Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Контраст трех методов инокуляции, используемых для определения расы неизвестных Fusarium oxysporum f.sp. нивеум Изолирует

Published: October 28, 2021 doi: 10.3791/63181
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1, 1, 3, 4,5, 6, 1
1Department of Plant Pathology, University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center, University of Florida, 4Horticultural Sciences Department, University of Florida, 5Tropical Research and Education Center, University of Florida, 6Department of Horticulture, University of Georgia
* These authors contributed equally

Summary

Управление фузариозным увяданием арбуза требует знания присутствующих рас патогенов. Здесь мы описываем методы посева корневых, зараженных ядер и модифицированных методов посева в лоток, чтобы продемонстрировать их эффективность в расовом типировании патогенного гриба Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Abstract

Фузариозное увядание арбуза (Citrullus lanatus), вызванное Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), вновь появилось в качестве основного производственного ограничения в юго-восточной США, особенно во Флориде. Внедрение комплексных стратегий борьбы с вредителями, таких как устойчивые к расе сорта, требует информации о разнообразии и плотности популяции патогена на полях производителей. Несмотря на некоторый прогресс в разработке молекулярных диагностических инструментов для идентификации изолятов патогенов, определение расы часто требует подходов к биоанализу.

Типирование расы проводилось методом корневой прививки, метода зараженного ядра и модифицированного метода погружения в лоток с каждым из четырех арбузных дифференциалов (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Изолятам присваивается обозначение расы путем расчета заболеваемости через пять недель после прививки. Если менее 33% растений для конкретного сорта были симптоматическими, они были классифицированы как устойчивые. Те сорта, у которых заболеваемость превышает 33%, были признаны восприимчивыми. В этой статье описываются три различных метода инокуляции для определения расы, корнеплодства, зараженного ядра и модифицированной прививки в лотке, применение которых варьируется в зависимости от экспериментального проекта.

Introduction

Почвенные грибы, входящие в состав видового комплекса Fusarium oxysporum (FOSC), являются эффективными гемибиотрофными патогенами растений, которые могут вызывать серьезные заболевания и потерю урожая в различных культурах1. Фузариозное увядание арбуза, вызванное F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), за последние несколько десятилетий увеличилось по масштабам, заболеваемости и тяжести во всем мире 2,3. У рассады симптомы фузариозного увядания часто напоминают затухание. У старых растений листва становится серой, хлоротической и некротической. В конце концов, увядание растений прогрессирует до полного коллапса растений и смерти4. Прямая потеря урожая происходит из-за симптомов и гибели растений, в то время как косвенная потеря урожая может произойти из-за повреждения солнцем, вызванного устранением листового полога5. Половое размножение и связанные с ним репродуктивные структуры никогда не наблюдались у F. oxysporum. Однако патоген продуцирует два типа бесполодных спор, микро- и макроконидии, а также более крупные, долгосрочные структуры выживания, называемые хламидоспорами, которые могут выживать в почве в течение многих лет6.

FOSC классифицируется на специальные formae на основе наблюдаемых диапазонов хозяев, обычно ограниченных одним или несколькими видами-хозяевами1. Хотя недавние исследования показали, что этот видовой комплекс может состоять из 15 различных видов, конкретные виды, которые заражают арбуз, в настоящее время неизвестны7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) — название групп штаммов, которые заражают исключительно Citrullus lanatus или одомашненный арбуз 8,9. Штаммы F. oxysporum в большинстве патогенных специальных форм демонстрируют определенные уровни разнообразия в отношении их генетических компонентов и вирулентности по отношению к виду-хозяину. Например, один штамм может инфицировать все сорта хозяина, в то время как другой может заражать только более восприимчивые сорта. Чтобы учесть такие вариации, эти группы неофициально классифицируются по расам на основе эволюционных отношений или общих фенотипических характеристик. В пределах Фона четыре расы (0, 1, 2 и 3) были охарактеризованы на основе их патогенности по отношению к набору избранных сортов арбуза, причем открытие расы 3 произошло недавно10.

Несмотря на это кажущееся разнообразие, морфологии спор или гиф не различимы между расами фон, а это означает, что молекулярные или фенотипические анализы необходимы для идентификации уникальной расыизолята 11. Молекулярные исследования выявили некоторые генетические различия. Например, роль эффекторов Secreted in Xylem (SIX) изучалась в течение многих лет у F. oxysporum, и некоторые из этих эффекторов были расположены на хромосомах, которыми обменивались во время горизонтального переноса генов12. Например, SIX6 встречается в гонках Фон 0 и 1, но не в гонках 213. ШЕСТЬ эффекторов были вовлечены в патогенность F. oxysporum f. sp. lycopersici и F. oxysporum f. sp. cubense, которые вызывают увядание Fusarium на помидорах и бананах соответственно 14,15,16,17. Анализ SIX эффекторных профилей среди штаммов F. oxysporum f. sp. spiniciae, патогена Fusarium wilt на шпинате, позволил классифицировать, который точно отражает генетическое и фенотипическое разнообразие18. Однако различия между механизмами вирулентности рас фон в настоящее время не совсем понятны, а молекулярные анализы, разработанные при их использовании, показали противоречивые и неточные результаты19. Таким образом, фенотипические результаты анализов инфекции в настоящее время являются лучшим способом классификации изолятов.

F. oxysporum первоначально заражает хозяев через корни, прежде чем пробиться вверх по ксилеме20. Это делает прямую прививку корней данного сорта хозяина эффективным способом выполнения расового типирования и является основой методов корневой и лотковой инокуляции21. Когда F. oxysporum не заражает хозяина, он находится в почве и может оставаться в состоянии покоя в течение многих лет. Выращивание восприимчивых сортов арбуза в почве из области интересов является одним из способов проверки на наличие фона. Расширение этого метода за счет включения сортов различных известных уровней устойчивости в почве, которая преднамеренно заражена фоном, также является хорошим способом выполнения расового типирования (таблица 1) и является основой метода посева зараженных ядрами. Модифицированный метод погружения в лоток представляет собой вариацию оригинального метода погружения в лоток, который позволяет быстро исследовать много растений и полевых изолятов, где можно быстро исследовать многие растения и полевые изоляты22. Важными факторами быстрого и успешного биоанализа расового типирования являются использование сортов, которые имеют документально подтвержденные различия в устойчивости к различным расам патогенов, обеспечение того, чтобы инокулят был биологически активным и обильным во время инфекции, поддержание среды, благоприятной как для патогена, так и для хозяина, и использование последовательной системы оценки тяжести или заболеваемости. В настоящем документе описываются корнеплодные23,24, зараженные ядра25,26 и модифицированные методы погружения в лоток22 для фенотипического расового типирования, основанные на принципах, описанных выше.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Определение расы методом root-dip (RDM)

  1. Подготовка экспериментальной среды
    1. Поскольку выраженность симптомов сильно зависит от условий окружающей среды, поддерживайте растения в контролируемой зоне. Мониторинг относительной влажности, температуры, фотопериода и интенсивности света (рисунок 1).
      1. Установите температуру 26-28 °C, относительную влажность до 50-75% и установите 16-часовой фотопериод для обеспечения адекватного роста и здоровья растений.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения гипоксии, увядания рассады и/или гниения семян не переувлажняйте и не допускайте стоячей воды вокруг рассады.
      2. Используйте две люминесцентные лампы, каждая с не менее чем 1850 люменами света и цветовой температурой 2 800 К на банк света для поддержки роста фотосинтеза.
      3. Держите территорию в чистоте и используйте гигиенические методы, включая удаление отходов почвы и растительного мусора, чтобы предотвратить повреждение вредителями и случайные инфекции.
    2. Условия посадки
      1. Заполните 8 x 16 ячеек (ширина 25 см x длина 50 см), начиная с посадочной среды, и постучите вниз, чтобы слегка сжать почву (рисунок 2).
      2. Получите семена четырех различных сортов: Black Diamond/Sugar Baby, Charleston Grey/Allsweet/Dixielee, Calhoun Grey и PI-296341-FR.
      3. Сейте семена с их верхушкой (заостренным концом), направленной вверх на глубину, равную их длине. После того, как семена посеяны, засыпьте среду, содержащую захороненные семена, 100% Землей Фуллера или другой бентонитовой глиной, альтернативной глубине 0,3175-0,635 см.
      4. Опламляйте квартиры, чтобы смочить среду, не создавая стоячей или сливающейся воды. После этого держите среду влажной, запотевая в течение 20 с каждые 180 минут или поливая вручную один раз в день до прорастания семян в течение примерно 5 дней. После прорастания поливайте один раз в день и по мере необходимости поддерживать рост рассады.
    3. Подготовка СМИ
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обе среды изготовлены твердыми с дополнительным гранулированным агаром, чтобы обеспечить сбор спор путем соскабливания поверхности.
      1. Осветленная среда сока V8 (V8)
        1. Приготовьте 500 мл осветленного сока V8 (V8)27 , добавив 100 мл осветленного V8 оригинального 100% овощного сока с 1% CaCO3 до 400 мл дистиллированной воды.
        2. Добавить 7,5 г гранулированного агара.
        3. Хорошо перемешайте ингредиенты, автоклав и дайте остыть до 50 °C перед выливанием в стерильные чашки Петри.
      2. Четверть крепости картофеля декстроза агар среды (qPDA)
        1. Приготовьте среду qPDA, добавив 4,5 г гранулированного агара в 500 мл дистиллированной воды, добавьте 3,8 г агара декстрозы картофеля.
        2. Хорошо перемешайте ингредиенты, автоклав и дайте остыть до 50 °C, прежде чем вылить 12-15 мл в стерильные чашки Петри.
  2. Подготовка экспериментальных методов лечения
    1. Подготовьте инокулятор.
      1. Через пять дней после посадки (dpp) поместите инфильтрированные бумажные диски (диаметром 1-1,25 см), содержащие предпочтительный изолят F. oxysporum , на одну пластину V8 и одну qPDA и храните их в инкубаторе (~28 °C) в течение восьми дней28 (рисунок 3A).
      2. На восьмой день роста грибков и за день до прививки (см. раздел 1.3.2) перенесите пластины V8 и qPDA из инкубатора в шкаф биобезопасности.
      3. Для каждого изолята нанесите 6 мл стерилизованной деионизированной воды на каждую культуральную пластину V8 и qPDA.
      4. Вытесните конидии путем соскабливания стерильного клеточного распределителя по поверхности среды (рисунок 3B). Сложите жидкую конидиальную суспензию и переложите ее в стерильную культуральную трубку объемом 50 мл (рисунок 3C).
      5. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока общий объем конидиальной суспензии жидкости в культуральной трубке объемом 50 мл не составит приблизительно 12 мл.
      6. Прежде чем перейти к другому изоляту, на поверхность стерилизуйте рабочую зону и разбрасыватель клеток спиртом. Стерилизуйте клеточный распределитель, пропуская его через горелку Бунзена после погружения в ≥70% этанол.
      7. После того, как жидкие конидиальные суспензии были перенесены в культуральные трубки для всех изолятов, количественно оцените количество спор. Во-первых, вихрьте индивидуальную культуральную трубку объемом 50 мл и дозируйте 10 мкл в каждую камеру гемацитометра. Затем рассчитайте количество спор в гемацитометре, как описано ранее29.
      8. Готовят окончательный раствор инокулята путем переноса расчетного объема на 106 +10% в другую стерильную культуральную трубку и доводят общий объем до 30 мл путем добавления стерильной деионизированной воды.
      9. Храните эти культуральные тубы в течение ночи при температуре 8 ± 1 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать без потери конидиальной жизнеспособности, о чем свидетельствуют неопубликованные данные.
  3. Прививка
    1. Подготовьте прививку.
      1. Перед днем прививки плотно поливайте тринадцатидневную рассаду до несущей способности почвы.
      2. Предварительно обозначьте колья соответствующей информацией, включая изолят, подлежащий испытанию, сорт арбуза и дату прививки.
      3. Поместите 6 х 12-ячеек (20 см шириной х 40 см длиной) пенопластовых плоских, предварительно продезинфицированных 10% отбеливателем и хорошо промытых, для получения привитых растений.
      4. Предварительное размещение всех необходимых материалов (см. Таблицу материалов).
    2. Прививайте корни растений.
      1. Сильно поливайте растения за несколько часов до начала прививки. По крайней мере, через 2 ч после полива удалите растения из 8 x 16-клеточных пенопластовых плоскостей и промойте их корни, чтобы удалить любые прилипшие частицы посадочного материала.
      2. Временно храните промытые растения в чистых контейнерах с водопроводной водой до использования, сохраняя сорта отдельно друг от друга (рисунок 4А). Разделите растения на группы по шесть особей и держите группы саженцев завернутыми во влажные бумажные полотенца на лабораторном лотке, чтобы предотвратить высыхание.
      3. Поместите 25-30см3 почвы на дно каждой ячейки лотка из пенополистирола размером 6 х 12 и используйте бутылку для брызг, чтобы намочить почву, пока она не станет заметно влажной.
      4. Прививайте растения и пересаживайте их в соответствии с сортом, так что слева направо высаживаются Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, а затем PI 296341 01 FR.
      5. Начиная со здорового контроля, поместите группу из шести неповрежденных саженцев того же сорта в трубки объемом 50 мл, содержащие инокулятив. В случае здорового контроля используйте водопроводную воду вместо споровой суспензии. Прививайте растения с положительным контролем (Fon race 3) последним.
      6. Оказавшись внутри трубки, убедитесь, что корни растения достигают и подвергаются воздействию инокулята (водопроводной воды).
      7. Вихрь трубок с корнями растений погружен в воду на 30 с (рисунок 4В). После вихря поместите одну сеялку на клетку в квартиры из пенополистирола размером 6 x 12. Поместите растения того же сорта в одну колонну в лотке.
      8. После помещения продезинфицируйте руки в перчатках, держа их в ведрах по 0,7% доступному раствору хлора в течение 30 с последующим промывкой водопроводной водой в течение 1 мин.
      9. После этого накройте уложенные растения посадочной средой и аккуратно засыпьте. Используя шприц или пипетку, тщательно поливайте растения 20 мл на растение, избегая брызг.
      10. Прежде чем приступить к следующему набору растений, снова продезинфицируйте руки в перчатках, используя раствор хлора и промывку водопроводной водой.
      11. После того, как все растения были пересажены, полейте их снова минимально, чтобы предотвратить сток инокулята.
      12. Держите растения на ночь в закрытой, темной среде со средней температурой 27 °C. На следующий день перенесите растения в теплицу, поддерживая среднюю температуру на уровне 27 °C.
  4. Уход и уход за инокулированными растениями
    1. Чтобы предотвратить переполнение излишков воды, слегка поливайте квартиры три раза в день в течение 4-5 дней, пока растения не стабилизируются.
    2. Проверяйте лотки 2-3 раза в день в течение не менее трех дней, чтобы обеспечить адекватное и равномерное покрытие поливом.
    3. Избегайте высыхания из-за солнечного света или затенения, вращая квартиры и / или обеспечивая дополнительное затенение / полив по мере необходимости.
    4. При 3 дпп удобряют растения удобрением быстрого высвобождения 20-20-20 (10 г/3,78 л) из расчета 3-6 мл на литр воды.
    5. Удобрять еженедельно в течение 3-4 недель.
    6. Поддерживайте одинаковое освещение и условия окружающей среды на протяжении всего этого этапа.

2. Определение расы методом зараженного ядра (IKM)

  1. Заражение ядрами
    1. Подготовьте инокулятор.
      1. Либо из сохраненного, либо из недавно собранного образца выделяют и культивируют интересующий штамм F. oxysporum f. sp. niveum на пластине qPDA до такой степени, что его рост покрывает половину пластины.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это демонстрирует, что он активен и жизнеспособен, что необходимо для существенного заражения зерна на более поздних этапах.
    2. Подготовьте ядра.
      1. По шкале отмерьте 200 г ягод ржи (Secale spp.) (или ядер пшеницы Maxie var. (Triticum spp.) в любой достаточно большой емкости и вылейте их в одну или несколько стеклянных колб Эрленмейера объемом 1 л. Добавьте стерильную водопроводную воду в колбы, чтобы полностью покрыть зерна до не менее 5 см (рисунок 5А).
      2. Замочите ядра при комнатной температуре (~24 °C) в течение 2 ч. Слейте воду из колб; заткнуть отверстие куском ватного рулета, завернутым в марлю; и закройте отверстие алюминиевой фольгой (рисунок 5В).
    3. Обеззараживайте ядра. После того, как зерно впитало воду, автоклавируйте его дважды двумя различными способами, чтобы убить другие нежелательные микробы перед посевом.
      1. В первый раз автоклавируют зерно в подготовленные колбы по гравитационному циклу (121,2 °C, 1,06 кг/см2) в течение 1 ч с 5 мин времени высыхания. Дайте колбам остыть до комнатной температуры.
      2. Перед автоклавированием во второй раз переложите зерна в небольшой грибной мешок с фильтром 0,5 мкм. Извлеките воздух из пакета, а затем сложите лишний пластик вокруг пакета.
      3. Поместите пакет в пластиковую автоклавно-безопасную корзину. Накройте бункер алюминиевой фольгой (рисунок 5C).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте металлический бункер при автоклавировании зерен в мешках, так как это может привести к расплавлению пакетов.
      4. Автоклав бункера на гравитационном цикле в течение 1 ч с 5 мин времени высыхания, тот же цикл, что и раньше.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Только автоклав сумки во второй раз, а не в первый, так как фильтр и порт могут быть скомпрометированы, если мешки автоклавированы дважды. Предотвратите конденсацию на фильтре, позволив мешкам медленно и полностью остыть, прежде чем удалять их из автоклава, потому что фильтр для растущих мешков будет скомпрометирован, если он намокнет.
    4. Привить ядра.
      1. Работая с культуральной пластиной и мешком в шкафу биобезопасности, вырезайте диски агара диаметром 6 мм из зоны активного роста на культуральной пластине со стерильным пробковым отверстием размером No4. Разверните сумку. Используя строгую стерильную технику, поместите в мешок 5 агаровых дисков. Используйте стерильный градуированный цилиндр объемом 50 мл, чтобы измерить 35 мл стерильной водопроводной воды и добавить его в пакет.
      2. Несколько сверните отверстие пакета, а затем опрыскивайте снаружи 70% этанолом для поверхностной стерилизации.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не распыляйте фильтр, так как эта влага также поставит его под угрозу.
      3. Закройте мешок, сложив углы к центру, а затем дважды над фильтром. Закрепите сумку с помощью зажимов для мешков и прозрачной виниловой трубки, предоставленной производителем.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Зажимы являются многоразовыми.
      4. Извлеките пакет из шкафа биобезопасности.
    5. Храните возбудителя для роста.
      1. Храните сумку в вертикальном положении. Убедитесь, что фильтр оттянут от противоположной стороны мешка, чтобы обеспечить максимальный газообмен (рисунок 5D).
      2. Инкубируйте материалы при комнатной температуре в течение примерно трех недель. Регулярно перераспределяйте зерна, чтобы обеспечить равномерный рост возбудителя.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Сумки не подлежат многоразовому использованию.
  2. Заражение рассады арбуза зараженным зерном
    1. Источник семян арбуза, как описано ранее.
    2. Определите экспериментальные группы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Единственным штаммом (штаммами) патогена являются изоляты, которые тестируются для расовой идентификации. Тем не менее, отрицательный и позитивный контроль поможет провести сравнение с растениями без инфекции или определенного уровня инфекции.
      1. Для получения отрицательного контроля используют зерна пшеницы, стерилизованные по ранее упомянутому способу, но без прививки.
      2. Для получения положительного контроля используйте зерна пшеницы, привитые уже классифицированным штаммом, для сравнения с неизвестным изолятом.
    3. Соедините почву и зерно.
      1. Измерьте 14 зерен зараженных ядер в большой полиэтиленовый пакет (рисунок 5Е). Наполните пластиковые горшки (диаметром 15 см х 10 см в высоту) горшечной смесью, чтобы измерить необходимое количество смеси. Высыпьте смесь в пакет. Создайте воздушную подушку в пакете и закрутите или запечатайте его закрытым.
      2. Смешайте ядра и почву, перевернув мешок несколько раз. Для отрицательного контроля выполните тот же процесс в другом пакете с чистыми ядрами. Для положительного контроля выполните тот же процесс в другом пакете с ядрами, зараженными сравнительным штаммом.
      3. Заполните четыре поверхностно-стерилизованных горшка зараженной почвенной смесью. Для отрицательного контроля, поместите эту смесь перед обработкой любой загрязненной фоном почвы.
    4. Посейте семена арбуза.
      1. Посейте по шесть семян в каждом горшке. Убедитесь, что каждый горшок содержит только семена одного сорта. Расположите семена верхушечным концом семени лицом вверх, чтобы обеспечить правильный рост во время всходов (рисунок 6А).
      2. С помощью баллона-распылителя смочите верхние 0,3-0,6 см почвы водой. Поместите прозрачную пластиковую посуду (диаметром 15 см) под и над каждым горшком, чтобы создать влажную среду для прорастания семян (рисунок 6B).
    5. Создание условий выращивания.
      1. Поливайте горшки три раза в день баллончиком-распылителем, чтобы сохранить тургидность без стока до тех пор, пока семена не прорастут (примерно 5 дней).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Количество используемой воды будет увеличиваться с размером растения и размером горшка.
      2. Как только семена прорастут, переместите верхнюю посуду на нижнюю сторону горшка.
      3. Поливайте растения ежедневно по мере необходимости для оптимального роста растений. Подвергайте растения 16-часовому фотопериоду при условиях освещения, аналогичных описанным ранее, и при температуре 27 °C (± 1 °C).

3. Определение расы модифицированным методом погружения в лоток (MTDM)

  1. Подготовка материалов для прививок
    1. Установите условия посадки.
      1. Заполните 48-ячеечные (ширина 3,68 см x длина 5,98 см x глубина 4,69 см) вставки паровостастеризованным песком: торф: вермикулит (4:1:1) и постукивайте вниз, чтобы слегка сжать почву. Поместите вставки в пластиковые лотки (ширина 27,9 см x длина 53,3 см x глубина 5,1 см).
      2. Посейте семена с их верхушкой (проксимальным концом), направленной вверх на глубину, равную их длине.
      3. Источник семян, как описано ранее.
      4. После этого держите носитель влажным, запотевая в течение 20 с каждые 180 минут или поливая вручную один раз в день.
      5. После прорастания (примерно 5 дней) поливайте один раз в день и по мере необходимости для поддержки роста рассады.
    2. Подготовьте носитель.
      1. Готовят среду qPDA, добавляя 5,625 г гранулированного агара в 500 мл дистиллированной воды; добавить 4,875 г агара декстрозы картофеля. Хорошо перемешайте ингредиенты, автоклав и охладите до 50 °C перед заливкой в стерильные чашки Петри. Запечатайте чашки Петри парапленкой и храните пластины в холодильнике (4 °C) до использования.
      2. Для приготовления бульона взвесьте и добавьте 24 г картофельной декстрозы во флакон объемом 1 л. Доведите смесь до 1000 мл, добавив дистиллированную воду в бутылку, поместите бутылку на горячую плиту и перемешайте до растворения. Разрежьте 100 мл бульона в колбы Эрленмейера по 250 мл. Используйте марлю для запечатывания колб и автоклава.
    3. Подготовьте инокулятор.
      1. За семь дней до посадки привите пять пластин qPDA инфильтрированной бумагой28 и храните их в инкубированной зоне в течение восьми дней в темном цикле22 14 ч/10 ч.
      2. На седьмой день переложите две вилки агарапо 1 см2 в каждую колбу Эрленмейера объемом 250 мл, содержащую 100 мл декстрозы картофеля. Поместите колбы Erlenmeyer на настольный шейкер со скоростью 200 об/мин в течение 7 дней по циклу 14 ч/10 ч света/темноты.
      3. В день посева (через 14 дней после посева) собирают споры, фильтруя инокулятив через четыре слоя стерильной марли.
      4. Определите микроконидиальную концентрацию в колбах с помощью гемоцитометра, как описано ранее. Подготовьте 7-литровую суспензию инокулята в пластиковой ванне (ширина 40,6 см x длина 67,3 см x глубина 16,8 см), переместив правильный объем споровой суспензии в стерильную воду для конечной концентрации спор 1 × 106 мл−1 (рисунок 7A).
  2. Прививка
    1. Через четырнадцать дней после посева (по крайней мере, первая стадия истинного листа) переложите клеточные вставки с рассадой в перепончатые лотки (ширина 26,9 см x длина 53,7 см x глубина 6,28 см). Аккуратно поместите перепончатые лотки с рассадой в пластиковую ванну, содержащую 7-литровую суспензию инокулята. Прививайте каждый лоток по одному (рисунок 7B).
    2. Дайте саженцам оставаться в инокуляте нетронутым в течение 15 минут. Через 15 минут аккуратно переложите клеточные вставки, содержащие привитые саженцы, в лотки без отверстий (ширина 27,9 см x длина 53,3 см x глубина 5,1 см). Повторите эту процедуру для каждого лотка.
    3. Поместите лотки без отверстий на скамейку теплицы и поливайте по мере необходимости. Поддерживайте те же условия освещения и окружающей среды, которые описаны для биоанализа корневого погружения.

4. Рейтинг заболеваний

  1. Выберите временные интервалы для оценки.
    1. Для методов корневого погружения и модифицированного погружения в лоток начните оценку через неделю после прививки растений и продолжайте еженедельно в течение еще четырех недель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объединенный набор данных будет включать пять наборов наблюдений за этот период.
    2. Используя метод ядра, начинайте рейтинги только после появления саженцев и продолжайте еженедельно в общей сложности шесть оценок.
  2. Наблюдайте и рассчитывайте заболеваемость.
    1. Во время каждого рейтинга делайте цифровые снимки, чтобы задокументировать прогресс заболевания.
    2. Сообщайте о частоте увядания и гибели растений. Рассчитайте заболеваемость, взяв сумму симптоматических растений по сравнению со здоровым контролем и количество мертвых растений как долю от общего числа растений в этом сорте.
  3. Проанализируйте результаты. Сравните модели заражения между сортами и между экспериментальными группами, если использовались контрольные группы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эти эксперименты помогают определить относительную устойчивость обычно выращиваемых сортов (таблица 1). Эта информация затем может быть использована для руководства рекомендациями по управлению, основанными на местных популяциях Фон. Другими словами, если известно, что раса 0 или 1 присутствует на коммерческом поле, то фермер может быть склонен выращивать «устойчивый» сорт, такой как Calhoun Gray, Sunsugar или эквивалент. Результаты биоанализов с использованием всех методов показывают, что при заражении саженцев изолятом расы 1 сорта Black Diamond и Charleston Grey умирали или проявляли серьезные симптомы, в то время как сорта Calhoun Grey и PI демонстрировали устойчивость (таблица 2 и рисунок 8A).

Все методы показали, что при заражении саженцев изолятом Расы 3 почти все растения всех сортов погибали или проявляли серьезные симптомы (рисунок 8В). Эти результаты демонстрируют, как биоанализы с использованием обоих методов инокуляции успешно различают расы фона. Внешний вид больных растений должен быть одинаковым для всех методов. Единственное различие заключается в том, как сорта сгруппированы пространственно. Для методов корневого погружения и модифицированного дрей-дипа сорта будут организованы колоннами лотка, тогда как в методе ядра сорта будут сгруппированы в их собственные горшки.

Figure 1
Рисунок 1: Экспериментальная область для RDM. Из-за изменчивости симптомов, которая сильно зависит от условий окружающей среды, таких как относительная влажность, температура, фотопериод и интенсивность света, важно поддерживать регулируемую экспериментальную область. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Подготовка стартовых квартир к RDM. Засыпьте 8 x 16 ячеек (ширина 25 см x длина 50 см), начиная с посадочной среды и постукивайте вниз, чтобы слегка сжать почву. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Подготовка конидиальной суспензии для РДМ. а) Изоляция и культивирование. Либо из сохраненного, либо из недавно собранного образца, изолируйте и культивируйте интересующий штамм F. oxysporum f. sp. niveum на пластине qPDA до такой степени, что его рост покрывает половину пластины. Это демонстрирует, что он активен и жизнеспособен, что необходимо для существенного заражения зерна на более поздних стадиях. (B) Вытеснение конидий. Вытесните конидии, соскребая стерильный клеточный распределитель по поверхности среды. с) Суспензионное осаждение. Смешайте жидкую суспензию конидии и переложите ее в стерильную культуральную трубку объемом 50 мл. Аббревиатура: qPDA = одна четверть крепости картофеля декстроза агар средняя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Организация и вихрь рассады для РДМ. (А) Разделение сортов. Временно храните промытые растения в чистых контейнерах с водопроводной водой до использования, сохраняя сорта отдельно. (B) Вихрь рассады. Вихрь трубок с корнями растений, погруженных в воду на 30 с для посадки одного растения на клетку в плоские пенопласты размером 6 x 12. Растения одного сорта помещают в одну колонну в лотке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Подготовка и заражение ядер для IKM. (A) Впитывание ягод ржи. По шкале отмерьте 200 г ягод ржи (Secale spp.) (или ядер пшеницы Maxie var. (Triticum spp.) в любой достаточно большой емкости и вылейте их в одну или несколько стеклянных колб Эрленмейера объемом 1 л. Добавьте стерильную водопроводную воду в колбы, чтобы полностью покрыть зерна не менее чем до 5 см. (Б) Слив колб. Слейте воду из колб, заткните отверстие куском ватного рулета, завернутого в марлю, и накройте отверстие алюминиевой фольгой. (C) Настройка автоклава. Поместите пакет в пластиковую автоклавно-безопасную корзину. Не используйте металлический контейнер при автоклавировании зерен в мешках, так как это может привести к расплавлению пакетов. Накройте бункер алюминиевой фольгой. D) Хранение сумок. Храните сумку в вертикальном положении. Убедитесь, что фильтр оттянут от противоположной стороны мешка, чтобы обеспечить максимальный газообмен. Е) Поместите 14 зерен зараженных ядер в большой полиэтиленовый пакет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Посев и прорастание семян арбуза. (А) Посев семян сорта в горшки. Посейте по шесть семян в каждом горшке. Убедитесь, что каждый горшок содержит только семена одного сорта. Расположите семена верхушечным концом семени лицом вверх, чтобы обеспечить правильный рост во время всходов. (B) Прорастание семян. С помощью баллона-распылителя смочите верхние 0,3-0,6 см почвы водой. Поместите прозрачную пластиковую посуду (диаметром 15 см) под и над каждым горшком, чтобы создать влажную среду для прорастания семян. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Приготовление инокулята и посев рассады на МТДМ. (А) Приготовление инокулята. Определите микроконидиальную концентрацию в колбах с помощью гемоцитометра, как описано ранее. Подготовьте 7-литровую суспензию инокулята в пластиковой ванне (шириной 40,6 см × длиной 67,3 см × глубиной 16,8 см), переместив правильный объем споровой суспензии в стерильную воду для конечной концентрации спор 1 × 106 мл-1. (B) Инокуляция рассады. Через четырнадцать дней после посева (по крайней мере, первая настоящая листовая стадия) переложите клеточные вставки с рассадой в перепончатые лотки (ширина 26,9 см × длина 53,7 см × глубина 6,28 см). Аккуратно поместите перепончатые лотки с рассадой в пластиковую ванну, содержащую 7-литровую суспензию инокулята. Прививайте каждый лоток по одному. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Фенотипические результаты методов идентификации расы. (A) Результаты гонки 1. Результаты биоанализов с использованием (А) всех методов показывают, что когда саженцы были заражены изолятом расы 1, сорта Black Diamond и Charleston Grey умирали или проявляли серьезные симптомы, в то время как сорта Calhoun Grey и PI показали устойчивость. (B) Результаты гонки 3. Все методы показали, что когда саженцы были заражены изолятом Расы 3, почти все растения из всех сортов умирали или проявляли серьезные симптомы. (Внешний вид больных растений должен быть одинаковым для всех методов. Порядок посадки (слева направо) показан стрелками: Черный бриллиант (синяя стрелка), Чарльстонский серый (фиолетовая стрелка), Кэлхун Грей (коричневая стрелка), Введение растений 296341-FR (зеленая стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Сорт Гонка 0 Гонка 1 Гонка 2 Гонка 3
Сахарный малыш, Черный бриллиант S S S S
Чарльстон Грей, Аллсуит, Диксиели R S S S
Кэлхун Грей, Сансугар R R S S
ПИ-296341-FR R R R S

Таблица 1: Раса Fusarium oxysporum f. sp. Нивеум. Раса Fusarium oxysporum f. sp. niveum определяется восприимчивыми или резистентными реакциями на набор арбузных дифференциалов. Сорта, перечисленные в каждой строке, наиболее часто используются для представления каждого уровня устойчивости во время оценки расы изолята. Эта таблица была изменена с 4. Сокращения: S = восприимчивый; R = устойчивый.

Изолировать Метод БД Х. Г Кэл Г. ПИ Раса
S КАК S КАК S КАК S КАК
X Окунать 6 0 6 0 0 6 0 6 1
X Ядро 6 0 6 0 0 6 0 6 1
X МТД 6 0 6 0 0 6 0 6 1
Y Окунать 6 0 6 0 6 0 6 0 3
Y Ядро 6 0 6 0 6 0 6 0 3
Y МТД 6 0 6 0 6 0 6 0 3
S = симптоматический; AS = Бессимптомно

Таблица 2: Идентификация рас. Значения, используемые в этой таблице, отражают заболеваемость или количество симптоматических растений по сравнению со здоровым контролем, а также количество мертвых растений как долю от общего числа растений в этом сорте. Цифры в каждой клетке отражают заболеваемость, о которой сообщалось в конце периода наблюдения. Сорт считается восприимчивым, когда по крайней мере 1/3или 33% растений этого сорта являются симптоматическими или мертвыми. Затем определяется раса патогена на основе того, какие сорта были признаны восприимчивыми. Другими словами, то, как патоген действует против сортов с возрастающей устойчивостью, определяет расу изолята. Эти результаты не взяты из фактического испытания и скорее показывают, как расы идентифицируются по результатам этих методов. Сокращения: MTD = модифицированный треево-капельный метод; BD = Черный алмаз; CH. G = Чарльстон Грей; Кэл Г. = Кэлхун Грей; PI = Внедрение растений 296341-FR; S = симптоматический; AS = бессимптомно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Были представлены три метода набора гонки. Каждый из этих методов лучше всего подходит для конкретных вопросов и экспериментальных условий. Метод инвазии ядра (заражение почвой), возможно, является более простым и прямолинейным, что делает его особенно полезным для оценки патогенности30. Использование этого метода для простого набора гонки очень эффективно. Однако применение метода для определения резистентности конкретного сорта может быть сложной задачей, учитывая, что каждое растение может не сталкиваться с одинаковой степенью инфицирования или воздействия, и для проверки устойчивости интересующих сортов могут потребоваться одинаково высокие уровни заболевания. Это происходит потому, что инокулят, полученный таким образом, не поддается количественной оценке, а доля жизнеспособных пропагулов или количество инфекционных пропагул, которые достигают корневой зоны, плохо регулируется31. Кроме того, этот метод ограничен несоответствиями в близости посаженных ядер к корневой зоне. Если они слишком далеки, споры могут не прорасти, или гифы могут развиваться недостаточно, чтобы достичь корней.

Метод корневого погружения32,33 является более трудоемким и трудоемким; однако, поскольку количество жизнеспособных пропагул, взаимодействующих с растением, измеряется более точно, сопротивление хозяина может быть более точно описано, что облегчает скрининг резистентности. Кроме того, различия в вирулентности в пределах одной и той же расы могут быть легко обнаружены. Этот метод имеет дополнительное преимущество, заключающееся в том, что, как правило, растения становятся симптоматическими раньше и более выразительно, чем в методе ядра. Один из вариантов метода корневого погружения с использованием хламидоспор в суспензии инокулята вместо конидий может не иметь этого преимущества6. Аналогичным образом, модифицированный метод22 погружения в лоток является трудоемким, но допускает высокопроизводительное фенотипирование, когда необходимо просеять множество изолятов и саженцев.

Общие факторы для трех методов включают селекцию сорта, условия выращивания и требования к гигиене. В зависимости от того, что коммерчески доступно, некоторые сорта могут быть заменены 21,34. Sugar Baby и Black Diamond могут быть использованы для определения изолятов расы 0, в то время как Charleston Gray, Allsweet и Dixielee были описаны как устойчивые к расе 0, но восприимчивые к расе 1. Кэлхун Грей и Сунсугар устойчивы к расам 0 и 1 и восприимчивы к расам 2 и 3. Развитие болезни Фон сильно зависит от температуры. Следует позаботиться о том, чтобы экспериментальные условия контролировали эту переменную. При выборе посадочной среды общие коммерческие смеси, которые включают торфяной мох и/или гипс и обеспечивают хорошую аэрацию, должны быть удовлетворительными. Следует принять меры предосторожности для предотвращения перекрестного загрязнения посадочной среды в обоих методах, особенно из исходного мешка.

После использования одного из описанных методов заболевание должно быть точно и последовательно оценено. Предыдущие исследователи обычно определяли порог, при котором растения классифицируются как восприимчивые или устойчивые35,36. Например, если менее 33% растений конкретного сорта являются симптоматическими, то этот сорт будет классифицирован как устойчивый с изолятом, определенным в отношении восприимчивого профиля сорта. Пороговый набор определяется исследователем и вопросом, который он хочет решить. О вариабельности между оценщиками и одним и тем же оценщиком между растениями широко сообщалось37,38. Такие факторы, как качество используемых семян, качество почвы, плотность инокулята, срок хранения изолятов и смещение оценщика39,40, способствуют этой изменчивости8. Из-за этой изменчивости прививок и реакций pi-сортов необходимы множественные экспериментальные репликации; в идеале рекомендуется по крайней мере три, но пять репликаций, с 6 растениями на каждую разновидность.

В то время как молекулярные анализы были разработаны для обнаруженияFon изолятов 41,42,43, результаты не были последовательными из-за полифилетической природы F. oxysporum и географической и геномной изменчивости видового комплекса 44,45,46. Кроме того, хотя предыдущие исследования установили важность эффекторов Secreted in Xylem (SIX) в полной вирулентности, точное дополнение эффекторов, которые определяют расовую структуру изолятов Фон, еще предстоит определить13. Молекулярная диагностика для расы все еще разрабатывается, для которой эти фенотипические методы имеют решающее значение для оценки их точности и полезности в Fon race typing19,47.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить доктора Али и Лабораторию молекулярной диагностики растений, а также доктора Пиншэн Джи из Университета Джорджии, чье руководство и поддержка помогли создать нашу программу Фон.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Fuller’s Earth Sigma-Aldrich F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask PYREX 4980-1L
15 mL falcon tubes Fisher Scientific 14-959-49B
50 mL graduated cylinder Lab Safety Supply 41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes Fisher Scientific 05-413-921
Aluminum foil wrap Reynolds Wrap 720
Bleach Walmart 587192290
Bunsen burner Fisher Scientific 03-391-301
CaCO3 sigma-Aldrich 239216
cell spreaders Fisher Scientific 08-100-11
Cheesecloth Lions Services, Inc 8305-01-125-0725
Clear plastic dishes Visions Wave 999RP6CLSS ~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls Fisherbrand 22-456-885 Sterile
Ethanol Fisher Chemical A4094 100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights MaxLume Model T5 2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar VWR International 90000-786
Hand-held Spray Bottle Ability One 24122002 ~0.95 L
hemacytometer Fisher Scientific 02-671-55A Two chamber hemacytometer
Lab trays Fisher Scientific 15-236-2A
Large, sealable plastic bags Ziploc 430805 38 cm x 38 cm
Mister / watering can Bar5F B10H22
Mushroom Bag Clamp Shroom Supply 6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves Fisher Scientific 19-130-1597D
Organic Rye Berries Shroom Supply 0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips Fisher Scientific 14-388-100
Petri dishes Fisherbrand FB0875713 Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media Jolly Gardener Pro-Line C/B
Plastic Pitcher BrandTech UX0600850 1 L or larger
Plastic planting pots Neo/SCI 01-1177 ~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin Thermo Scientific UX0601022 3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media Cole-Parmer UX1420028 Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g Ohaus 30208458 Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore Cole-Parmer NC9585352
Small Mushroom grow bag Shroom Supply 0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel Walmart 563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells) Speedling Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells) Speedling Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL) fisher Scientific 14-829-19C
Timer Walmart TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice Walmart 564638212
vortex Fisher Scientific 02-215-418
Watermelon Seed - Black Diamond Willhite Seed Inc 17
Watermelon Seed - Calhoun Gray Holmes Seed Company 4440
Watermelon Seed - Charleston Gray Bonnie Plants 7.15339E+11
Watermelon Seed - PI 296341-FR Contact authors Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional) Alachua County Feed & Seed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edel-Hermann, V., Lecomte, C. Current status of Fusarium oxysporum formae speciales and races. Phytopathology. 109 (4), 512-530 (2019).
  2. Everts, K. L., Himmelstein, J. C. Fusarium wilt of watermelon: Towards sustainable management of a re-emerging plant disease. Crop Protection. 73, 93-99 (2015).
  3. Martyn, R. Cucurbitaceae 2012. Proceedings of the Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae. , University of Cukurova, Ziraat Fakultesi. Antalya, Turkey. 136-156 (2012).
  4. Roberts, P., Dufault, N., Hochmuth, R., Vallad, G., Paret, M. [PP352] Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. niveum) of watermelon. EDIS. 2019 (5), 4 (2019).
  5. Keinath, A. Integrated management for Fusarium wilt of watermelon. Land-Grant Press by Clemson Extension, LGP 1022. , Available from: http://lgpress.clemson.edu/publication/integrated-management-for-fusarium-wilt-of-watermelon (2019).
  6. Costa, A. E. S., et al. Resistance to Fusarium wilt in watermelon accessions inoculated by chlamydospores. Scientia Horticulturae. 228, 181-186 (2018).
  7. Lombard, L., Sandoval-Denis, M., Lamprecht, S. C., Crous, P. Epitypification of Fusarium oxysporum-clearing the taxonomic chaos. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi. 43, 1 (2019).
  8. Martyn, R. D. Fusarium wilt of watermelon: 120 years of research. Horticultural Reviews. 42 (1), 349-442 (2014).
  9. Zhou, X., Everts, K. Characterization of a regional population of Fusarium oxysporum f. sp. niveum by race, cross pathogenicity, and vegetative compatibility. Phytopathology. 97 (4), 461-469 (2007).
  10. Zhou, X., Everts, K., Bruton, B. Race 3, a new and highly virulent race of Fusarium oxysporum f. sp. niveum causing Fusarium wilt in watermelon. Plant Disease. 94 (1), 92-98 (2010).
  11. Leslie, J. F., Summerell, B. A. The Fusarium laboratory manual. , John Wiley & Sons. (2008).
  12. Lo Presti, L., et al. Fungal effectors and plant susceptibility. Annual Review of Plant Biology. 66, 513-545 (2015).
  13. Niu, X., et al. The FonSIX6 gene acts as an avirulence effector in the Fusarium oxysporum f. sp. niveum-watermelon pathosystem. Scientific Reports. 6 (1), 1-7 (2016).
  14. Lievens, B., Houterman, P. M., Rep, M. Effector gene screening allows unambiguous identification of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races and discrimination from other formae speciales. FEMS Microbiology Letters. 300 (2), 201-215 (2009).
  15. Houterman, P. M., Cornelissen, B. J., Rep, M. Suppression of plant resistance gene-based immunity by a fungal effector. PLoS Pathogens. 4 (5), 1000061 (2008).
  16. Houterman, P. M., et al. The effector protein Avr2 of the xylem-colonizing fungus Fusarium oxysporum activates the tomato resistance protein I-2 intracellularly. The Plant Journal. 58 (6), 970-978 (2009).
  17. Czislowski, E., et al. Investigation of the diversity of effector genes in the banana pathogen, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, reveals evidence of horizontal gene transfer. Molecular Plant Pathology. 19 (5), 1155-1171 (2018).
  18. Batson, A. M., Fokkens, L., Rep, M., du Toit, L. J. Putative effector genes distinguish two pathogenicity groups of Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 34 (2), 141-156 (2021).
  19. Keinath, A. P., DuBose, V. B., Katawczik, M. M., Wechter, W. P. Identifying races of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in South Carolina recovered from watermelon seedlings, plants, and field soil. Plant Disease. 104 (9), 2481-2488 (2020).
  20. Gordon, T. R. Fusarium oxysporum and the Fusarium wilt syndrome. Annual Review of Phytopathology. 55, 23-39 (2017).
  21. Martyn, R., Netzer, D. Resistance to races 0, 1, and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI-296341-FR. HortScience. 26 (4), 429-432 (1991).
  22. Meru, G., McGregor, C. Genotyping by sequencing for SNP discovery and genetic mapping of resistance to race 1 of Fusarium oxysporum in watermelon. Scientia Horticulturae. 209, 31-40 (2016).
  23. Freeman, S., Rodriguez, R. A rapid inoculation technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and F. o. melonis on cucurbits. Plant Disease. 77 (12), 1198-1201 (1993).
  24. Martyn, R. Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 2: A highly aggressive race new to the United States. Plant Disease. 71 (3), 233-236 (1987).
  25. Lai, X., et al. Evaluating inoculation methods to infect sugar beet with Fusarium oxysporum f. Beat and F. secorum. Plant Disease. 104 (5), 1312-1317 (2020).
  26. Kirk, W., et al. Optimizing fungicide timing for the control of Rhizoctonia crown and root rot of sugar beet using soil temperature and plant growth stages. Plant Disease. 92 (7), 1091-1098 (2008).
  27. Ferguson, A., Jeffers, S. Detecting multiple species of Phytophthora in container mixes from ornamental crop nurseries. Plant Disease. 83 (12), 1129-1136 (1999).
  28. Fong, Y., Anuar, S., Lim, H., Tham, F., Sanderson, F. A modified filter paper technique for long-term preservation of some fungal cultures. Mycologist. 14 (3), 127-130 (2000).
  29. Rice, W. N. The hemocytometer method for detecting fungus spore load carried by wheat. Proceedings of the Association of Official Seed Analysts of North America. 31, 124-127 (1939).
  30. Kleczewski, N. M., Egel, D. S. A diagnostic guide for Fusarium wilt of watermelon. Plant Health Progress. 12 (1), 27 (2011).
  31. Dhingra, O. D., Sinclair, J. B. Basic plant pathology methods. , CRC Press. (2017).
  32. Latin, R., Snell, S. Comparison of methods for inoculation of muskmelon with Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Plant Disease. 70 (4), 297-300 (1986).
  33. Martyn, R. An iInitial survey of the United States for races of Fursarium oxysporum f. HortScience. 24 (4), 696-698 (1989).
  34. Zhou, X., Everts, K. Races and inoculum density of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in commercial watermelon fields in Maryland and Delaware. Plant Disease. 87 (6), 692-698 (2003).
  35. Fulton, J. C., et al. Phylogenetic and phenotypic characterization of Fusarium oxysporum f. sp. niveum isolates from Florida-grown watermelon. PLoS One. 16 (3), 0248364 (2021).
  36. Zhou, X., Everts, K. Quantification of root and stem colonization of watermelon by Fusarium oxysporum f. sp. niveum and its use in evaluating resistance. Phytopathology. 94 (8), 832-841 (2004).
  37. Nutter, F. W., Esker, P. D., Netto, R. A. C. Disease assessment concepts and the advancements made in improving the accuracy and precision of plant disease data. European Journal of Plant Pathology. 115 (1), 95-103 (2006).
  38. Nutter, F., Gleason, M., Jenco, J., Christians, N. Assessing the accuracy, intra-rater repeatability, and inter-rater reliability of disease assessment systems. Phytopathology. 83 (8), 806-812 (1993).
  39. Chiang, K. -S., Bock, C. H., Lee, I. -H., El Jarroudi, M., Delfosse, P. Plant disease severity assessment-how rater bias, assessment method, and experimental design affect hypothesis testing and resource use efficiency. Phytopathology. 106 (12), 1451-1464 (2016).
  40. Nita, M., Ellis, M., Madden, L. Reliability and accuracy of visual estimation of Phomopsis leaf blight of strawberry. Phytopathology. 93 (8), 995-1005 (2003).
  41. Zhang, Z., Zhang, J., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters. 249 (1), 39-47 (2005).
  42. Lin, Y. -H., et al. Development of the molecular methods for rapid detection and differentiation of Fusarium oxysporum and F. oxysporum f. sp. niveum in Taiwan. New Biotechnology. 27 (4), 409-418 (2010).
  43. van Dam, P., de Sain, M., Ter Horst, A., vander Gragt, M., Rep, M. Use of comparative genomics-based markers for discrimination of host specificity in Fusarium oxysporum. Applied and Environmental Microbiology. 84 (1), 01868 (2018).
  44. Baayen, R. P., et al. Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease. Phytopathology. 90 (8), 891-900 (2000).
  45. O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2044-2049 (1998).
  46. Laurence, M., Summerell, B., Liew, E. Fusarium oxysporum f. sp. canariensis: evidence for horizontal gene transfer of putative pathogenicity genes. Plant Pathology. 64 (5), 1068-1075 (2015).
  47. Hudson, O., et al. Marker development for differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. Niveum race 3 from races 1 and 2. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 822 (2021).

Tags

Биология выпуск 176
Контраст трех методов инокуляции, используемых для определения расы неизвестных <em>Fusarium oxysporum</em> f.sp. <em>нивеум</em> Изолирует
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fulton, J. C., Cullen, M. A.,… More

Fulton, J. C., Cullen, M. A., Beckham, K., Sanchez, T., Xu, Z., Stern, P., Vallad, G., Meru, G., McGregor, C., Dufault, N. S. A Contrast of Three Inoculation Techniques used to Determine the Race of Unknown Fusarium oxysporum f.sp. niveum Isolates. J. Vis. Exp. (176), e63181, doi:10.3791/63181 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter