Summary
Her beskriver vi en enkel og reproducerbar metode, der kan fremkalde myokardieinfarkt eller myokardieiskæmi-reperfusionsskade hos mus ved præcisionsligering af venstre forreste nedadgående koronararterie gennem mikromanipulation.
Abstract
Akut myokardieinfarkt er en almindelig hjerte-kar-sygdom med høj dødelighed. Myokardiereperfusionsskade kan modvirke de gavnlige virkninger af hjerterefluks og fremkalde sekundær myokardieskade. En simpel og reproducerbar model af myokardieinfarkt og myokardieiskæmi-reperfusionsskade er et godt værktøj for forskere. Her beskrives en tilpasselig metode til at skabe en myokardieinfarkt (MI) model og MIRI ved præcisionsligering af den venstre forreste nedadgående koronararterie (LAD) gennem mikromanipulation. Nøjagtig og reproducerbar ligaturpositionering af LAD hjælper med at opnå ensartede resultater for hjerteskade. Ændringer i ST-segmentet kan hjælpe med at identificere modellens nøjagtighed. Serumniveauet af hjertetroponin T (cTnT) bruges til at vurdere myokardieskaden, hjerte-ultralyd anvendes til at evaluere myokardiesystolisk funktion, og Evans-Blue / triphenyltetrazoliumchloridfarvning bruges til at måle infarktstørrelse. Generelt reducerer denne protokol procedurens varighed, sikrer kontrollerbar infarktstørrelse og forbedrer musens overlevelse.
Introduction
Akut myokardieinfarkt (AMI) er en almindelig hjerte-kar-sygdom på verdensplan og bærer høj dødelighed1. Fremskridt inden for teknologier gør tidlig og effektiv revaskularisering tilgængelig for AMI-patienter. Efter disse behandlinger hos nogle patienter kan myokardieiskæmi-reperfusionsskade (MIRI) forekomme2. Det er således af stor betydning at forstå virkningsmekanismerne og hvordan man kan forbedre MI/MIRI. Mus bruges i vid udstrækning som modeller på grund af deres lave omkostninger, hurtige yngletid og lethed til at foretage genetiske ændringer3. Forskere har udviklet forskellige metoder til at modellere MIRI og MI i dyr 4,5,6,7,8,9. Denne strategi fremmer forskning, men de forskellige kriterier og metoder, der anvendes, komplicerer fortolkningen af resultater blandt forskerhold.
Hos mus er MI blevet induceret af isoproterenol10, kryoskade 11,12 eller cauterization13. MI kan let induceres af isoproterenol, men den patofysiologiske proces er forskellig fra den i klinisk MI. Kryoskade-induceret MI har dårlig konsistens, fremkalder overdreven myokardieskade omkring venstre forreste nedadgående koronararterie (LAD) og kan let fremkalde arytmi. Cauterization-induceret MI er helt forskellig fra den naturlige proces med myokardieinfarkt, og den inflammatoriske reaktion i det brændende område er mere intens; Derudover har den kirurgiske tilgang tekniske vanskeligheder. Desuden er der nogle laboratorier14, der udvikler MI-model i minigrise ved hjælp af ballonblokering eller embolisering eller trombosemetode gennem interventionsteknik. Alle disse metoder kan forårsage koronararterieokklusion direkte, men behov for koronar angiografi enheder og frem for alt de for tynde mus koronararterier gør disse operationer ikke praktiske. For MIRI var forskellene mellem forskellige modeller ret beskedne, såsom brug af åndedrætsværn / mikromanipulation eller ikke 5,6.
Her beskrives en enkel og pålidelig metode, der kan inducere MI og MIRI-modellen, tilpasset fra tidligere publicerede metoder 4,5,6,7,8,9,15. Denne metode kan simulere patofysiologiske processer ved direkte blokade af LAD gennem ligering. Desuden kan denne model ved at lindre ligeringen også simulere reperfusionsskade. I denne protokol anvendes et dissekerende mikroskop til LAD-visualisering. Derefter kan forskeren let identificere LAD. Derefter fører nøjagtig ligering af LAD til reproducerbar og forudsigelig blodokklusion og ventrikulær iskæmi. Desuden kan elektrokardiografi (EKG) ændringer anvendes til at bekræfte iskæmi og reperfusion ud over farveændringerne af LAD observeret under et mikroskop. Denne strategi fører til en kortere procedurevarighed, lavere risiko for kirurgiske komplikationer og færre eksperimentelle mus, der er nødvendige. Metoderne til troponin-T-test, hjerteultralyd og triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) farvning er også beskrevet. Samlet set er denne protokol nyttig til undersøgelser af MI / MIR-mekanismen såvel som til lægemiddelopdagelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg er blevet godkendt af Animal Care and Utilization Committee of Huazhong University of Science and Technology (Wuhan, Kina).
BEMÆRK: C57BL/6J-hanmus (8-10 uger) bruges som modeller. Mus har fri adgang til mad og vand og opdrættes under specifikke patogenfrie forhold. Rummet opretholdes under kontrolleret temperatur (22 °C ± 2 °C) og fugtighed (45% -65%). Mus udsættes for et 12-timers lys / mørkt miljø på Animal Care Facility of Tongji Medical School (Wuhan, Kina) i henhold til retningslinjerne fra denne institution. Brug sterile mikrokirurgiske instrumenter og kirurgiske forsyninger. Kirurgiske handsker og masker er påkrævet under hele proceduren. Den eksperimentelle arbejdsgang er vist i figur 1A.
1. Præoperativ forberedelse
- Brug et rektangulært operationsbord (OT) med en forvarmet varmepude (37 °C) under hele det kirurgiske indgreb (figur 1B). Desinficer brættet med ultraviolet lys og 70% alkohol inden procedurestart.
- Væg alle mus nøjagtigt for at beregne den nødvendige dosis bedøvelsesmedicin. Derefter bedøves musene med ketamin (80 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) via intraperitoneal injektion. Sørg for passende dybde af anæstesi ved fravær af en tilbagetrækningsrefleks til tåklemning og blinkreflekser.
- Placer musen liggende på OT med gasbind under hovedet for at undgå overophedning af øjnene. Påfør oftalmisk salve til øjnene for at forhindre dem i at tørre ud.
- Barber pelsen på venstre precordial bryst med en elektrisk barbermaskine. Brug en pelsfjerningscreme på den forbarberede brystkasse og massér jævnt med en steril vatpind i ~1 min. Tør overskydende løs pels med gasbind.
- Brug povidon-jod, efterfulgt af 70% alkohol til at rengøre området. Dæk thoraxen med gasbind.
- Brug en 4-0 sutur under de øverste fortænder og fastgør den til ankerpunktet (tæt på kanten af OT over næsen) for at holde munden let åben og lette kanylering.
- Træk halen for at holde kroppen lige, og fastgør halen til OT ved hjælp af tape. Fastgør de fire lemmer og stram dem på de andre ankerpunkter. Det er vigtigt, at du ikke strækker de forreste lemmer for meget; Ellers kan respiratorisk kompromis forekomme.
- Brug buede tang og tang til at åbne kæben og løfte tungen. Brug en belysning til tydeligt at visualisere halsen og glottis.
- Indsæt forsigtigt en 22-G kanyle med en stumpet og afkortet nål i luftrøret gennem munden ~ 1 cm ned i halsen. Brug den ene hånd til at holde tungen, bevæg den lidt opad med stump tang, og brug samtidig den anden hånd til forsigtigt at indsætte røret i luftrøret. Pas på ikke at indsætte røret i spiserøret.
- Fjern nålen forsigtigt. Kontroller intubationen ved at placere røret i vandet for at der dannes bobler, før du tilslutter til ventilatoren.
- Tilslut endotrakealrøret til en ventilator indstillet til 120 / min og tidevandsvolumen justeret til 250 μL.
BEMÆRK: Ventilatorindstillingen justeres efter kropsvægt (generelt kræver en højere kropsvægt et højere tidevandsvolumen). - Bekræft intubation ved at kontrollere bilateral symmetrisk brystudvidelse. Derefter fastgøres forbindelsen til OT med tape for at undgå, at røret falder af.
- Placer EKG-elektroder på poterne, og tilslut dem til EKG-optageren. Overvåg hjerteelektrofysiologi under hele proceduren.
2. Thoracotomi
- Fjern gasbindet på brystkassen. Desinficer igen med 70% alkohol til snitområderne ved hjælp af tre skrubbecyklusser. Dæk derefter musen med et sterilt kirurgisk drapering med et hul over det kirurgiske felt for at reducere forurening af det kirurgiske sted.
- Lav et skråt hudsnit (0,8-1,0 cm) langs venstre midtklavikulære linje med en steril skalpel.
- Foretag stump dissektion af subkutant væv for at udsætte ribbenene nedenunder. Pas på ikke at skade kar, ribben og lunger. Stop blødningen ved hjælp af sterile bomuldsapplikatorer.
- Identificer og lav et snit på ca. 6-8 mm i det tredje interkostale rum. Udfør derefter stump dissektion af væv i det intercoastal rum for at åbne brysthulen. Pas på ikke at skade den indre thoraxarterie.
- Brug tang til at spænde over det interkostale rum. Indsæt præsteriliserede hjemmelavede retraktorer (figur 1C) i brystkassen og træk tilbage for at sprede snittet til ~ 6 mm i bredden. Fastgør retraktorerne til OT med gummibånd.
- Fjern det omgivende væv omhyggeligt for at udsætte hjertet fuldt ud. Træk forsigtigt perikardiet af med buede tang uden at skade hjertet. Nu er et klart billede af hjertet tilgængeligt.
3. LAD ligering
BEMÆRK: LAD fremstår som en tynd rød linje, der løber vinkelret fra nær toppen og ned gennem venstre ventrikel. LAD er lys rød farve, så pas på ikke at forveksle den med en vene. Normalt er ligeringsstedet ~ 1-2 mm under venstre auricle. Denne ligationsposition vil producere ca. 40% -50% af iskæmien i venstre ventrikel. En højere position vil skabe en mere omfattende infarktzone. Et mere distalt sted vil skabe en mindre infarktzone.
- Brug et dissekerende mikroskop og ret et fokuseret og passende lys til LAD-visualisering. Tryk forsigtigt på stedet under den valgte ligeringsposition for midlertidigt at forstørre LAD (≤5 s pr. Gang). Kontroller LAD igen på denne måde.
- Brug en konisk nål (3/8, 2,5 x 5) til at passere en 8-0 silkeligatur under LAD under et dissekerende mikroskop. Vær forsigtig med nåledybden: ikke for dybt til at komme ind i venstre ventrikel og ikke for lavt for at undgå at beskadige LAD.
- Bind ligaturen med en løs dobbeltknude. Sløjfediameteren er ca. 2-3 mm.
- Placer en 2-3 mm PE-10 slange i en løkke parallelt med arterien.
- Stram ligatursløjfen forsigtigt, indtil den er omkring arterien og slangen. Fastgør derefter løkken med en slipknude. Pas på ikke at beskadige myokardievæggen med for stort stramningstryk.
BEMÆRK: Der udføres ikke ligering for skinoperationsgruppen. - Bekræft ophør af blodgennemstrømning i LAD: observer en lysere farve i LV's forreste væg efter ligering. Derudover indikerer signifikant ST-højde inden for få hjerteslag også okklusion16. Hvis permanent ligering er påkrævet (f.eks. MI), skal du fjerne PE-10-slangen og binde LAD direkte med en knude. Genoptag den resterende procedure som nævnt i trin 4.3 nedenfor.
- Fjern retraktorerne fra snittet. Luk derefter såret midlertidigt med en bulldogklemme. Iskæmi varighed er i overensstemmelse med det eksperimentelle design. Sørg for, at musen fortsat er tilsluttet ventilatoren.
4. Reperfusion
- Når perioden med iskæmi slutter, skal du fjerne bulldogklemmen og indsætte retraktorerne igen for at åbne snittet og udsætte hjertet (især ligeringsstedet).
- Løsn slipknuden, og fjern PE-10-slangen. Bekræft genoprettelsen af blodgennemstrømningen i dette trin ved at observere farveændringen tilbage til pink-rød inden for 20 s. Hold samtidig nøje øje med EKG: En potentiel opløsning af ST-elevation antyder også reperfusion.
- Forlad 8-0 ligatur in situ til efterfølgende Evans-Blue og TTC farvning. I andre tilfælde skal du fjerne suturen på dette trin.
- Fjern retraktorerne og luk snittet ved at sy den tredje og fjerde ribben med en 4-0 nylonsutur. Pas på ikke at skade lungen. Skub luften ud, der kan være fanget i brysthulen ved at trykke forsigtigt på brystet, mens du binder suturknuderne.
- Luk muskellagene med kontinuerlige suturer. Luk huden med en 4-0 nylonsutur; Kontinuerlige suturer og afbrudte suturer er acceptable.
5. Postoperativ pleje
- Overhold musen omhyggeligt for tegn på genopretning fra anæstesi, for eksempel bevægelse af halen eller whiskers. Derefter genoptager musen normalt et normalt vejrtrækningsmønster med en respirationshastighed på omkring 150 bpm. Ekstubér musen ved at fjerne røret langsomt.
- Overvåg musen i yderligere 3-5 minutter for at sikre, at åndedrætsbesvær er fraværende.
- Administrer 100 μL buprenorphin (0,1 mg/ml, s.c.), efter at musen er begyndt at trække vejret. I de næste 24 timer skal du give en ekstra dosis hver 4-6 timer. Giv ibuprofen som ekstra smertelindring i drikkevand som en 0,2 mg / ml opløsning i 2 dage før og ≤7 dage efter operationen.
- Hold musene varme og reducer dødelighedsrisikoen ved at bruge varmeisoleringstæpper, da mus er tilbøjelige til hypotermi efter bedøvelsen.
6. Validering efter proceduren
- Troponin-T test
- Der indsamles blodprøver fra de retroorbitale plexusser, og serumerne isoleres ved centrifugering (3.000 × g, 10 min, stuetemperatur).
- 20 μL serum fortyndes til 100 μL med saltopløsning til troponin-T-testen. Resten af prøverne opbevares ved -80 °C.
- Registrer Troponin T (cTnT ved hjælp af et kommercielt sæt efter producentens anvisninger.
- Hjerte ultralyd
BEMÆRK: Hjerteultralyd bruges til at evaluere hjertefunktion og vægbevægelsesabnormiteter på forskellige stadier før og efter operationen i henhold til det eksperimentelle design17,18. Forskellige parametre såsom ventrikulær vægtykkelse, ventrikulært volumen, ventrikulær hulrumsdiameter, udstødningsfraktion og kortakseforkortelsesfraktion måles.- Bedøv musene med ketamin (80 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) via intraperitoneal injektion.
- Barber brystet med en elektrisk barbermaskine. Brug pelsfjerningscreme og massér jævnt. Tør overskydende løs pels med gasbind.
- Placer musen på OT og fastgør de fire lemmer med tape.
- Placer ultralydssonden (30 MHz) på hjertets forreste område ved ~ 30 ° til brystbenet. Sonden i denne visning er justeret med hjertets lange akse. Indstil ultralydet i B-tilstand; Den venstre ventrikel, venstre atrium, mitralventil og stigende aorta kan identificeres tydeligt. Brug videooptagelse til at hente data til efterfølgende analyse.
- Ved at dreje transduceren 90° med uret opnås en parasternal kortaksevisning på papillærmuskelniveau for tydeligt at detektere venstre og højre ventrikler. Brug derefter B-tilstand og M-tilstand til at vurdere hjertefunktion og morfometri.
- Beregn venstre ventrikulær endediastolisk diameter (Dd), endesystolisk diameter (Ds) og interventrikulær septal tykkelse ved at angive den tilsvarende placering i ultralydsbillederne.
BEMÆRK: Maskinen beregner manuelt venstre ventrikels endediastoliske volumen (LVEDV) og endesystoliske volumen (LVESV). Maskinen ville også beregne værdierne for fraktioneret forkortelse (FS) og udstødningsfraktion (EF) ved hjælp af formlerne FS = (Dd-Ds) / Dd × 100% og EF = (LVEDV-LVESV) / LVEDV × 100%. Vælg fem på hinanden følgende hjertecyklusser og få deres middelværdier.
- Måling af myokardieinfarkt størrelse
BEMÆRK: Evans-Blue / TTC-farvning bruges til at måle infarktstørrelsen, fordi den kan evaluere vævets levedygtighed19. Det anbefales at plette inden for 72 timer efter reperfusion, fordi arret krymper. Dette trin udføres efter aflivning af dyret med 200 mg / kg pentobarbitalnatrium via intraperitoneal injektion.- Udsæt hjertet igen ved at følge de tidligere procedurer fra trin 2.2-2.5. Derefter ligeres LAD igen på det oprindelige sted, der er valideret af suturen nævnt i trin 4.3 ved afslutningen af den ønskede reperfusionsvarighed.
- Cannulate aorta og derefter perfusere hjertet med 0,3 ml 1% Evans Blue opløsning. Myokardiet i den ikke-iskæmiske region er farvet blå. Efter perfusion skal du fjerne hjertet hurtigt ved at skære aorta med en saks.
- Vask derefter hjertet i KCl-opløsning (30 mM) for at forhindre hjertet i at slå. Opbevares ved -20 °C i ≥4 timer efter fjernelse af det omgivende fedtvæv.
- Skær hjertet i tværretningen i fem skiver med tykkelse 1 mm ved hjælp af en skarp skalpel. Skiverne vejes og inkuberes derefter med 2% TTC i 40 minutter ved 37 °C.
BEMÆRK: Efter inkubationen afgrænses infarktområderne som hvide, mens levedygtige væv i ikke-infarktområder forbliver røde. - Fastgør skiverne med 4% formaldehyd natten over.
BEMÆRK: Denne handling vil forbedre kontrasten mellem infarktområdet og det ikke-infarktområde. Det vil også krympe skiverne. - Fotografer udsnittene med et digitalkamera. Beregn derefter risikoområdet (AAR), infarktområdet og ikke-iskæmisk zone ved hjælp af grafiksoftware.
BEMÆRK: Efter Evans-Blue/TTC dobbeltfarvning er det blå område det "normale" område. De resterende områder (herunder hvide og røde) er områderne "iskæmirisiko": det hvide område er myokardieinfarktområdet (IA), og det røde område er det iskæmiske (men ikke infarkte) område. Under hensyntagen til inkonsekvensen af størrelser af hjerteskiver justeres resultaterne for vægt.
Tildele:
A1-A5 for areal af infarktzone / areal af hjerteskiven;
B1-B5 for areal uden for infarktzone/areal af hjerteskiven
W1-W5 for Vægt af hjerteskiven.
Derpå:
Samlet vægt af infarkt myokardium: W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5;
Samlet vægt af ikke-infarkt myokardium: W1 × B1 + W2 × B2 + W3 × B3 + W4 × B4+ W5 × B5;
Samlet vægt af AAR = (W1 + W2 + W3 + W4 + W5) - (W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5)
Endelig:
Området med myokardieiskæmi beregnes som procentdelen af AAR i venstre ventrikel:
Området med myokardieinfarkt beregnes som procentdelen af IA i AAR:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den eksperimentelle arbejdsgang er vist i figur 1A. Forskeren kan planlægge tidsknudepunkterne i henhold til det eksperimentelle design ved studiestart. Varigheden af LAD ligation er i overensstemmelse med forskningsformålet. For MI kan forskningen ignorere reperfusionstrinnet. Hjerte ultralyd er tilgængelig på forskellige stadier af undersøgelsen, fordi det er ikke-invasivt, mens Evans-Blue / TTC farvning kun kan udføres, når musen ofres. For forskning, der fokuserer på fibrose og ventrikulær remodellering, er observationstiden meget længere.
De typiske billeder for en del af eksperimentprocessen er vist i figur 2A, fra endotracheal intubation, hudsnit, thoracotomi, LAD identificere, LAD ligation til reperfusion. For at verificere myokardieiskæmi og reperfusion er de repræsentative EKG-billeder med signifikant ST-elevation efter ligering og opløsning af ST-elevation, når slipknuden løsnes, vist i figur 2B.
Efter at have taget blodprøver fra alle mus, kan troponin-T-testen udføres for at validere infarkt. Figur 3A viser en signifikant stigning i cTnT i MIRI- og MI-grupper sammenlignet med skingrupperne. Figur 3B viser dobbeltfarvning af Evans-Blue og TTC for fem på hinanden følgende tværgående sektioner af hjertet mellem skingruppen og MIRI-gruppen. Det blå område antyder det normale område, det hvide område antyder myokardieinfarktområdet, og det røde område antyder det iskæmiske, men ikke infarkterede område. Figur 3C repræsenterer de langaksede billeder af hjerte-ultralyd mellem skingruppen og MI-gruppen. Softwareapplikationer kan bruges til at beregne forskellige funktionelle parametre, såsom en højere værdi af udstødningsfraktionen for skingruppen i figur 3C sammenlignet med værdien i MI-gruppen.
Figur 1: Kirurgisk opsætning. (A) Oversigt over forsøgstidsplanen. (B) Betjeningsbord med forvarmet varmepude og tilslutning til EKG-elektroder. (C) Hjemmelavede retraktorer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksperimentelle proces- og EKG-ændringer. (A) Billeder af endotracheal intubation, hudsnit, thoracotomi, LAD identifikation, LAD ligation og reperfusion er vist i henholdsvis 1, 2, 3, 4, 5 og 6. (B) Typiske EKG-billeder af MI og MIRI efter ligering og reperfusion. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Validering efter proceduren. (A) Ekspression af hjerte-troponin blandt sham-, MIRI-24-timers- og MI3d-grupper. (B) Evans -Blue/TTC dobbeltfarvning til skin- og MIRI-24-timers grupper. (C) Hjerte ultralyd for sham og MI grupper. LEVENDE; d, ende-diastolisk venstre ventrikulær indre dimension; LEVENDE; S, systolisk venstre ventrikulær indre dimension. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de senere år har oprettelsen af modeller for MI og MIRI i klinisk og videnskabelig forskning udviklet sig hurtigt20,21. Der er dog stadig nogle spørgsmål, såsom virkningsmekanismerne og forbedringen af MI/MIRI, der skal løses. Her beskrives en modificeret protokol til etablering af en murinmodel af MI og MIRI. Flere nøglepunkter skal overvejes nøje.
Det første nøglepunkt er endotracheal intubation. Nogle procedurer6,9 involverer snit i livmoderhalshuden, vævsadskillelse efterfulgt af eksponering af sternohyoideusmusklen for at se luftrøret. På den måde kan forskeren visualisere rørindsættelse i luftrøret. Dette er et godt skridt til at reducere risikoen for åndedrætsbesvær. I den nuværende metode kan forskeren tydeligt visualisere glottis lukning og åbning med vejrtrækning under en belysning og derefter let indsætte røret i luftrøret. Derfor er et cervikalt snit ikke lavet for at reducere hudtraumer og potentielle infektioner, hvilket er vigtigt i forskning i inflammatorisk signalering. Visuelle laryngoskoper anvendes bredt i klinisk trakeal intubation: måske kan de også bruges til mus. Mares et al.22 rapporterede den kontinuerlige maskeinhalationsanæstesi uden endotracheal intubation, som blev udført ved 2% isofluraninhalation efter 5% isofluraninduktion med ilt administreret gennem en ikke-invasiv maske placeret over dyrets næse og mund. Det kan undgå vævsskader og forbedre sikkerheden og effektiviteten af anæstesi. Der er dog brug for en speciel inhalationsanæstesimaskine. Desuden kan flygtige anæstetika forårsage fysisk skade på operatøren.
Det andet og vigtigste nøglepunkt er identifikation og ligering af LAD. Enhver fejl i LAD-identifikationen og ligeringen vil føre til inkonsekvente resultater: enten for stor infarktstørrelse, der resulterer i død, eller for lille infarktstørrelse, der resulterer i fiasko. Forskellige metoder kan anvendes til at identificere LAD og verificere dens ligering. Her bruges et dissektionsmikroskop til at lokalisere LAD. LAD vises normalt som en tynd rød linje, der løber vinkelret fra nær toppen og ned gennem venstre ventrikel. Ved at trykke forsigtigt på stedet under den valgte ligeringsposition for midlertidigt at forstørre LAD (≤5 s pr. Gang), kan LAD kontrolleres igen. Efter ligering verificeres LAD-okklusion af en lysere farve i den forreste væg i venstre ventrikel og signifikant ST-højde inden for få hjerteslag. Derefter løsnes ligeringen, og reperfusion valideres ved en farveændring tilbage til pink-rød inden for 20 s og potentiel opløsning af ST-højde ved EKG. Endelig anvendes troponin-T-testen, TTC-farvning og hjerte-ultralyd til at evaluere myokardieskaden. Disse mange forsikringer og gensidige verifikationer gør de eksperimentelle resultater meget pålidelige. Desuden fremkalder mikromanipulation højere nøjagtighed og færre komplikationer (f.eks. Blødning). Et andet vigtigt spørgsmål er antagelsen om, at blodkarrene hos mus er normale, men faktisk varierer nogle koronararterier meget, og selv sikkerhedscirkulation kan præsentere23,24. Derfor er infarktstørrelserne undertiden ikke konsistente, selvom ligationerne anses for at være på samme niveau. Fordelene ved mikroskopet udstilles her. Ligering kan ikke kun baseres på erfaring eller anatomiske vartegn: LAD og dens retning skal verificeres tydeligt inden ligering, ellers vil resultaterne være upålidelige. I nogle eksperimenter 6,8 er mus i højre laterale decubitusposition for nemheds skyld at observere den forreste væg i venstre ventrikel og koronararterier efter hjerteeksponering.
Denne model har to hovedbegrænsninger. For det første kan LAD-ligering ikke simulere okklusion af højre koronararterie. På grund af anatomiske forskelle mellem dyr25 strækker LAD sig normalt til hjertets spids hos mus og rotter, og de venstre circumflex-grene er ikke udviklet, så modellerne hos mus og rotter etableres ved LAD-ligering. For store og mellemstore dyr som kaniner og svin er LAD relativt kort, mens venstre circumflexarterie dækker et stort område af hjertet, så ligering af venstre circumflexarterie vælges for at etablere modellen. Sicard et al.26 rapporterede en ny metode til at undersøge højre ventrikulær dysfunktion og biventrikulær interaktion ved at ligere den højre koronararterie hos mus, hvilket kunne afhjælpe denne begrænsning. Den anden begrænsning er en inkonsekvent infarktstørrelse på grund af variabilitet i koronararterieanatomi27 og kirurgens erfaring. Som diskuteret ovenfor er mikroskopet meget vigtigt for at øge konsistensen ved at verificere LAD og dens retning før ligering, og for en erfaren forsker kan justering af ligationspositionen efter en fuldstændig vurdering af vaskulær anatomi opnås.
Nogle andre spørgsmål fortjener at blive nævnt. For eksempel vil thoracotomi og nålepiercing uundgåeligt forårsage mindre skade på muskler og myokardiet, hvilket kan have virkninger på betændelse. Desuden blev det rapporteret, at smertestillende midler havde virkninger på MI28. Derfor skal disse faktorer tages i betragtning ved analyse af inflammation eller dens virkninger på MI. Til fejlfinding er der flere faktorer, der ville føre til musedød. For eksempel komplikationer relateret til myokardieinfarkt, anæstetisk ulykke og blødning. Desuden kommer de inkonsekvente resultater hovedsageligt fra uhensigtsmæssige ligeringspositioner: for høj ligeringsposition ville fremkalde for stor infarktstørrelse selv musedød; I mellemtiden ville den falske identifikation af LAD resultere i modelfejl. Nogle detaljer skal forbedres i denne metode. For eksempel ville det være bedre, hvis en rektal sonde kunne indsættes for at overvåge temperaturen under proceduren. Sidst men ikke mindst skal eksperimentatoren huske på forskellene mellem dyreforsøg og kliniske realiteter, især at 30 minutters iskæmitiden faktisk er ret kort for klinisk. Vi opfordrer forskeren til at arrangere trinene i henhold til deres eksperimentdesign, herunder iskæmitiden. Kun på denne måde kan denne protokol være nyttig til undersøgelser af mekanismen og behandlingen af MI/MIRI og lægemiddelopdagelse.
Kort sagt leveres en enkel og reproduktiv murinmodel til MIRI og MI. Denne model kan bruges til undersøgelse af MI / MIRI-mekanismer og terapeutisk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (82070317, 81700390 til Jibin Lin, 8210021880 til Bingjie Lv og 82000428 til Boyuan Wang) og National Key R&D Program of China (2017YFA0208000 til Shaolin He).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9 % sodium chloride solution | Kelun Industry Group,China | - | |
| 4% paraformaldehyde fixing solution | Servicebio,China | G1101 | - |
| 4-0 silk suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China | C412 | - |
| 8-0 suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China | H801 | - |
| Buprenorphine | IsoReag,China | IR-11190 | - |
| Camera | Canon,Japan | EOS 80D | - |
| Depilatory cream | Veet,French | - | |
| Elecsys Troponin T hs STAT | Roche,Germany | - | |
| Electrochemical luminescence immunoanalyzer | Roche,Germany | Elecsys 2010 | - |
| Evans blue | Sigma,America | E2129 | - |
| Eye scissors | Shanghai Medical Instruments,China | JC2303 | - |
| Haemostatic forceps | Shanghai Medical Instruments,China | J31020 | - |
| High frequency in vivo imaging systems | Visualsonics,Canada | Vevo2100 | - |
| Ibuprofen | PerFeMiKer,China | CLS-12921 | - |
| Intravenous catheter | Introcan,Germany | 4254090B | - |
| Ketamine | Sigma-Aldrich,America | K2753 | - |
| Medical alcohol | Huichang ,China | - | |
| Microneedle holders | Shanghai Medical Instruments,China | WA2040 | - |
| Microscopic shears | Shanghai Medical Instruments,China | WA1040 | - |
| Microsurgical forceps | Shanghai Medical Instruments,China | WA3020 | - |
| Mouse electrocardiograph | Techman,China | BL-420F | - |
| Needle holders | Shanghai Medical Instruments,China | JC3202 | - |
| operating floor | Chico,China | ZK-HJPT | - |
| PE-10 tube | Huamei,China | - | |
| Pentobarbital | Merck,America | 1030001 | - |
| Rodent Ventilator | Shanghai Alcott Biotech,China | ALC-V8S-P | - |
| Stereo microscope | Aomei Industry,China | SZM0745-STL3-T3 | - |
| Surgical thermostatic heating pad | Globalebio, China | GE0-20W | - |
| Triphenyltetrazolium chloride | Servicebio,China | G1017 | - |
| Xylazine | Huamaike Biochemicals and Life Science Research Prouducts,China | 323004 | - |
References
- Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P.
- Ibanez, B., Heusch, G., Ovize, M., Van de Werf, F. Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury. Journal of the American College of Cardiology. 65 (14), 1454-1471 (2015).
- Bryda, E. C. The mighty mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Kim, S. C., et al. A murine closed-chest model of myocardial ischemia and reperfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3896 (2012).
- Xu, Z., Alloush, J., Beck, E., Weisleder, N. A murine model of myocardial ischemia-reperfusion injury through ligation of the left anterior descending artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e51329 (2014).
- Xu, Z., McElhanon, K. E., Beck, E. X., Weisleder, N. A murine model of myocardial ischemia-reperfusion injury. Methods in Molecular Biology. 1717, 145-153 (2018).
- Muthuramu, I., Lox, M., Jacobs, F., De Geest, B. Permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice: a model of post-myocardial infarction remodelling and heart failure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52206 (2014).
- Reichert, K., et al. Murine left anterior descending (LAD) coronary artery ligation: An improved and simplified model for myocardial infarction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55353 (2017).
- Lugrin, J., Parapanov, R., Krueger, T., Liaudet, L. Murine myocardial infarction model using permanent ligation of left anterior descending coronary artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59591 (2019).
- Li, X., et al. Cardioprotective effects of Puerarin-V on isoproterenol-induced myocardial infarction mice is associated with regulation of PPAR-Y/NF-Kappa B pathway. Molecules. 23 (12), 3322 (2018).
- Vanden Bos, E. J., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: A comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
- Wang, D., et al. A cryoinjury model to study myocardial infarction in the mouse. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), e59958 (2019).
- Brooks, W. W., Garibaldi, B. A., Conrad, C. H. Myocardial injury in the mouse induced by transthoracic cauterization. Laboratory Animal Science. 48 (4), 374-378 (1998).
- Tao, B., et al. Preclinical modeling and multimodality imaging of chronic myocardial infarction in minipigs induced by novel interventional embolization technique. EJNMMI Research. 6 (1), 59 (2016).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circulation Research. 107 (12), 1445-1453 (2010).
- Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of myocardial ischemia and reperfusion injury in mice using surface pad electrocardiography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54814 (2016).
- Gnyawali, S. C., et al. High-frequency high-resolution echocardiography: First evidence on non-invasive repeated measure of myocardial strain, contractility, and mitral regurgitation in the ischemia-reperfused murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), e1781 (2010).
- Pistner, A., Belmonte, S., Coulthard, T., Blaxall, B. Murine echocardiography and ultrasound imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2100 (2010).
- Shibata, R., et al. Adiponectin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury through AMPK- and COX-2-dependent mechanisms. Nature Medicine. 11 (10), 1096-1103 (2005).
- Anderson, J. L., Morrow, D. A.
- Frank, A., et al. Myocardial ischemia reperfusion injury: From basic science to clinical bedside. Seminars in Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 16 (3), 123-132 (2012).
- Mares, R. G., et al. Studying the innate immune response to myocardial infarction in a highly efficient experimental animal model. Romanian Journal of Cardiology. 31 (3), 573-585 (2021).
- Fernandez, B., et al. The coronary arteries of the C57bl/6 mouse strains: Implications for comparison with mutant models. Journal of Anatomy. 212 (1), 12-18 (2008).
- Zhang, R., Hess, D. T., Reynolds, J. D., Stamler, J. S. Hemoglobin S-nitrosylation plays an essential role in cardioprotection. Journal of Clinical Investigation. 126 (12), 4654-4658 (2016).
- Sorop, O., et al. Experimental animal models of coronary microvascular dysfunction. Cardiovascular Research. 116 (4), 756-770 (2020).
- Sicard, P., et al. Right coronary artery ligation in mice: A novel method to investigate right ventricular dysfunction and biventricular interaction. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 316 (3), 684-692 (2019).
- Chen, J., Ceholski, D. K., Liang, L., Fish, K., Hajjar, R. J. Variability in coronary artery anatomy affects consistency of cardiac damage after myocardial infarction in mice. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 313 (2), 275-282 (2017).
- Kato, R., Foex, P. Myocardial protection by anesthetic agents against ischemia-reperfusion injury: An update for anesthesiologists. Canadian Journal of Anaesthesia. 49 (8), 777-791 (2002).
