Summary
यहां हम एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णन करते हैं जो माइक्रोमैनिपुलेशन के माध्यम से बाएं पूर्ववर्ती अवरोही कोरोनरी धमनी के सटीक बंधाव द्वारा चूहों में मायोकार्डियल रोधगलन या मायोकार्डियल इस्किमिया-रीपरफ्यूजन चोट को प्रेरित कर सकता है।
Abstract
तीव्र मायोकार्डियल रोधगलन उच्च मृत्यु दर के साथ एक आम हृदय रोग है। मायोकार्डियल रीपरफ्यूजन चोट दिल के पुन: प्रवाह के लाभकारी प्रभावों का मुकाबला कर सकती है और माध्यमिक मायोकार्डियल चोट को प्रेरित कर सकती है। मायोकार्डियल रोधगलन और मायोकार्डियल इस्किमिया-रीपरफ्यूजन चोट का एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल शोधकर्ताओं के लिए एक अच्छा उपकरण है। यहां, माइक्रोमैनिपुलेशन के माध्यम से बाएं पूर्ववर्ती अवरोही कोरोनरी धमनी (एलएडी) के सटीक बंधाव द्वारा मायोकार्डियल रोधगलन (एमआई) मॉडल और एमआईआरआई बनाने के लिए एक अनुकूलन योग्य विधि का वर्णन किया गया है। एलएडी की सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्थिति दिल की चोट के लिए लगातार परिणाम प्राप्त करने में मदद करती है। एसटी-सेगमेंट परिवर्तन मॉडल सटीकता की पहचान करने में मदद कर सकते हैं। कार्डियक ट्रोपोनिन टी (सीटीएनटी) के सीरम स्तर का उपयोग मायोकार्डियल चोट का आकलन करने के लिए किया जाता है, कार्डियक अल्ट्रासाउंड को मायोकार्डियल सिस्टोलिक फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए नियोजित किया जाता है, और इवांस-ब्लू / ट्राइफेनिल टेट्राज़ोलियम क्लोराइड स्टेनिंग का उपयोग इन्फ्रैक्ट आकार को मापने के लिए किया जाता है। सामान्य तौर पर, यह प्रोटोकॉल प्रक्रिया की अवधि को कम करता है, नियंत्रणीय इन्फ्रैक्ट आकार सुनिश्चित करता है, और माउस अस्तित्व में सुधार करता है।
Introduction
तीव्र मायोकार्डियल रोधगलन (एएमआई) दुनिया भर में एक आम हृदय रोग है और उच्च मृत्यु दर1 है। प्रौद्योगिकियों में प्रगति एएमआई रोगियों के लिए प्रारंभिक और प्रभावोत्पादक रिवैस्कुलराइजेशन उपलब्ध कराती है। कुछ रोगियों में इन उपचारों के बाद, मायोकार्डियल इस्किमिया-रीपरफ्यूजन चोट (एमआईआरआई) हो सकतीहै। इस प्रकार, कार्यों के तंत्र को समझना और एमआई / एमआईआरआई को कैसे सुधारना है, यह बहुत महत्वपूर्ण है। चूहों को व्यापक रूप से उनकी कम लागत, तेजी से प्रजनन समय औरआनुवंशिक परिवर्तन करने में आसानी के कारण मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। विद्वानों ने पशु 4,5,6,7,8,9 में MIRI और MI मॉडल करने के लिए विभिन्न तरीकों को विकसित किया है। यह रणनीति अनुसंधान को बढ़ावा देती है, लेकिन नियोजित विभिन्न मानदंड और तरीके अनुसंधान टीमों के बीच परिणामों की व्याख्या को जटिल बनाते हैं।
चूहों में, एमआई को आइसोप्रोटेनॉल 10, क्रायोइंजरी11,12, या कॉटराइजेशन 13 द्वारा प्रेरित किया गया है। एमआई को आइसोप्रोटेनॉल द्वारा आसानी से प्रेरित किया जा सकता है, लेकिन पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रिया नैदानिक एमआई से अलग है। क्रायोइंजरी-प्रेरित एमआई में खराब स्थिरता होती है, बाएं पूर्ववर्ती अवरोही कोरोनरी धमनी (एलएडी) के आसपास अत्यधिक मायोकार्डियल क्षति होती है, और आसानी से अतालता को प्रेरित कर सकती है। कॉटराइजेशन प्रेरित एमआई मायोकार्डियल रोधगलन की प्राकृतिक प्रक्रिया से काफी अलग है, और जलने वाले क्षेत्र में भड़काऊ प्रतिक्रिया अधिक तीव्र है; इसके अलावा, सर्जिकल दृष्टिकोण में तकनीकी कठिनाइयां हैं। इसके अलावा, कुछ प्रयोगशालाएंहैं जो इंटरवेंशनल तकनीक के माध्यम से बैलून ब्लॉकिंग या एम्बोलाइजेशन या थ्रोम्बोसिस विधि का उपयोग करके मिनीपिग्स में एमआई मॉडल विकसित कर रही हैं। ये सभी विधियां सीधे कोरोनरी धमनी रोड़ा का कारण बन सकती हैं, लेकिन कोरोनरी एंजियोग्राफी उपकरणों की आवश्यकता होती है और, सबसे ऊपर, बहुत पतली माउस कोरोनरी धमनियां इन ऑपरेशनों को व्यावहारिक नहीं बनाती हैं। एमआईआरआई के लिए, विभिन्न मॉडलों के बीच अंतर काफी मामूली थे, जैसे कि श्वासयंत्र / माइक्रोमैनिपुलेशन का उपयोग करना या 5,6 नहीं।
यहां, एक सरल और विश्वसनीय विधि जो एमआई और एमआईआरआई मॉडल को प्रेरित कर सकती है, पहले प्रकाशित विधियों 4,5,6,7,8,9,15 से अनुकूलित, वर्णित है। यह विधि बंधाव के माध्यम से एलएडी की प्रत्यक्ष नाकाबंदी द्वारा पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं का अनुकरण कर सकती है। इसके अलावा, बंधाव से राहत देकर, यह मॉडल रीपरफ्यूजन चोट का अनुकरण भी कर सकता है। इस प्रोटोकॉल में, एलएडी विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है। फिर, शोधकर्ता आसानी से एलएडी की पहचान कर सकता है। इसके बाद, एलएडी के सटीक बंधाव से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और अनुमानित रक्त रोड़ा और वेंट्रिकुलर इस्किमिया होता है। इसके अलावा, इलेक्ट्रोकार्डियोग्राफी (ईसीजी) परिवर्तनों का उपयोग माइक्रोस्कोप के तहत देखे गए एलएडी के रंग परिवर्तनों के अलावा इस्किमिया और रीपरफ्यूजन की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है। यह रणनीति एक छोटी प्रक्रिया अवधि, कम शल्य चिकित्सा जटिलताओं के जोखिम और कम प्रयोगात्मक चूहों की आवश्यकता की ओर ले जाती है। ट्रोपोनिन-टी परीक्षण, कार्डियक अल्ट्रासाउंड और ट्राइफेनिल टेट्राज़ोलियम क्लोराइड (टीटीसी) धुंधला करने के तरीकों का भी वर्णन किया गया है। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल एमआई / एमआईआर तंत्र के अध्ययन के साथ-साथ दवा की खोज के लिए उपयोगी है।
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Protocol
पशु अध्ययन को हुआझोंग यूनिवर्सिटी ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी (वुहान, चीन) की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।
नोट: नर C57BL / 6J चूहों (8-10 सप्ताह) मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। चूहों को भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच होती है और वे विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त परिस्थितियों में पैदा होते हैं। कमरे को नियंत्रित तापमान (22 डिग्री सेल्सियस ± 2 डिग्री सेल्सियस) और आर्द्रता (45% -65%) के तहत बनाए रखा जाता है। इस संस्थान द्वारा निर्धारित दिशानिर्देशों के अनुसार टोंगजी मेडिकल स्कूल (वुहान, चीन) की पशु देखभाल सुविधा में चूहों को 12 घंटे के प्रकाश / अंधेरे वातावरण के संपर्क में लाया जाता है। बाँझ माइक्रोसर्जिकल उपकरणों और सर्जिकल आपूर्ति का उपयोग करें। पूरी प्रक्रिया के दौरान सर्जिकल दस्ताने और मास्क की आवश्यकता होती है। प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो चित्र 1A में दिखाया गया है।
1. प्रीऑपरेटिव तैयारी
- सर्जिकल प्रक्रिया (चित्रा 1 बी) के दौरान पहले से गर्म हीटिंग पैड (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ एक आयताकार ऑपरेटिंग टेबल (ओटी) का उपयोग करें। प्रक्रिया शुरू होने से पहले बोर्ड को पराबैंगनी प्रकाश और 70% अल्कोहल के साथ कीटाणुरहित करें।
- आवश्यक एनेस्थेटिक दवाओं की खुराक की गणना करने के लिए सभी चूहों को सटीक रूप से तौलें। फिर, इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से केटामाइन (80 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलेज़िन (10 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें। पैर की अंगुली पिंचिंग और पलक झपकने के लिए वापसी रिफ्लेक्स की अनुपस्थिति से संज्ञाहरण की उचित गहराई सुनिश्चित करें।
- आंखों के अधिक गर्म होने से बचने के लिए सिर के नीचे धुंध के साथ ओटी पर माउस सुपाइन रखें। आंखों को सूखने से बचाने के लिए उन पर नेत्र मरहम लगाएं।
- एक इलेक्ट्रिक रेजर के साथ बाईं छाती पर फर को शेव करें। पहले से शेव किए गए वक्ष पर एक फर हटाने वाली क्रीम का उपयोग करें और ~ 1 मिनट के लिए बाँझ कपास के फाहे के साथ समान रूप से मालिश करें। अतिरिक्त ढीले फर को धुंध से पोंछ लें।
- क्षेत्र को साफ करने के लिए पोविडोन-आयोडीन का उपयोग करें, इसके बाद 70% अल्कोहल का उपयोग करें। वक्ष को धुंध से ढक दें।
- मुंह को थोड़ा खुला रखने और कैनुलाशन की सुविधा के लिए ऊपरी छेदक के नीचे 4-0 सीवन का उपयोग करें और इसे लंगर बिंदु (नाक पर ओटी के किनारे के करीब) तक सुरक्षित करें।
- शरीर को सीधा रखने के लिए पूंछ खींचें, और टेप का उपयोग करके पूंछ को ओटी तक सुरक्षित करें। चार अंगों को सुरक्षित करें और उन्हें अन्य लंगर बिंदुओं पर कस दें। महत्वपूर्ण रूप से, सामने के अंगों को अधिक न फैलाएं; अन्यथा, श्वसन समझौता हो सकता है।
- जबड़े को खोलने और जीभ को ऊपर उठाने के लिए घुमावदार बल और बल का उपयोग करें। गले और ग्लोटिस को स्पष्ट रूप से देखने के लिए एक प्रकाशक का उपयोग करें।
- गले से ~ 1-सेमी नीचे मुंह के माध्यम से श्वासनली में एक कुंद और कटी हुई सुई के साथ धीरे से 22-जी कैनुला डालें। जीभ को पकड़ने के लिए एक हाथ का उपयोग करें, इसे कुंद बल के साथ थोड़ा ऊपर की ओर ले जाएं, और साथ ही, दूसरे हाथ का उपयोग करके ट्यूब को धीरे से श्वासनली में डालें। ध्यान रखें कि ट्यूब को अन्नप्रणाली में न डालें।
- सुई को धीरे से निकालें। वेंटिलेटर से जुड़ने से पहले बुलबुले बनाने के लिए ट्यूब को पानी में रखकर इंटुबैशन की जांच करें।
- एंडोट्राचेल ट्यूब को 120/मिनट पर सेट वेंटिलेटर से कनेक्ट करें और ज्वारीय मात्रा को 250 μL तक समायोजित करें।
नोट: वेंटिलेटर सेटिंग को शरीर के वजन से समायोजित किया जाता है (सामान्य तौर पर, उच्च शरीर के वजन के लिए उच्च ज्वारीय मात्रा की आवश्यकता होती है)। - द्विपक्षीय सममित छाती विस्तार की जांच करके इंटुबैशन को सत्यापित करें। फिर, ट्यूब को गिरने से बचाने के लिए टेप के साथ ओटी में कनेक्शन तय किया जाता है।
- पंजे पर ईसीजी इलेक्ट्रोड रखें और उन्हें ईसीजी रिकॉर्डर से कनेक्ट करें। प्रक्रिया के दौरान कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की निगरानी करें।
2. थोराकोटॉमी
- वक्ष पर लगी धुंध हटा दें। तीन स्क्रब चक्रों का उपयोग करके चीरा क्षेत्रों के लिए 70% अल्कोहल के साथ फिर से कीटाणुरहित करें। फिर, सर्जिकल साइट के संदूषण को कम करने के लिए सर्जिकल क्षेत्र पर एक छेद के साथ एक बाँझ सर्जिकल ड्रेप के साथ माउस को कवर करें।
- बाँझ स्केलपेल के साथ बाईं मिडक्लेवकुलर लाइन के साथ एक तिरछा त्वचा चीरा (0.8-1.0 सेमी) बनाएं।
- नीचे पसलियों को उजागर करने के लिए चमड़े के नीचे के ऊतकों का कुंद विच्छेदन करें। सावधान रहें कि वाहिकाओं, पसलियों और फेफड़ों को चोट न पहुंचे। बाँझ कपास एप्लिकेटर का उपयोग करके रक्तस्राव को रोकें।
- तीसरे इंटरकोस्टल स्पेस में लगभग 6-8 मिमी का चीरा लगाएं और उसे पहचानें। फिर, छाती गुहा को खोलने के लिए अंतरतटीय स्थान में ऊतकों का कुंद विच्छेदन करें। आंतरिक वक्ष धमनी को चोट न पहुंचाने के लिए सावधान रहें।
- इंटरकोस्टल स्पेस को फैलाने के लिए फोर्सप्स का उपयोग करें। रिब पिंजरे में प्री-स्टरलाइज्ड होममेड रिट्रैक्टर्स (चित्रा 1 सी) डालें और चीरा को चौड़ाई में ~ 6 मिमी तक फैलाने के लिए वापस खींचें। रिट्रैक्टर्स को रबर बैंड के साथ ओटी से संलग्न करें।
- दिल को पूरी तरह से उजागर करने के लिए आसपास के ऊतकों को सावधानी से हटा दें। दिल को चोट पहुंचाए बिना घुमावदार बल के साथ पेरिकार्डियम को धीरे से खींचें। अब दिल का एक स्पष्ट दृश्य उपलब्ध है।
3. एलएडी बंधाव
नोट: एलएडी एक पतली लाल रेखा के रूप में दिखाई देता है जो शीर्ष के पास से लंबवत और बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से नीचे चलती है। एलएडी चमकीले-लाल रंग का है, इसलिए सावधान रहें कि इसे नस के लिए गलती न करें। आमतौर पर, बंधाव स्थल बाएं ऑरिकल से ~ 1-2 मिमी नीचे होता है। यह बंधाव स्थिति बाएं वेंट्रिकल में इस्किमिया का लगभग 40% -50% उत्पादन करेगी। एक उच्च स्थिति एक अधिक व्यापक इन्फ्रैक्ट ज़ोन बनाएगी। एक अधिक डिस्टल साइट एक छोटा इन्फ्रैक्ट ज़ोन बनाएगी।
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें और एलएडी विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक केंद्रित और उपयुक्त प्रकाश निर्देशित करें। एलएडी को अस्थायी रूप से (≤5 सेकंड प्रति समय) बढ़ाने के लिए चुने हुए बंधाव की स्थिति के नीचे साइट को धीरे से दबाएं। इस तरह से एलएडी को फिर से जांचें।
- 8-0 से गुजरने के लिए एक पतली सुई (3/8, 2.5 x 5) का उपयोग करें एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत एलएडी के नीचे रेशम का गुच्छा। सुई की गहराई से सावधान रहें: बाएं वेंट्रिकल में प्रवेश करने के लिए बहुत गहरा नहीं है और एलएडी को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए बहुत उथला नहीं है।
- लिगेचर को एक ढीली डबल-गाँठ से बांध दें। लूप व्यास लगभग 2-3 मिमी है।
- धमनी के समानांतर एक लूप में 2-3 मिमी पीई -10 टयूबिंग रखें।
- लिगेचर लूप को धीरे से कसें जब तक कि यह धमनी और टयूबिंग के आसपास न हो। फिर, लूप को स्लिपनॉट से सुरक्षित करें। अत्यधिक कसने वाले दबाव के साथ मायोकार्डियल दीवार को नुकसान न पहुंचाने का ध्यान रखें।
नोट: दिखावटी-ऑपरेशन समूह के लिए बंधाव नहीं किया जाता है। - एलएडी में रक्त प्रवाह की समाप्ति की पुष्टि करें: बंधाव के बाद एलवी की पूर्ववर्ती दीवार में एक हल्का रंग देखें। इसके अलावा, कुछ दिल की धड़कनों के भीतर महत्वपूर्ण एसटी-ऊंचाई भी रोड़ा16 को इंगित करती है। यदि स्थायी बंधाव की आवश्यकता है (जैसे, एमआई), पीई -10 ट्यूबिंग को हटा दें और एलएडी को सीधे गाँठ से बांध दें। नीचे चरण 4.3 में उल्लिखित शेष प्रक्रिया को फिर से शुरू करें।
- चीरे से रिट्रैक्टर्स को हटा दें। फिर, बुलडॉग क्लैंप के साथ अस्थायी रूप से घाव को बंद करें। इस्किमिया अवधि प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार है। सुनिश्चित करें कि माउस वेंटिलेटर से जुड़ा हुआ है।
4. रीपरफ्यूजन
- जब इस्किमिया की अवधि समाप्त हो जाती है, तो बुलडॉग क्लैंप को हटा दें और चीरा खोलने और दिल (विशेष रूप से बंधाव स्थल) को उजागर करने के लिए फिर से रिट्रैक्टर्स डालें।
- स्लिपनॉट को अनबाँधें और पीई -10 टयूबिंग को हटा दें। 20 सेकंड के भीतर रंग को गुलाबी-लाल में वापस देखकर इस चरण में रक्त प्रवाह की बहाली की पुष्टि करें। इसके साथ ही, ईसीजी को ध्यान से देखें: एसटी-ऊंचाई का संभावित विघटन भी रीपरफ्यूजन का सुझाव देता है।
- 8-0 से छोड़ें बाद में इवांस-ब्लू और टीटीसी धुंधला होने के लिए सीटू में सावधानी बरती। अन्य मामलों में, इस चरण पर सीवन को हटा दें।
- रिट्रैक्टर्स को हटा दें और 4-0 नायलॉन सीवन के साथ तीसरी और चौथी पसलियों को घुमाकर चीरा बंद करें। सावधान रहें कि फेफड़े को चोट न पहुंचे। सीवन गांठ बांधते समय छाती को धीरे से दबाकर छाती गुहा में फंसी हवा को बाहर निकालें।
- मांसपेशियों की परतों को निरंतर सीवन के साथ बंद करें। 4-0 नायलॉन सीवन के साथ त्वचा को बंद करें; निरंतर सीवन और बाधित सीवन स्वीकार्य हैं।
5. पोस्टऑपरेटिव देखभाल
- संज्ञाहरण से वसूली के संकेतों के लिए माउस का सावधानीपूर्वक निरीक्षण करें, उदाहरण के लिए, पूंछ या मूंछ ों की गति। उसके बाद, माउस आमतौर पर लगभग 150 बीपीएम की श्वसन दर के साथ एक सामान्य श्वास पैटर्न को फिर से शुरू करता है। ट्यूब को धीरे-धीरे हटाकर माउस को बाहर निकालें।
- श्वसन संकट अनुपस्थित है यह सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त 3-5 मिनट के लिए माउस की निगरानी करें।
- माउस के सांस लेना शुरू करने के बाद 100 μL ब्यूप्रेनोर्फिन (0.1 मिलीग्राम / एमएल, एस.सी.) का प्रबंधन करें। अगले 24 घंटे के लिए, हर 4-6 घंटे में एक अतिरिक्त खुराक प्रदान करें। सर्जरी से 2 दिन पहले और ≤7 दिनों के लिए 0.2 मिलीग्राम / एमएल समाधान के रूप में पीने के पानी में अतिरिक्त दर्द से राहत के रूप में इबुप्रोफेन प्रदान करें।
- चूहों को गर्म रखें और थर्मल इन्सुलेशन कंबल का उपयोग करके मृत्यु दर के जोखिम को कम करें क्योंकि चूहों को संज्ञाहरण के बाद हाइपोथर्मिया का खतरा होता है।
6. प्रक्रिया के बाद सत्यापन
- ट्रोपोनिन-टी परीक्षण
- रेट्रोऑर्बिटल प्लेक्सस से रक्त के नमूने एकत्र करें और सेंट्रीफ्यूजेशन (3,000 × ग्राम, 10 मिनट, कमरे का तापमान) द्वारा सीरम को अलग करें।
- ट्रोपोनिन-टी परीक्षण के लिए नमकीन घोल के साथ सीरम के 20 μL को 100 μL तक पतला करें। शेष नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करके ट्रोपोनिन टी (सीटीएनटी) का पता लगाएं।
- कार्डियक अल्ट्रासाउंड
नोट: कार्डियक अल्ट्रासाउंड का उपयोग प्रयोगात्मक डिजाइन17,18 के अनुसार सर्जरी से पहले और बाद में विभिन्न चरणों में कार्डियक फ़ंक्शन और दीवार-गति असामान्यताओं का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। वेंट्रिकुलर दीवार की मोटाई, वेंट्रिकुलर वॉल्यूम, वेंट्रिकुलर-कैविटी व्यास, इजेक्शन अंश और शॉर्ट-एक्सिस शॉर्टनिंग अंश जैसे विभिन्न मापदंडों को मापा जाता है।- इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से केटामाइन (80 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलेज़िन (10 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें।
- इलेक्ट्रिक रेजर से छाती को शेव करें। फर हटाने वाली क्रीम का उपयोग करें और समान रूप से मालिश करें। अतिरिक्त ढीले फर को धुंध से पोंछ लें।
- ओटी पर माउस रखें और चिपकने वाले टेप के साथ चार अंगों को सुरक्षित करें।
- अल्ट्रासाउंड प्रोब (30 मेगाहर्ट्ज) को दिल के पूर्ववर्ती क्षेत्र पर ~ 30 ° से उरोस्थि पर रखें। इस दृश्य में जांच दिल की लंबी धुरी के साथ संरेखित है। अल्ट्रासाउंड को बी-मोड में सेट करें; बाएं वेंट्रिकल, बाएं एट्रियम, माइट्रल वाल्व और आरोही महाधमनी को स्पष्ट रूप से पहचाना जा सकता है। बाद के विश्लेषण के लिए डेटा प्राप्त करने के लिए वीडियो कैप्चर का उपयोग करें।
- ट्रांसड्यूसर को 90 डिग्री क्लॉकवाइज घुमाकर, बाएं और दाएं वेंट्रिकल का स्पष्ट रूप से पता लगाने के लिए पैपिलरी मांसपेशियों के स्तर पर एक पैरास्टर्नल शॉर्ट-एक्सिस व्यू प्राप्त करें। फिर कार्डियक फ़ंक्शन और मॉर्फोमेट्री का आकलन करने के लिए बी-मोड और एम-मोड का उपयोग करें।
- अल्ट्रासाउंड छवियों में संबंधित स्थान निर्दिष्ट करके बाएं वेंट्रिकुलर एंड-डायस्टोलिक व्यास (डीडी), एंड-सिस्टोलिक व्यास (डीएस), और इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टल मोटाई की गणना करें।
नोट: मशीन मैन्युअल रूप से बाएं वेंट्रिकुलर एंड-डायस्टोलिक वॉल्यूम (एलवीईडीवी) और एंड-सिस्टोलिक वॉल्यूम (एलवीईएसवी) की गणना करेगी। इसके अलावा, मशीन सूत्र FS = (DD-Ds)/DD × 100% और EF = (LVEDV-LVESV)/LVEDV × 100% का उपयोग करके फ्रैक्शनल शॉर्टनिंग (FS) और इजेक्शन फ्रैक्शन (EF) के मूल्यों की गणना करेगी। पांच लगातार कार्डियक चक्र चुनें और उनके औसत मान प्राप्त करें।
- मायोकार्डियल इन्फ्रैक्ट आकार का माप।
नोट: इवांस-ब्लू / टीटीसी धुंधला का उपयोग इन्फ्रैक्ट आकार को मापने के लिए किया जाता है क्योंकि यह ऊतक व्यवहार्यताका मूल्यांकन कर सकता है। 72 घंटे के भीतर दाग लगाने की सिफारिश की जाती है क्योंकि निशान सिकुड़ जाएगा। यह चरण इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से 200 मिलीग्राम / किग्रा पेंटोबार्बिटल सोडियम के साथ जानवर को यूथेनाइज करने के बाद किया जाता है।- चरण 2.2-2.5 से पिछली प्रक्रियाओं का पालन करते हुए दिल को फिर से उजागर करें। फिर, वांछित पुनरावृत्ति अवधि के अंत में चरण 4.3 में उल्लिखित सीवन द्वारा मान्य प्रारंभिक साइट पर एलएडी को फिर से तैयार करें।
- महाधमनी को प्रवेशनी करें और फिर 1% इवांस ब्लू समाधान के 0.3 एमएल के साथ दिल को प्रवाहित करें। गैर-इस्केमिक क्षेत्र का मायोकार्डियम नीले रंग का सना हुआ है। छिड़काव के बाद, कैंची से महाधमनी को काटकर दिल को तेजी से हटा दें।
- फिर, दिल को धड़कने से रोकने के लिए केसीएल घोल (30 एमएम) में दिल को धोएं। आसपास के फैटी ऊतक को हटाने के बाद ≥4 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- एक तेज स्केलपेल का उपयोग करके अनुप्रस्थ दिशा में दिल को 1 मिमी मोटाई के पांच स्लाइस में काटें। स्लाइस का वजन करें और फिर उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए 2% टीटीसी के साथ इनक्यूबेट करें।
नोट: इनक्यूबेशन के बाद, इन्फ्रैक्ट क्षेत्रों को सफेद के रूप में सीमांकित किया जाता है, जबकि गैर-इन्फ्रैक्ट क्षेत्रों में व्यवहार्य ऊतक लाल रहते हैं। - रात भर 4% फॉर्मलाडेहाइड के साथ स्लाइस ठीक करें।
नोट: यह क्रिया इन्फ्रैक्ट क्षेत्र और गैर-इन्फार्क्ट क्षेत्र के बीच अंतर को बढ़ाएगी। यह स्लाइस को भी सिकोड़ देगा। - एक डिजिटल कैमरे के साथ स्लाइस की तस्वीर लें। फिर, ग्राफिक्स सॉफ्टवेयर का उपयोग करके जोखिम वाले क्षेत्र (एएआर), इन्फ्रैक्ट क्षेत्र और गैर-इस्केमिक क्षेत्र की गणना करें।
नोट: इवांस-ब्लू / टीटीसी डबल-स्टेनिंग के बाद, नीला क्षेत्र "सामान्य" क्षेत्र है। शेष क्षेत्र (सफेद और लाल सहित) "इस्किमिया जोखिम" क्षेत्र हैं: सफेद क्षेत्र मायोकार्डियल रोधगलन क्षेत्र (आईए) है, और लाल क्षेत्र इस्केमिक (लेकिन इन्फ्रैक्टेड नहीं) क्षेत्र है। दिल के स्लाइस के आकार की असंगति को ध्यान में रखते हुए, परिणाम वजन के लिए समायोजित किए जाते हैं।
सौंपना:
दिल के टुकड़े के क्षेत्र के लिए ए 1-ए 5 इन्फ्रैक्ट ज़ोन /
गैर-इन्फार्क्ट ज़ोन के क्षेत्र के लिए बी 1-बी 5 / दिल के टुकड़े का क्षेत्र;
दिल के टुकड़े के वजन के लिए W1-W5।
तब:
रोधगलित मायोकार्डियम का कुल वजन: W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5;
गैर-रोधगलित मायोकार्डियम का कुल वजन: W1 × B1 + W2 × B2 + W3 × B3 + W4 × B4 + W5 × B5;
AAR का कुल वजन = (W1 + W2 + W3 + W4 + W5) - (W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5)
अंततः:
मायोकार्डियल इस्किमिया के क्षेत्र की गणना बाएं वेंट्रिकल में एएआर के प्रतिशत के रूप में की जाती है:
मायोकार्डियल रोधगलन के क्षेत्र की गणना एएआर में आईए के प्रतिशत के रूप में की जाती है:
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Representative Results
प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो चित्र 1A में दिखाया गया है। शोधकर्ता अध्ययन दीक्षा पर प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार समय नोड्स को शेड्यूल कर सकता है। एलएडी बंधाव की अवधि अनुसंधान उद्देश्य के अनुसार है। एमआई के लिए, शोध रीपरफ्यूजन चरण को अनदेखा कर सकता है। कार्डियक अल्ट्रासाउंड अध्ययन के विभिन्न चरणों में उपलब्ध है क्योंकि यह गैर-इनवेसिव है, जबकि इवांस-ब्लू / टीटीसी धुंधला केवल तभी किया जा सकता है जब माउस का बलिदान किया जाता है। फाइब्रोसिस और वेंट्रिकुलर रीमॉडेलिंग पर केंद्रित शोध के लिए, अवलोकन का समय बहुत लंबा है।
प्रयोग प्रक्रिया के हिस्से के लिए विशिष्ट छवियों को चित्रा 2 ए में दिखाया गया है, एंडोट्राचेल इंटुबैशन, त्वचा चीरा, थोराकोटॉमी, एलएडी पहचान, एलएडी लिगेशन से लेकर रीपरफ्यूजन तक। मायोकार्डियल इस्किमिया और रीपरफ्यूजन को सत्यापित करने के लिए, बंधाव के बाद महत्वपूर्ण एसटी-ऊंचाई के साथ प्रतिनिधि ईसीजी छवियां और एसटी-ऊंचाई के विघटन के बाद जब स्लिपनॉट अनबाउंड होता है, तो चित्र 2 बी में दिखाया गया है।
सभी चूहों से रक्त के नमूने प्राप्त करने के बाद, रोधगलन को मान्य करने के लिए ट्रोपोनिन-टी परीक्षण किया जा सकता है। चित्र 3ए दिखावटी समूहों की तुलना में एमआईआरआई और एमआई समूहों में सीटीएनटी की उल्लेखनीय वृद्धि को दर्शाता है। चित्रा 3 बी शाम समूह और एमआईआरआई समूह के बीच दिल के लगातार पांच अनुप्रस्थ वर्गों के लिए इवांस-ब्लू और टीटीसी के डबल-धुंधलापन को दर्शाता है। नीला क्षेत्र सामान्य क्षेत्र का सुझाव देता है, सफेद क्षेत्र मायोकार्डियल रोधगलन क्षेत्र का सुझाव देता है, और लाल क्षेत्र इस्केमिक का सुझाव देता है लेकिन रोधगलित क्षेत्र नहीं। चित्रा 3 सी शाम समूह और एमआई समूह के बीच कार्डियक अल्ट्रासाउंड की लंबी-अक्ष छवियों का प्रतिनिधित्व करता है। सॉफ्टवेयर अनुप्रयोगों का उपयोग विभिन्न कार्यात्मक मापदंडों की गणना करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि एमआई समूह की तुलना में चित्रा 3 सी में शाम समूह के लिए इजेक्शन अंश का उच्च मूल्य।
चित्र 1: सर्जिकल सेटअप। (ए) प्रयोगात्मक समयरेखा का अवलोकन। (बी) पहले से गर्म हीटिंग पैड और ईसीजी इलेक्ट्रोड के लिए कनेक्शन के साथ ऑपरेटिंग टेबल। (सी) घर का बना रिट्रैक्टर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: प्रयोगात्मक प्रक्रिया और ईसीजी परिवर्तन। (ए) एंडोट्राचेल इंटुबैशन, त्वचा चीरा, थोराकोटॉमी, एलएडी पहचान, एलएडी बंधाव, और रीपरफ्यूजन की छवियां क्रमशः 1, 2, 3, 4, 5 और 6 में दिखाई गई हैं। (बी) बंधाव और पुनरावृत्ति के बाद एमआई और एमआईआरआई की विशिष्ट ईसीजी छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: प्रक्रिया के बाद सत्यापन। (ए) शाम, एमआईआरआई 24 एच, और एमआई 3 डी समूहों के बीच कार्डियक ट्रोपोनिन की अभिव्यक्ति। (बी) इवांस-ब्लू / टीटीसी 24 घंटे के समूहों के लिए शैम और एमआईआरआई के लिए डबल-स्टेनिंग। (सी) शाम और एमआई समूहों के लिए कार्डियक अल्ट्रासाउंड। LVID; डी, अंत-डायस्टोलिक बाएं वेंट्रिकुलर आंतरिक आयाम; LVID; एस, सिस्टोलिक बाएं वेंट्रिकुलर आंतरिक आयाम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
हाल के वर्षों में, नैदानिक और वैज्ञानिक अनुसंधान में एमआई और एमआईआरआई के लिए मॉडल का निर्माण तेजी से20,21 विकसित हुआ है। हालांकि, अभी भी कुछ प्रश्न हैं, जैसे कि कार्यों के तंत्र और एमआई / एमआईआरआई को कैसे सुधारना है, जिसे हल किया जाना चाहिए। यहां, एमआई और एमआईआरआई के मुराइन मॉडल की स्थापना के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। कई प्रमुख बिंदुओं पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए।
पहला मुख्य बिंदु एंडोट्राचेल इंटुबैशन है। कुछ प्रक्रियाओं6,9 में ग्रीवा की त्वचा का चीरा, ऊतक पृथक्करण, इसके बाद श्वासनली को देखने के लिए स्टर्नोहाइडियस मांसपेशियों का संपर्क शामिल है। इस तरह, शोधकर्ता श्वासनली में ट्यूब सम्मिलन की कल्पना कर सकता है। श्वसन संकट के जोखिम को कम करने के लिए यह एक अच्छा कदम है। वर्तमान विधि में, शोधकर्ता स्पष्ट रूप से एक प्रकाशक के नीचे सांस लेने के साथ ग्लोटिस के बंद होने और खुलने की कल्पना कर सकता है और फिर ट्यूब को आसानी से श्वासनली में डाल सकता है। इसलिए, त्वचा के आघात और संभावित संक्रमण को कम करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा का चीरा नहीं लगाया जाता है, जो भड़काऊ संकेतन पर शोध में महत्वपूर्ण है। नैदानिक श्वासनली इंटुबैशन में दृश्य लैरींगोस्कोप का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है: शायद उनका उपयोग चूहों में भी किया जा सकता है। मारेस एट अल.22 ने एंडोट्रेकियल इंटुबैशन के बिना निरंतर मास्क इनहेलेशन एनेस्थीसिया की सूचना दी, जो जानवर की नाक और मुंह पर रखे गैर-इनवेसिव मास्क के माध्यम से प्रशासित ऑक्सीजन के साथ 5% आइसोफ्लुरेन प्रेरण के बाद 2% आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन द्वारा किया गया था। यह ऊतक क्षति से बच सकता है और संज्ञाहरण की सुरक्षा और दक्षता में सुधार कर सकता है। हालांकि, एक विशेष इनहेलेशन एनेस्थीसिया मशीन की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, वाष्पशील एनेस्थेटिक्स ऑपरेटर को शारीरिक नुकसान पहुंचा सकता है।
दूसरा और सबसे महत्वपूर्ण महत्वपूर्ण बिंदु एलएडी की पहचान और बंधाव है। एलएडी पहचान और बंधाव में हर गलती असंगत परिणामों को जन्म देगी: या तो बहुत बड़ा इन्फ्रैक्ट आकार जिसके परिणामस्वरूप मृत्यु हो जाती है या बहुत छोटा इन्फ्रैक्ट आकार जिसके परिणामस्वरूप विफलता होती है। एलएडी की पहचान करने और इसके बंधाव को सत्यापित करने के लिए विभिन्न तरीकों को लागू किया जा सकता है। यहां, एलएडी का पता लगाने के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है। एलएडी आमतौर पर एक पतली लाल रेखा के रूप में दिखाई देता है जो शीर्ष के पास से लंबवत और बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से नीचे चलती है। एलएडी को अस्थायी रूप से (≤5 सेकंड प्रति समय) बढ़ाने के लिए चुने हुए बंधाव की स्थिति के नीचे साइट को धीरे से दबाकर, एलएडी को फिर से जांचा जा सकता है। बंधाव के बाद, एलएडी रोड़ा को बाएं वेंट्रिकल की पूर्ववर्ती दीवार में एक हल्के रंग और कुछ दिल की धड़कन के भीतर महत्वपूर्ण एसटी-ऊंचाई द्वारा सत्यापित किया जाता है। फिर, बंधाव को असंबद्ध किया जाता है, और 20 सेकंड के भीतर गुलाबी-लाल रंग में रंग परिवर्तन और ईसीजी पर एसटी-ऊंचाई के संभावित विघटन द्वारा रीपरफ्यूजन को मान्य किया जाता है। अंत में, ट्रोपोनिन-टी परीक्षण, टीटीसी धुंधला, और कार्डियक अल्ट्रासाउंड को मायोकार्डियल चोट का मूल्यांकन करने के लिए नियोजित किया जाता है। ये कई बीमा और पारस्परिक सत्यापन प्रयोगात्मक परिणामों को अत्यधिक विश्वसनीय बनाते हैं। इसके अलावा, माइक्रोमैनिपुलेशन उच्च सटीकता और कम जटिलताओं (जैसे, रक्तस्राव) को प्राप्त करता है। एक और महत्वपूर्ण मुद्दा यह धारणा है कि चूहों की रक्त वाहिकाएं सामान्य हैं, लेकिन वास्तव में, कुछ कोरोनरी धमनियां बहुत भिन्न होती हैं, और यहां तक कि संपार्श्विक परिसंचरण23,24 पेश कर सकता है। इसलिए, इन्फ्रैक्ट आकार कभी-कभी सुसंगत नहीं होते हैं, भले ही लिगेशन को समान स्तर पर माना जाता है। माइक्रोस्कोप के फायदे यहां प्रदर्शित किए गए हैं। बंधाव केवल अनुभव या शारीरिक स्थलों के आधार पर नहीं किया जा सकता है: एलएडी और इसकी दिशा को बंधाव से पहले स्पष्ट रूप से सत्यापित किया जाना चाहिए अन्यथा, परिणाम अविश्वसनीय होंगे। कुछप्रयोगों 6,8 में, चूहों को दिल के संपर्क के बाद बाएं वेंट्रिकल और कोरोनरी धमनियों की पूर्ववर्ती दीवार को देखने की सुविधा के लिए दाएं पार्श्व डेक्यूबिटस स्थिति में हैं।
इस मॉडल की दो मुख्य सीमाएं हैं। सबसे पहले, एलएडी बंधाव दाईं कोरोनरी धमनी के रोड़ा का अनुकरण नहीं कर सकता है। वास्तव में, जानवरों के बीच शारीरिक अंतर के कारण, एलएडी आमतौर पर चूहों और चूहों में हृदयके शीर्ष तक फैला होता है, और बाईं सर्कमफ्लेक्स शाखाएं विकसित नहीं होती हैं, इसलिए चूहों और चूहों में मॉडल एलएडी बंधाव द्वारा स्थापित किए जाते हैं। खरगोशों और सूअरों जैसे बड़े और मध्यम आकार के जानवरों के लिए, एलएडी अपेक्षाकृत छोटा है, जबकि बाईं सर्कमफ्लेक्स धमनी हृदय के एक बड़े क्षेत्र को कवर करती है, इसलिए मॉडल स्थापित करने के लिए बाएं सर्कमफ्लेक्स धमनी के बंधाव का चयन किया जाता है। सिकार्ड एट अल.26 ने चूहों में दाईं कोरोनरी धमनी को बंद करके राइट-वेंट्रिकुलर डिसफंक्शन और बाइवेंट्रिकुलर इंटरैक्शन की जांच करने के लिए एक नई विधि की सूचना दी, जो इस सीमा को दूर कर सकती है। दूसरी सीमा कोरोनरी-धमनी शरीर रचना विज्ञान27 और सर्जन के अनुभव में परिवर्तनशीलता के कारण एक असंगत इन्फ्रैक्ट आकार है। जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, माइक्रोस्कोप एलएडी और बंधाव से पहले इसकी दिशा को सत्यापित करके स्थिरता बढ़ाने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है, और एक अनुभवी शोधकर्ता के लिए, संवहनी शरीर रचना विज्ञान के पूर्ण मूल्यांकन के बाद बंधाव की स्थिति को समायोजित करना प्राप्त किया जा सकता है।
कुछ अन्य मुद्दों का उल्लेख किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, थोराकोटॉमी और सुई-छेदने से अनिवार्य रूप से मांसपेशियों और मायोकार्डियम को मामूली नुकसान होगा, जिसका सूजन पर प्रभाव पड़ सकता है। इसके अलावा, एनाल्जेसिक एजेंटों को एमआई28 पर प्रभाव होने की सूचना दी गई थी। इसलिए, एमआई पर सूजन या इसके प्रभावों का विश्लेषण करते समय इन कारकों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। समस्या निवारण के लिए, कई कारक हैं जो चूहों की मृत्यु का कारण बनेंगे। उदाहरण के लिए, मायोकार्डियल इन्फ्रैक्ट, एनेस्थेटिक दुर्घटना और रक्तस्राव से संबंधित जटिलताएं। इसके अलावा, असंगत परिणाम मुख्य रूप से अनुचित बंधाव स्थितियों से आते हैं: बहुत अधिक बंधाव की स्थिति चूहों की मृत्यु तक बहुत बड़े इन्फ्रैक्ट आकार को प्रेरित करेगी; इस बीच, एलएडी की झूठी पहचान के परिणामस्वरूप मॉडल विफलता होगी। इस विधि में कुछ विवरणों में सुधार करने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, यह बेहतर होगा यदि प्रक्रिया के दौरान तापमान की निगरानी के लिए एक रेक्टल जांच डाली जा सकती है। अंतिम लेकिन कम से कम, प्रयोगकर्ता को पशु अध्ययन और नैदानिक वास्तविकताओं के बीच अंतर को ध्यान में रखना चाहिए, खासकर कि 30 मिनट इस्किमिया समय वास्तव में नैदानिक के लिए काफी कम है। हम शोधकर्ता को इस्किमिया समय सहित अपने प्रयोग डिजाइन के अनुसार चरणों की व्यवस्था करने के लिए प्रोत्साहित करते हैं। केवल इस तरह से यह प्रोटोकॉल एमआई / एमआईआरआई और दवा की खोज के तंत्र और उपचार के अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है।
संक्षेप में, MIRI और MI के लिए एक सरल और प्रजनन मुराइन मॉडल प्रदान किया जाता है। इस मॉडल का उपयोग एमआई / एमआईआरआई तंत्र और चिकित्सीय अनुसंधान के अध्ययन के लिए किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82070317, जिबिन लिन के 81700390, बिंगजी एलवी के 8210021880 और बोयुआन वांग के 82000428) और चीन के राष्ट्रीय कुंजी आर एंड डी कार्यक्रम (2017वाईएफए 0208000 से शाओलिन हे) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9 % sodium chloride solution | Kelun Industry Group,China | - | |
| 4% paraformaldehyde fixing solution | Servicebio,China | G1101 | - |
| 4-0 silk suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China | C412 | - |
| 8-0 suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China | H801 | - |
| Buprenorphine | IsoReag,China | IR-11190 | - |
| Camera | Canon,Japan | EOS 80D | - |
| Depilatory cream | Veet,French | - | |
| Elecsys Troponin T hs STAT | Roche,Germany | - | |
| Electrochemical luminescence immunoanalyzer | Roche,Germany | Elecsys 2010 | - |
| Evans blue | Sigma,America | E2129 | - |
| Eye scissors | Shanghai Medical Instruments,China | JC2303 | - |
| Haemostatic forceps | Shanghai Medical Instruments,China | J31020 | - |
| High frequency in vivo imaging systems | Visualsonics,Canada | Vevo2100 | - |
| Ibuprofen | PerFeMiKer,China | CLS-12921 | - |
| Intravenous catheter | Introcan,Germany | 4254090B | - |
| Ketamine | Sigma-Aldrich,America | K2753 | - |
| Medical alcohol | Huichang ,China | - | |
| Microneedle holders | Shanghai Medical Instruments,China | WA2040 | - |
| Microscopic shears | Shanghai Medical Instruments,China | WA1040 | - |
| Microsurgical forceps | Shanghai Medical Instruments,China | WA3020 | - |
| Mouse electrocardiograph | Techman,China | BL-420F | - |
| Needle holders | Shanghai Medical Instruments,China | JC3202 | - |
| operating floor | Chico,China | ZK-HJPT | - |
| PE-10 tube | Huamei,China | - | |
| Pentobarbital | Merck,America | 1030001 | - |
| Rodent Ventilator | Shanghai Alcott Biotech,China | ALC-V8S-P | - |
| Stereo microscope | Aomei Industry,China | SZM0745-STL3-T3 | - |
| Surgical thermostatic heating pad | Globalebio, China | GE0-20W | - |
| Triphenyltetrazolium chloride | Servicebio,China | G1017 | - |
| Xylazine | Huamaike Biochemicals and Life Science Research Prouducts,China | 323004 | - |
References
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