Summary

Durchflusszytometrische Analyse multipler mitochondrialer Parameter in humaninduzierten pluripotenten Stammzellen und deren neuronalen und glialen Derivaten

Published: November 08, 2021
doi:

Summary

Diese Studie berichtet über einen neuartigen Ansatz zur Messung mehrerer mitochondrialer Funktionsparameter basierend auf Durchflusszytometrie und Doppelfärbung mit zwei fluoreszierenden Reportern oder Antikörpern, um Veränderungen des mitochondrialen Volumens, des mitochondrialen Membranpotentials, des reaktiven Sauerstoffgehalts, der mitochondrialen Atmungskettenzusammensetzung und der mitochondrialen DNA zu erkennen.

Abstract

Mitochondrien sind wichtig für die Pathophysiologie vieler neurodegenerativer Erkrankungen. Änderungen des mitochondrialen Volumens, des mitochondrialen Membranpotentials (MMP), der mitochondrialen Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und der Kopienzahl der mitochondrialen DNA (mtDNA) sind häufig Merkmale dieser Prozesse. Dieser Bericht beschreibt einen neuartigen, auf Durchflusszytometrie basierenden Ansatz zur Messung mehrerer mitochondrialer Parameter in verschiedenen Zelltypen, einschließlich humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) und iPSC-abgeleiteter Neural- und Gliazellen. Diese flussbasierte Strategie verwendet lebende Zellen zur Messung des mitochondrialen Volumens, des MMP- und ROS-Spiegels sowie fixierte Zellen zur Schätzung von Komponenten der mitochondrialen Atmungskette (MRC) und mtDNA-assoziierte Proteine wie den mitochondrialen Transkriptionsfaktor A (TFAM).

Durch Co-Färbung mit fluoreszierenden Reportern, einschließlich MitoTracker Green (MTG), Tetramethylrhodaminethylester (TMRE) und MitoSox Red, können Veränderungen des mitochondrialen Volumens, des MMP und der mitochondrialen ROS quantifiziert und mit dem mitochondrialen Inhalt in Beziehung gesetzt werden. Die Doppelfärbung mit Antikörpern gegen MRC-Komplex-Untereinheiten und Translokase der äußeren Mitochondrienmembran 20 (TOMM20) ermöglicht die Beurteilung der MRC-Untereinheitsexpression. Da die Menge an TFAM proportional zur mtDNA-Kopienzahl ist, ergibt die Messung von TFAM pro TOMM20 eine indirekte Messung der mtDNA pro mitochondrialem Volumen. Das gesamte Protokoll kann innerhalb von 2-3 h durchgeführt werden. Wichtig ist, dass diese Protokolle die Messung mitochondrialer Parameter sowohl auf der Gesamtebene als auch auf der spezifischen Ebene pro mitochondrialem Volumen mittels Durchflusszytometrie ermöglichen.

Introduction

Mitochondrien sind essentielle Organellen, die in fast allen eukaryotischen Zellen vorhanden sind. Mitochondrien sind für die Energieversorgung verantwortlich, indem sie Adenosintriphosphat (ATP) durch oxidative Phosphorylierung produzieren und als metabolische Vermittler für Biosynthese und Stoffwechsel fungieren. Mitochondrien sind tief an vielen anderen wichtigen zellulären Prozessen beteiligt, wie ROS-Generierung, Zelltod und intrazellulärer Ca2+-Regulation. Mitochondriale Dysfunktion wurde mit verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter Parkinson-Krankheit (PD), Alzheimer-Krankheit (AD), Huntington-Krankheit (HD), Friedreich-Ataxie (FRDA) und amyotrophe Lateralsklerose (ALS)1. Es wird auch angenommen, dass eine erhöhte mitochondriale Dysfunktion und mtDNA-Anomalie zum menschlichen Altern beitragen 2,3.

Verschiedene Arten von mitochondrialer Dysfunktion treten bei neurodegenerativen Erkrankungen auf, und Veränderungen des mitochondrialen Volumens, der MMP-Depolarisation, der Produktion von ROS und Veränderungen der mtDNA-Kopienzahl sind häufig 4,5,6,7. Daher ist die Fähigkeit, diese und andere mitochondriale Funktionen zu messen, von großer Bedeutung, um Krankheitsmechanismen zu untersuchen und potenzielle Therapeutika zu testen. Darüber hinaus ist angesichts des Mangels an Tiermodellen, die menschliche neurodegenerative Erkrankungen originalgetreu nachbilden, die Etablierung geeigneter In-vitro-Modellsysteme, die die menschliche Krankheit in Gehirnzellen rekapitulieren, ein wichtiger Schritt zu einem besseren Verständnis dieser Krankheiten und zur Entwicklung neuer Therapien 2,3,8,9.

Humane iPS-Zellen können verwendet werden, um verschiedene Gehirnzellen zu erzeugen, einschließlich neuronaler und nicht-neuronaler Zellen (dh Gliazellen), und mitochondriale Schäden im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen wurden in beiden Zelltypengefunden 3,10,11,12,13. Geeignete Methoden zur iPSC-Differenzierung in neuronale und gliale Linien stehen zur Verfügung14,15,16. Diese Zellen bieten eine einzigartige Mensch-Patienten-Plattform für die In-vitro-Krankheitsmodellierung und das Arzneimittelscreening. Da diese von Patienten stammen, liefern iPSC-abgeleitete Neuronen und Gliazellen Krankheitsmodelle, die genauer widerspiegeln, was beim Menschen passiert.

Bisher gibt es nur wenige komfortable und zuverlässige Methoden zur Messung mehrerer mitochondrialer Funktionsparameter in iPS-Zellen, insbesondere lebenden Neuronen und Gliazellen. Der Einsatz der Durchflusszytometrie bietet dem Wissenschaftler ein leistungsfähiges Werkzeug zur Messung biologischer Parameter, einschließlich der mitochondrialen Funktion, in einzelnen Zellen. Dieses Protokoll liefert Details für die Erzeugung verschiedener Arten von Gehirnzellen, einschließlich neuraler Stammzellen (NSCs), Neuronen und glialer Astrozyten aus iPSCs, sowie neuartige durchflusszytometrische Ansätze zur Messung mehrerer mitochondrialer Parameter in verschiedenen Zelltypen, einschließlich iPSCs und iPSC-abgeleiteten Neural- und Gliazellen. Das Protokoll bietet auch eine Co-Färbestrategie für die Verwendung der Durchflusszytometrie zur Messung des mitochondrialen Volumens, MMP, mitochondrialen ROS-Spiegels, MRC-Komplexe und TFAM. Durch die Einbeziehung von Messungen des mitochondrialen Volumens oder der mitochondrialen Masse ermöglichen diese Protokolle auch die Messung sowohl des Gesamtniveaus als auch des spezifischen Niveaus pro mitochondrialer Einheit.

Protocol

HINWEIS: In der Materialtabelle und der Zusatztabelle S1 finden Sie Rezepturen aller in diesem Protokoll verwendeten Medien und Lösungen. 1. Differenzierung humaner iPS-Zellen in NCSs, dopaminerge (DA) Neuronen und Astrozyten Matrixbeschichtete Platten vorbereiten.Eine Durchstechflasche mit 5 ml Matrix über Nacht auf Eis auftauen. Verdünnen Sie 1 ml Matrix mit 99 ml kaltem Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Ham’s F-…

Representative Results

Eine schematische Beschreibung der Differenzierungsmethode und der durchflusszytometrischen Strategien ist in Abbildung 3 dargestellt. Humane iPS-Zellen werden in neuronale Rosetten differenziert und dann zur Differenzierung in neuronale Sphären in die Suspensionskultur gehoben. Neuronale Sphären werden weiter differenziert und zu DA-Neuronen gereift. Neuronale Kugeln werden in einzelne Zellen dissoziiert, um gliale Astrozyten zu erzeugen, die in Monoschichten als NSCs umplattiert und dann…

Discussion

Hierin befinden sich Protokolle zur Erzeugung von iPSC-abgeleiteten Neuronen und Astrozyten und zur Bewertung mehrerer Aspekte der mitochondrialen Funktion mittels Durchflusszytometrie. Diese Protokolle ermöglichen eine effiziente Umwandlung menschlicher iPS-Zellen in Neuronen und Glia-Astrozyten und die detaillierte Charakterisierung der mitochondrialen Funktion, hauptsächlich in lebenden Zellen. Die Protokolle bieten auch eine auf der Durchflusszytometrie basierende Strategie zur Erfassung und Analyse mehrerer mitoch…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken dem Molecular Imaging Centre und der Flow Cytometry Core Facility an der Universität Bergen in Norwegen. Diese Arbeit wurde durch Mittel des Norwegian Research Council (Förderkennzeichen: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat und des China Scholarship Council (Projektnummer: 201906220275) unterstützt.

Materials

anti-Oct4 Abcam ab19857, RRID:AB_445175 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-SSEA4 Abcam ab16287, RRID:AB_778073 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Sox2 Abcam ab97959, RRID:AB_2341193 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Pax6 Abcam ab5790, RRID:AB_305110 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Nestin Santa Cruz Biotechnology sc-23927, RRID:AB_627994 Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-GFAP Abcam ab4674, RRID:AB_304558 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-S100β  conjugated with Alexa Fluor 488 Abcam ab196442, RRID:AB_2722596 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution;
anti-TH Abcam ab75875, RRID:AB_1310786 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Tuj 1 Abcam ab78078, RRID:AB_2256751 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Synaptophysin Abcam ab32127, RRID:AB_2286949 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-PSD-95 Abcam ab2723, RRID:AB_303248 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488 Abcam ab198308 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488 Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-17764 RRID:AB_628381 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-NDUFB10 Abcam ab196019 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-SDHA Abcam ab137040 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-COX IV Abcam ab14744, RRID:AB_301443 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use  Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control.
Activin A PeproTech 120-14E Astrocyte differentiation medium ingredient
ABM Basal Medium Lonza CC-3187 Basal medium for astrocyte culture
AGM SingleQuots Supplement Pack Lonza CC-4123 Supplement for astrocyte culture
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240062 CDM ingredient
Advanced DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 12634010 Basal medium for dilute Geltrex
Bovine Serum Albumin Europa Bioproducts EQBAH62-1000 Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient
BDNF PeproTech 450-02 DA neurons medium ingredient
B-27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044 Astrocyte differentiation medium ingredient
BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer BD Biosciences, USA
Chemically Defined Lipid Concentrate Thermo Fisher Scientific 11905031 CDM ingredient
Collagenase IV Thermo Fisher Scientific 17104019 Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G Leica Microsystems, Germany
Corning non-treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430589 Suspension culture
DPBS Thermo Fisher Scientific 14190250 Used for a variety of cell culture wash
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 10565018 Astrocyte differentiation basal Medium
EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal Medium Thermo Fisher Scientific A1516901 Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50X) Thermo Fisher Scientific A1517101 Supplement for iPSC culture
EGF Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0314 Supplement for NSC culture
FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0024 Supplement for NSC culture
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12103C Medium ingredient
FGF-basic PeproTech 100-18B Astrocyte differentiation medium ingredient
FCCP Abcam ab120081 Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
Fluid aspiration system BVC control Vacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16% Thermo Fisher Scientific 28908 Cell fixation
Geltrex Thermo Fisher Scientific A1413302 Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 Supplement for NSC culture
GDNF Peprotech 450-10 DA neurons medium ingredient
Glycine Sigma-Aldrich G8898 Used for blocking buffer
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher Scientific 31765027 Basal medium for CDM
Heregulin beta-1 human Sigma-Aldrich SRP3055 Astrocyte differentiation medium ingredient
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H1399 Stain the nuclei for confocal image
Heracell 150i CO2 Incubators Fisher Scientific, USA
IMDM Thermo Fisher Scientific 21980032 Basal medium for CDM
Insulin Roche 1376497 CDM ingredient
InSolution AMPK Inhibitor Sigma-Aldrich 171261 Neural induction medium ingredient
Insulin-like Growth Factor-I human Sigma-Aldrich I3769 Astrocyte differentiation medium ingredient
KnockOut DMEM/F-12 medium Thermo Fisher Scientific 12660012 Basal medium for NSC culture
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Leica TCS SP8 STED confocal microscope Leica Microsystems, Germany
Monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145 CDM ingredient
MitoTracker Green FM Thermo Fisher Scientific M7514 Used for mitochondrial volume indicator
MitoSox Red Thermo Fisher Scientific M36008 Used for mitochondrial ROS indicator
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A7250 Neural induction medium ingredient
N-2 Supplement Thermo Fisher Scientific 17502048 Astrocyte differentiation medium ingredient
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific PCN5000 Used for blocking buffer
Orbital shakers – SSM1 Stuart Equipment, UK
Poly-L-ornithine solution Sigma-Aldrich P4957 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P7405 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Purmorphamine STEMCELL Technologies 72204 Promotes DA neuron differentiation
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36930 Mounting the coverslip for confocal image
PBS 1x Thermo Fisher Scientific 18912014 Used for a variety of wash
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein R&D Systems 423-F8-025/CF Promotes DA neuron differentiation
SB 431542 Tocris Bioscience TB1614-GMP Neural Induction Medium ingredient
StemPro Neural Supplement Thermo Fisher Scientific A10508-01 Supplement for NSCs culture
TrypLE Express Enzyme Thermo Fisher Scientific 12604013 Cell dissociation reagent
Transferrin Roche 652202 CDM ingredient
TRITON X-100 VWR International 9002-93-1 Used for cells permeabilization in immunostaining assays
TMRE Abcam ab113852 Used for mitochondrial membrane potential staining
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments Grant Instruments, USA

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Liang, K. X., Chen, A., Kristiansen, C. K., Bindoff, L. A. Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives. J. Vis. Exp. (177), e63116, doi:10.3791/63116 (2021).

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