישות חדשניות המבוססות על ציטומטריה של זרימה למדידת פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בסוגי תאים שונים, כולל iPSCs ותאי עצב וגליה שמקורם ב-iPSC. הפרוטוקול מספק גם אסטרטגיית צביעה משותפת לשימוש בציטומטריה של זרימה למדידת נפח המיטוכונדריה, MMP, רמת ROS מיטוכונדריאלית, מתחמי MRC ו- TFAM. על ידי שילוב מדדים של נפח או מסה מיטוכונדריאלית, פרוטוקולים אלה מאפשרים גם מדידה של הרמה הכוללת והרמה הספציפית לכל יחידת מיטוכונדריה.

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים ובטבלה המשלימה S1 לקבלת מתכונים של כל המדיות והפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה. 1. התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) אנושיים לתאי NCS, נוירונים דופמינרגיים (DA) ואסטרוציטים הכינו צלחות מצופות מטריצה.להפשיר בקבוקו?…

Representative Results

תיאור סכמטי של שיטת ההתמיינות והאסטרטגיות הציטומטריות של הזרימה מוצג באיור 3. תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מובחנים לרוזטות עצביות ואז מורמים לתרבית תרחיף לצורך התמיינות לתחומים עצביים. התחומים העצביים מובחנים עוד יותר ומבשילים לנוירוני DA. הכדורים העצביים מפורקים לתאים…

Discussion

להלן פרוטוקולים ליצירת נוירונים ואסטרוציטים שמקורם ב-iPSC ולהערכת היבטים רבים של תפקוד המיטוכונדריה באמצעות ציטומטריה של זרימה. פרוטוקולים אלה מאפשרים המרה יעילה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים הן לתאי עצב והן לאסטרוציטים גליים, ואפיון מפורט של תפקוד המיטוכונדריה, בעיקר בתאים חיים. הפרו…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים בחביבות למרכז ההדמיה המולקולרית ולמתקן הליבה של ציטומטריה של זרימה באוניברסיטת ברגן בנורווגיה. עבודה זו נתמכה על ידי מימון ממועצת המחקר הנורבגית (מספר מענק: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat ומועצת המלגות של סין (מספר הפרויקט: 201906220275).

Materials

anti-Oct4 Abcam ab19857, RRID:AB_445175 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-SSEA4 Abcam ab16287, RRID:AB_778073 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Sox2 Abcam ab97959, RRID:AB_2341193 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Pax6 Abcam ab5790, RRID:AB_305110 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Nestin Santa Cruz Biotechnology sc-23927, RRID:AB_627994 Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-GFAP Abcam ab4674, RRID:AB_304558 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-S100β  conjugated with Alexa Fluor 488 Abcam ab196442, RRID:AB_2722596 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution;
anti-TH Abcam ab75875, RRID:AB_1310786 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Tuj 1 Abcam ab78078, RRID:AB_2256751 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Synaptophysin Abcam ab32127, RRID:AB_2286949 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-PSD-95 Abcam ab2723, RRID:AB_303248 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488 Abcam ab198308 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488 Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-17764 RRID:AB_628381 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-NDUFB10 Abcam ab196019 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-SDHA Abcam ab137040 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-COX IV Abcam ab14744, RRID:AB_301443 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use  Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control.
Activin A PeproTech 120-14E Astrocyte differentiation medium ingredient
ABM Basal Medium Lonza CC-3187 Basal medium for astrocyte culture
AGM SingleQuots Supplement Pack Lonza CC-4123 Supplement for astrocyte culture
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240062 CDM ingredient
Advanced DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 12634010 Basal medium for dilute Geltrex
Bovine Serum Albumin Europa Bioproducts EQBAH62-1000 Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient
BDNF PeproTech 450-02 DA neurons medium ingredient
B-27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044 Astrocyte differentiation medium ingredient
BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer BD Biosciences, USA
Chemically Defined Lipid Concentrate Thermo Fisher Scientific 11905031 CDM ingredient
Collagenase IV Thermo Fisher Scientific 17104019 Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G Leica Microsystems, Germany
Corning non-treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430589 Suspension culture
DPBS Thermo Fisher Scientific 14190250 Used for a variety of cell culture wash
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 10565018 Astrocyte differentiation basal Medium
EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal Medium Thermo Fisher Scientific A1516901 Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50X) Thermo Fisher Scientific A1517101 Supplement for iPSC culture
EGF Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0314 Supplement for NSC culture
FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0024 Supplement for NSC culture
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12103C Medium ingredient
FGF-basic PeproTech 100-18B Astrocyte differentiation medium ingredient
FCCP Abcam ab120081 Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
Fluid aspiration system BVC control Vacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16% Thermo Fisher Scientific 28908 Cell fixation
Geltrex Thermo Fisher Scientific A1413302 Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 Supplement for NSC culture
GDNF Peprotech 450-10 DA neurons medium ingredient
Glycine Sigma-Aldrich G8898 Used for blocking buffer
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher Scientific 31765027 Basal medium for CDM
Heregulin beta-1 human Sigma-Aldrich SRP3055 Astrocyte differentiation medium ingredient
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H1399 Stain the nuclei for confocal image
Heracell 150i CO2 Incubators Fisher Scientific, USA
IMDM Thermo Fisher Scientific 21980032 Basal medium for CDM
Insulin Roche 1376497 CDM ingredient
InSolution AMPK Inhibitor Sigma-Aldrich 171261 Neural induction medium ingredient
Insulin-like Growth Factor-I human Sigma-Aldrich I3769 Astrocyte differentiation medium ingredient
KnockOut DMEM/F-12 medium Thermo Fisher Scientific 12660012 Basal medium for NSC culture
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Leica TCS SP8 STED confocal microscope Leica Microsystems, Germany
Monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145 CDM ingredient
MitoTracker Green FM Thermo Fisher Scientific M7514 Used for mitochondrial volume indicator
MitoSox Red Thermo Fisher Scientific M36008 Used for mitochondrial ROS indicator
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A7250 Neural induction medium ingredient
N-2 Supplement Thermo Fisher Scientific 17502048 Astrocyte differentiation medium ingredient
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific PCN5000 Used for blocking buffer
Orbital shakers – SSM1 Stuart Equipment, UK
Poly-L-ornithine solution Sigma-Aldrich P4957 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P7405 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Purmorphamine STEMCELL Technologies 72204 Promotes DA neuron differentiation
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36930 Mounting the coverslip for confocal image
PBS 1x Thermo Fisher Scientific 18912014 Used for a variety of wash
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein R&D Systems 423-F8-025/CF Promotes DA neuron differentiation
SB 431542 Tocris Bioscience TB1614-GMP Neural Induction Medium ingredient
StemPro Neural Supplement Thermo Fisher Scientific A10508-01 Supplement for NSCs culture
TrypLE Express Enzyme Thermo Fisher Scientific 12604013 Cell dissociation reagent
Transferrin Roche 652202 CDM ingredient
TRITON X-100 VWR International 9002-93-1 Used for cells permeabilization in immunostaining assays
TMRE Abcam ab113852 Used for mitochondrial membrane potential staining
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments Grant Instruments, USA

Riferimenti

  1. Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
  2. Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304 (2021).
  3. Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146 (2020).
  4. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics–fusion, fission, movement, and mitophagy–in neurodegenerative diseases. Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).
  5. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  6. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24 (8), 1583 (2019).
  7. Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311 (2019).
  8. Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Schöler, H. R. Investigating human disease using stem cell models. Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).
  9. Patani, R. Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine. Nature Medicine. 26 (4), 449 (2020).
  10. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. , 337 (2021).
  11. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  12. Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington’s disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17 (2012).
  13. Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Liu, Q., et al. Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).
  15. Hong, Y. J., Do, J. T. Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400 (2019).
  16. Lundin, A., et al. Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models. Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).
  17. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536 (2021).
  18. Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. Efficacy of MitoTracker Green™ and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues. Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).
  19. Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs. Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).
  20. Buckman, J. F., et al. MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants. Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).
  21. Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).

Play Video

Citazione di questo articolo
Liang, K. X., Chen, A., Kristiansen, C. K., Bindoff, L. A. Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives. J. Vis. Exp. (177), e63116, doi:10.3791/63116 (2021).

View Video