Summary
Descrevemos um método simples e reprodutível que pode induzir infarto do miocárdio ou lesão de isquemia-reperfusão miocárdica em camundongos por ligadura precisa da artéria coronária descendente anterior esquerda através de micromanipulação.
Abstract
O infarto agudo do miocárdio é uma doença cardiovascular comum e com alta mortalidade. A lesão de reperfusão miocárdica pode neutralizar os efeitos benéficos do refluxo cardíaco e induzir lesão miocárdica secundária. Um modelo simples e reprodutível de infarto do miocárdio e lesão de isquemia-reperfusão miocárdica é uma boa ferramenta para os pesquisadores. Aqui, um método personalizável para criar um modelo de infarto do miocárdio (IM) e MIRI por ligadura de precisão da artéria coronária descendente anterior (DA) por meio de micromanipulação é descrito. O posicionamento preciso e reprodutível da ligadura da DA ajuda a obter resultados consistentes para lesão cardíaca. As alterações no segmento ST podem ajudar a identificar a precisão do modelo. O nível sérico de troponina T cardíaca (cTnT) é usado para avaliar a lesão miocárdica, o ultrassom cardíaco é empregado para avaliar a função sistólica miocárdica e a coloração de Evans-Blue/cloreto de trifenil tetrazólio é usada para medir o tamanho do infarto. Em geral, esse protocolo reduz a duração do procedimento, garante o tamanho controlável do infarto e melhora a sobrevida do camundongo.
Introduction
O infarto agudo do miocárdio (IAM) é uma doença cardiovascular comum em todo o mundo e acarreta altamortalidade1. O avanço das tecnologias torna a revascularização precoce e eficaz disponível para pacientes com IAM. Após esses tratamentos, em alguns pacientes, pode ocorrer lesão de isquemia-reperfusão miocárdica (MIRI)2. Assim, é de grande importância compreender os mecanismos de ações e como melhorar o MI/MIRI. Camundongos são amplamente utilizados como modelos devido ao seu baixo custo, rápido tempo de reprodução e facilidade para realizar alteraçõesgenéticas 3. Estudiosos têm desenvolvido diferentes métodos para modelar MIRI e IM em animais 4,5,6,7,8,9. Essa estratégia favorece a pesquisa, mas os diferentes critérios e métodos empregados dificultam a interpretação dos resultados entre as equipes de pesquisa.
Em camundongos, o IM foi induzido por isoproterenol10, criolesão 11,12 ou cauterização13. O IM pode ser induzido prontamente pelo isoproterenol, mas o processo fisiopatológico é diferente daquele do IM clínico. O IM induzido por cauterização é bem diferente do processo natural do infarto do miocárdio, e a reação inflamatória na área queimada é mais intensa; Além disso, a abordagem cirúrgica apresenta dificuldades técnicas. Além disso, existem algunslaboratórios14 desenvolvendo modelo de IM em miniporcos utilizando o método de bloqueio por balão ou embolização ou trombose através de técnica intervencionista. Todos esses métodos podem causar oclusão da artéria coronária diretamente, mas a necessidade de dispositivos de angiografia coronariana e, acima de tudo, das artérias coronárias de camundongo muito finas torna essas operações pouco práticas. Para a MIRI, as diferenças entre os diferentes modelos foram bastante modestas, como usar ou não respiradores/micromanipulação 5,6.
Aqui é descrito um método simples e confiável que pode induzir IM e o modelo MIRI, adaptado de métodos previamente publicados4,5,6,7,8,9,15. Este método pode simular processos fisiopatológicos pelo bloqueio direto da DA através da ligadura. Além disso, ao aliviar a ligadura, esse modelo também pode simular lesão de reperfusão. Neste protocolo, um microscópio dissecante é utilizado para visualização da DAD. Em seguida, o pesquisador pode identificar prontamente a LAD. Posteriormente, a ligadura precisa da DAE leva à oclusão sanguínea reprodutível e previsível e isquemia ventricular. Além disso, alterações eletrocardiográficas (ECG) podem ser usadas para confirmar isquemia e reperfusão, além das mudanças de cor da DA observadas ao microscópio. Essa estratégia leva a uma menor duração do procedimento, menor risco de complicações cirúrgicas e menos camundongos experimentais necessários. Os métodos para o teste de troponina-T, ultrassom cardíaco e coloração de cloreto de trifenil tetrazólio (TTC) também são descritos. Em geral, este protocolo é útil para estudos do mecanismo MI/MIR, bem como para a descoberta de drogas.
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Protocol
Os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Utilização de Animais da Universidade de Ciência e Tecnologia de Huazhong (Wuhan, China).
NOTA: Camundongos C57BL/6J machos (8-10 semanas) são usados como modelos. Os camundongos têm livre acesso a comida e água e são criados em condições específicas livres de patógenos. A sala é mantida sob temperatura controlada (22 °C ± 2 °C) e umidade (45%-65%). Os ratos são expostos a um ambiente claro/escuro de 12 horas no Centro de Cuidados com Animais da Faculdade de Medicina de Tongji (Wuhan, China), de acordo com as diretrizes estabelecidas por esta instituição. Use instrumentos microcirúrgicos estéreis e suprimentos cirúrgicos. Luvas cirúrgicas e máscaras são obrigatórias durante todo o procedimento. O fluxo de trabalho experimental é mostrado na Figura 1A.
1. Preparo pré-operatório
- Utilizar mesa cirúrgica retangular (ST) com bolsa térmica pré-aquecida (37 °C) durante todo o procedimento cirúrgico (Figura 1B). Desinfetar a prancha com luz ultravioleta e álcool 70% antes do início do procedimento.
- Pesar todos os ratos com precisão para calcular a dose de drogas anestésicas necessárias. Em seguida, anestesiar os camundongos com cetamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) por injeção intraperitoneal. Garantir a profundidade adequada da anestesia pela ausência de um reflexo de retirada para os reflexos de pinçamento dos dedos dos pés e piscar.
- Coloque o rato em decúbito dorsal no TO com gaze sob a cabeça para evitar o superaquecimento dos olhos. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar que eles sequem.
- Faça a barba no peito precordial esquerdo com uma navalha elétrica. Use um creme de remoção de pelos no tórax pré-raspado e massageie uniformemente com um cotonete estéril por ~1 min. Limpe o excesso de pelos soltos com gaze.
- Use iodopovidona, seguido de álcool a 70% para limpar a área. Cubra o tórax com gaze.
- Use uma sutura 4-0 sob os incisivos superiores e fixe-a no ponto de ancoragem (próximo à borda do ST sobre o nariz) para manter a boca levemente aberta e facilitar a canulação.
- Puxe a cauda para manter o corpo reto e prenda a cauda ao TO usando fita adesiva. Fixe os quatro membros e aperte-os nos outros pontos de ancoragem. É importante ressaltar que não estique demais os membros dianteiros; caso contrário, pode ocorrer comprometimento respiratório.
- Use pinças curvas e pinças para abrir a mandíbula e levantar a língua. Use um iluminador para visualizar claramente a garganta e a glote.
- Insira uma cânula de 22 G suavemente com uma agulha embotada e truncada na traqueia através da boca ~1 cm abaixo da garganta. Use uma mão para segurar a língua, mova-a levemente para cima com pinça romba e, simultaneamente, use a outra mão para inserir suavemente o tubo na traqueia. Tenha cuidado para não inserir o tubo no esôfago.
- Retire a agulha delicadamente. Verifique a intubação colocando o tubo na água para formar bolhas antes de se conectar ao ventilador.
- Conecte o tubo endotraqueal a um ventilador regulado para 120/min e o volume corrente ajustado para 250 μL.
NOTA: A configuração do ventilador é ajustada pelo peso corporal (em geral, um peso corporal mais alto requer um volume corrente mais alto). - Verificar a intubação verificando a expansibilidade torácica bilateral simétrica. Em seguida, a conexão é fixada ao TO com fita adesiva para evitar que o tubo caia.
- Coloque eletrodos de ECG nas patas e conecte-os ao gravador de ECG. Monitorar a eletrofisiologia cardíaca durante todo o procedimento.
2. Toracotomia
- Retire a gaze no tórax. Desinfetar novamente com álcool a 70% para as áreas de incisão usando três ciclos de esfoliação. Em seguida, cubra o rato com um pano cirúrgico estéril com um orifício sobre o campo cirúrgico para reduzir a contaminação do local cirúrgico.
- Fazer uma incisão oblíqua na pele (0,8-1,0 cm) ao longo da linha hemiclavicular esquerda com bisturi estéril.
- Realizar dissecção romba dos tecidos subcutâneos para expor as costelas por baixo. Tenha cuidado para não ferir vasos, costelas e pulmões. Pare o sangramento usando aplicadores de algodão estéreis.
- Identificar e fazer uma incisão de cerca de 6-8 mm no terceiro espaço intercostal. Em seguida, realizar dissecção romba dos tecidos no espaço intercostal para abrir a cavidade torácica. Tenha cuidado para não lesionar a artéria torácica interna.
- Use pinças para cobrir o espaço intercostal. Insira afastadores caseiros pré-esterilizados (Figura 1C) na caixa torácica e puxe para trás para espalhar a incisão até ~6 mm de largura. Fixe os afastadores ao TO com elásticos.
- Remova os tecidos circundantes cuidadosamente para expor o coração completamente. Puxe o pericárdio suavemente com pinças curvas sem ferir o coração. Agora uma visão clara do coração está disponível.
3. Ligadura do LAD
NOTA: A MAD aparece como uma linha vermelha fina que corre perpendicularmente perto do ápice e para baixo através do ventrículo esquerdo. O LAD é de cor vermelho-vivo, por isso tenha cuidado para não confundi-lo com uma veia. Geralmente, o local da ligadura está ~1-2 mm abaixo da aurícula esquerda. Essa posição de ligadura produzirá cerca de 40%-50% da isquemia no ventrículo esquerdo. Uma posição mais alta criará uma zona de infarto mais extensa. Um local mais distal criará uma zona de infarto menor.
- Use um microscópio dissecante e direcione uma luz focalizada e apropriada para visualização da LAD. Pressione o local abaixo da posição de ligadura escolhida suavemente para ampliar temporariamente a DA (≤5 s por vez). Verifique novamente o LAD desta forma.
- Use uma agulha cônica (3/8, 2,5 x 5) para passar um 8-0 ligadura de seda sob o LAD sob um microscópio dissecante. Tenha cuidado com a profundidade da agulha: não muito profunda para entrar no ventrículo esquerdo e não muito rasa para evitar danificar a LAD.
- Amarre a ligadura com um nó duplo solto. O diâmetro do laço é de cerca de 2-3 mm.
- Coloque um tubo PE-10 de 2-3 mm em uma alça paralela à artéria.
- Aperte a alça de ligadura suavemente até que fique ao redor da artéria e da tubulação. Em seguida, prenda o laço com um slipknot. Tome cuidado para não danificar a parede miocárdica com pressão de aperto excessiva.
NOTA: A ligadura não é realizada para o grupo de operação simulada. - Confirmar cessação do fluxo sanguíneo na DAE: observar coloração mais pálida na parede anterior do VE após a ligadura. Além disso, elevação significativa do segmento ST em poucos batimentos cardíacos também indica oclusão16. Se for necessária a ligadura permanente (por exemplo, MI), remova a tubulação PE-10 e amarre a LAD diretamente com um nó. Retome o procedimento restante conforme mencionado na etapa 4.3 abaixo.
- Retire os afastadores da incisão. Em seguida, feche a ferida temporariamente com uma braçadeira de buldogue. A duração da isquemia está de acordo com o desenho experimental. Certifique-se de que o rato continua ligado ao ventilador.
4. Reperfusão
- Quando o período de isquemia terminar, remova a pinça do buldogue e insira os afastadores novamente para abrir a incisão e expor o coração (especialmente o local da ligadura).
- Desamarre o slipknot e remova a tubulação PE-10. Confirme a restauração do fluxo sanguíneo nesta etapa, observando a mudança de cor de volta para rosa-vermelho dentro de 20 s. Simultaneamente, observe atentamente o ECG: uma possível dissolução do supradesnivelamento do segmento ST também sugere reperfusão.
- Deixe o 8-0 ligadura in situ para posterior coloração Evans-Blue e TTC. Em outros casos, remova a sutura nesta etapa.
- Retirar os afastadores e fechar a incisão suturando a terceira e quarta costelas com fio de náilon 4-0. Tenha cuidado para não ferir o pulmão. Empurre para fora o ar que pode estar preso na cavidade torácica pressionando o tórax suavemente enquanto amarra os nós de sutura.
- Fechar as camadas musculares com suturas contínuas. Fechar a pele com fio de náilon 4-0; suturas contínuas e suturas interrompidas são aceitáveis.
5. Cuidados pós-operatórios
- Observe o rato cuidadosamente para sinais de recuperação da anestesia, por exemplo, movimento da cauda ou bigodes. Depois disso, o rato geralmente retoma um padrão respiratório normal com uma taxa de respiração de cerca de 150 bpm. Extubar o rato removendo o tubo lentamente.
- Monitore o mouse por mais 3-5 minutos para garantir que o desconforto respiratório esteja ausente.
- Administrar 100 μL de buprenorfina (0,1 mg/mL, s.c.) após o camundongo começar a respirar. Para as próximas 24 h, forneça uma dose adicional a cada 4-6 h. Fornecer ibuprofeno como alívio adicional da dor em água potável como uma solução de 0,2 mg/mL por 2 dias antes e ≤7 dias após a cirurgia.
- Mantenha os camundongos aquecidos e reduza o risco de mortalidade usando mantas de isolamento térmico, pois os camundongos são propensos à hipotermia após a anestesia.
6. Validação após o procedimento
- Teste da troponina T
- Coletar amostras de sangue dos plexos retroorbitários e isolar os soros por centrifugação (3.000 × g, 10 min, temperatura ambiente).
- Diluir 20 μL de soro para 100 μL com solução salina para o teste de troponina-T. Conservar o restante das amostras a -80 °C.
- Detectar a troponina T (cTnT usando um kit comercial seguindo as instruções do fabricante.
- Ultrassom cardíaco
OBS: O ultrassom cardíaco é utilizado para avaliar a função cardíaca e anormalidades da motilidade segmentar em diferentes estágios antes e após a cirurgia, de acordo com o desenhoexperimental17,18. Diferentes parâmetros como espessura da parede ventricular, volume ventricular, diâmetro da cavidade ventricular, fração de ejeção e fração de encurtamento do eixo curto são medidos.- Anestesiar os camundongos com cetamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) por injeção intraperitoneal.
- Faça a barba no peito com uma navalha elétrica. Use creme de depilação e massageie uniformemente. Limpe o excesso de pelos soltos com gaze.
- Coloque o mouse sobre o TO e prenda os quatro membros com fita adesiva.
- Coloque a sonda de ultrassom (30 MHz) na região anterior do coração a ~ 30° do esterno. A sonda nesta vista está alinhada com o longo eixo do coração. Ajuste o ultrassom no modo B; O ventrículo esquerdo, o átrio esquerdo, a valva mitral e a aorta ascendente podem ser claramente identificados. Use a captura de vídeo para obter dados para análise subsequente.
- Ao girar o transdutor 90° no sentido horário, obtém-se uma visão paraesternal de eixo curto ao nível dos músculos papilares para detectar claramente os ventrículos esquerdo e direito. Em seguida, use o modo B e o modo M para avaliar a função cardíaca e a morfometria.
- Calcular o diâmetro diastólico final do ventrículo esquerdo (Dd), o diâmetro sistólico final (Ds) e a espessura do septo interventricular especificando a localização correspondente nas imagens ultrassonográficas.
NOTA: O aparelho calcularia manualmente o volume diastólico final do ventrículo esquerdo (VDFVE) e o volume sistólico final (VSFVE). Além disso, a máquina calcularia os valores de fração de encurtamento (FS) e fração de ejeção (FE) usando fórmulas FS = (Dd-Ds)/Dd × 100% e EF= (VEVD-VVESV)/CVVEDV × 100%. Escolha cinco ciclos cardíacos consecutivos e obtenha seus valores médios.
- Medida do tamanho do infarto do miocárdio
NOTA: A coloração Evans-Blue/TTC é utilizada para medir o tamanho do infarto, pois pode avaliar a viabilidade tecidual19. Recomenda-se manchar dentro de 72 h da reperfusão, pois a cicatriz diminuirá. Esta etapa é realizada após a eutanásia do animal com 200 mg/kg de pentobarbital sódico via injeção intraperitoneal.- Expor o coração novamente seguindo os procedimentos anteriores dos passos 2.2-2.5. Em seguida, religa-se a DA no local inicial validado pela sutura citada no passo 4.3, ao final do tempo de reperfusão desejado.
- Cânular a aorta e, em seguida, perfundir o coração com 0,3 mL de solução de Azul de Evans a 1%. O miocárdio da região não isquêmica está corado de azul. Após a perfusão, remova o coração rapidamente cortando a aorta com tesoura.
- Em seguida, lave o coração em solução de KCl (30 mM) para impedir que o coração bata. Conservar a -20 °C durante ≥4 h após a remoção do tecido adiposo circundante.
- Corte o coração no sentido transversal em cinco fatias de espessura de 1 mm usando um bisturi afiado. Pesar as fatias e, em seguida, incubá-las com TTC a 2% durante 40 min a 37 °C.
NOTA: Após a incubação, as áreas de infarto são demarcadas como brancas, enquanto os tecidos viáveis nas áreas não infartadas permanecem vermelhos. - Fixe as fatias com formol a 4% durante a noite.
NOTA: Esta ação irá aumentar o contraste entre a área de infarto e a área não infartada. Também vai encolher as fatias. - Fotografe as fatias com uma câmera digital. Em seguida, calcule a área de risco (RAA), a área de infarto e a zona não isquêmica usando software gráfico.
NOTA: Após a dupla coloração Evans-Blue/TTC, a área azul é a área "normal". As demais áreas (incluindo branco e vermelho) são as áreas de "risco de isquemia": a área branca é a área de infarto do miocárdio (AI) e a área vermelha é a área isquêmica (mas não infartada). Levando em conta a inconsistência de tamanhos de fatias de coração, os resultados são ajustados para o peso.
Atribuir:
A1-A5 para Área da zona de infarto/Área do corte do coração;
B1-B5 para Área da zona não infarta/ Área do corte do coração;
W1-W5 para Peso da fatia do coração.
Então:
Peso total do miocárdio infartado: W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5;
Peso total do miocárdio não infartado: W1 × B1 + W2 × B2 + W3 × B3 + W4 × B4+ W5 × B5;
Peso total do RAA = (W1 + W2 +W3 + W4 + W5) - (W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5)
Finalmente:
A área de isquemia miocárdica é calculada como a porcentagem de RAA no ventrículo esquerdo:
A área de infarto do miocárdio é calculada como a porcentagem de IA no RAA:
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Representative Results
O fluxo de trabalho experimental é mostrado na Figura 1A. O pesquisador pode programar os nós de tempo de acordo com o desenho experimental no início do estudo. A duração da ligadura da DAE está de acordo com o objetivo da pesquisa. Para o IM, a pesquisa pode ignorar a etapa de reperfusão. A ultrassonografia cardíaca está disponível em diferentes estágios do estudo porque não é invasiva, enquanto a coloração Evans-Blue/TTC pode ser realizada apenas quando o camundongo é sacrificado. Para pesquisas que se concentram em fibrose e remodelamento ventricular, o tempo de observação é muito maior.
As imagens típicas de parte do processo experimental são mostradas na Figura 2A, desde intubação endotraqueal, incisão na pele, toracotomia, identificação da ADA, ligadura da DA à reperfusão. Para verificar isquemia e reperfusão miocárdica, as imagens representativas do ECG com supradesnivelamento significativo do segmento ST após a ligadura e dissolução do supradesnivelamento do segmento ST quando o nó deslizante é desatado são mostradas na Figura 2B.
Após a obtenção de amostras de sangue de todos os camundongos, o teste de troponina-T pode ser realizado para validar o infarto. A Figura 3A mostra um aumento significativo da cTnT nos grupos MIRI e IM quando comparados com os grupos sham. A Figura 3B demonstra a dupla coloração de Evans-Blue e TTC por cinco cortes transversais consecutivos do coração entre o grupo sham e o grupo MIRI. A área azul sugere a área normal, a área branca sugere a área de infarto do miocárdio e a área vermelha sugere a área isquêmica, mas não infartada. A Figura 3C representa as imagens de eixo longo do ultrassom cardíaco entre o grupo sham e o grupo IM. Aplicativos de software podem ser usados para calcular diferentes parâmetros funcionais, como um maior valor de fração de ejeção para o grupo sham na Figura 3C em comparação com o grupo MI.
Figura 1: Arranjo cirúrgico. (A) Visão geral da linha do tempo experimental. (B) Mesa cirúrgica com almofada térmica pré-aquecida e conexão para eletrodos de ECG. (C) Afastadores artesanais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Processo experimental e alterações no ECG. (A)Imagens de intubação endotraqueal, incisão na pele, toracotomia, identificação da ADA, ligadura da DA e reperfusão são mostradas em 1, 2, 3, 4, 5 e 6, respectivamente. (B) Imagens típicas de ECG de IM e MIRI após ligadura e reperfusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Validação após o procedimento. (A) Expressão de troponina cardíaca entre os grupos sham, MIRI 24 h e MI 3 d. (B) Evans -Blue/ TTC de dupla coloração para grupos sham e MIRI 24 h. (C) Ultrassonografia cardíaca para os grupos sham e IM. LVID; d, dimensão interna do ventrículo esquerdo diastólica final; LVID; s, dimensão interna sistólica do ventrículo esquerdo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nos últimos anos, a criação de modelos para IM e MIRI em pesquisas clínicas e científicas tem se desenvolvido rapidamente20,21. No entanto, ainda existem algumas questões, como os mecanismos de ações e como melhorar o MI/MIRI, que devem ser resolvidas. Aqui, um protocolo modificado para estabelecer um modelo murino de IM e MIRI é descrito. Vários pontos-chave devem ser considerados com cuidado.
O primeiro ponto-chave é a intubação endotraqueal. Algunsprocedimentos6,9 envolvem incisão da pele cervical, separação dos tecidos, seguida de exposição do músculo esterno-hioideo para visualização da traqueia. Dessa forma, o pesquisador pode visualizar a inserção do tubo na traqueia. Este é um bom passo para reduzir o risco de desconforto respiratório. No método atual, o pesquisador pode visualizar claramente o fechamento e a abertura da glote com a respiração sob um iluminador e, em seguida, inserir o tubo na traqueia facilmente. Assim, uma incisão cervical não é feita para reduzir o trauma cutâneo e possíveis infecções, o que é importante na pesquisa sobre sinalização inflamatória. Os laringoscópios visuais são amplamente utilizados na intubação traqueal clínica: talvez possam ser usados também em camundongos. Mares et al.22 relataram a anestesia inalatória contínua por máscara sem intubação endotraqueal, que foi realizada por inalação de isoflurano a 2% após indução de isoflurano a 5% com oxigênio administrado por máscara não invasiva colocada sobre o nariz e a boca do animal. Pode evitar danos teciduais e melhorar a segurança e eficiência da anestesia. No entanto, um aparelho especial de anestesia inalatória é necessário. Além disso, os anestésicos voláteis podem causar danos físicos ao operador.
O segundo e mais importante ponto-chave é a identificação e ligadura da LAC. Cada erro na identificação e ligadura da DA levará a resultados inconsistentes: ou tamanho de infarto muito grande resultando em morte ou tamanho de infarto muito pequeno resultando em falha. Vários métodos podem ser aplicados para identificar a DA e verificar sua ligadura. Aqui, um microscópio de dissecção é usado para localizar a LAD. A DAE geralmente aparece como uma fina linha vermelha perpendicular perto do ápice e descendo através do ventrículo esquerdo. Pressionando o local abaixo da posição de ligadura escolhida suavemente para ampliar temporariamente a DA (≤5 s por vez), a DA pode ser verificada novamente. Após a ligadura, a oclusão da DA é verificada por uma coloração mais pálida na parede anterior do ventrículo esquerdo e elevação significativa do segmento ST em poucos batimentos cardíacos. Em seguida, a ligadura é desamarrada e a reperfusão é validada por uma mudança de cor de volta para rosa-avermelhado dentro de 20 s e potencial dissolução do supradesnivelamento do segmento ST no ECG. Finalmente, o teste da troponina-T, a coloração do TTC e o ultrassom cardíaco são empregados para avaliar a lesão miocárdica. Esses múltiplos seguros e verificações mútuas tornam os resultados experimentais altamente confiáveis. Além disso, a micromanipulação provoca maior acurácia e menos complicações (por exemplo, sangramento). Outra questão importante é a suposição de que os vasos sanguíneos de camundongos são normais, mas, de fato, algumas artérias coronárias variam muito, e até mesmo a circulação colateral pode seapresentar23,24. Assim, os tamanhos dos infartos, às vezes, não são consistentes, embora as ligaduras sejam consideradas no mesmo nível. As vantagens do microscópio são exibidas aqui. A ligadura não pode ser feita com base apenas na experiência ou em pontos anatômicos: a DA e sua direção devem ser verificadas claramente antes da ligadura, caso contrário, os resultados não serão confiáveis. Em algunsexperimentos6,8, camundongos são posicionados em decúbito lateral direito para a conveniência de observar a parede anterior do ventrículo esquerdo e artérias coronárias após exposição cardíaca.
Este modelo tem duas limitações principais. Primeiro, a ligadura da DA não pode simular oclusão da artéria coronária direita. De fato, devido às diferenças anatômicas entre osanimais25, a DAE geralmente se estende até o ápice do coração em camundongos e ratos, e os ramos circunflexos esquerdos não são desenvolvidos, de modo que os modelos em camundongos e ratos são estabelecidos pela ligadura da LAD. Para animais de grande e médio porte, como coelhos e porcos, a DAE é relativamente curta, enquanto a artéria circunflexa esquerda cobre uma grande área do coração, de modo que a ligadura da artéria circunflexa esquerda é selecionada para estabelecer o modelo. Sicard e cols.26 relataram um novo método para investigar disfunção ventricular direita e interação biventricular por meio da ligadura da artéria coronária direita em camundongos, o que poderia sanar essa limitação. A segunda limitação é o tamanho inconsistente do infarto devido à variabilidade da anatomia das artérias coronárias27 e à experiência do cirurgião. Como discutido acima, o microscópio é muito importante para aumentar a consistência, verificando a DA e sua direção antes da ligadura, e para um pesquisador experiente, o ajuste da posição da ligadura após uma avaliação completa da anatomia vascular pode ser obtido.
Algumas outras questões merecem destaque. Por exemplo, a toracotomia e a perfuração por agulha inevitavelmente causarão danos leves aos músculos e ao miocárdio, o que pode ter efeitos sobre a inflamação. Além disso, agentes analgésicos foram relatados como tendo efeitos sobre o IM28. Assim, esses fatores devem ser levados em consideração ao analisar a inflamação ou seus efeitos sobre o IM. Para a solução de problemas, existem vários fatores que levariam à morte de ratos. Por exemplo, complicações relacionadas a infarto do miocárdio, acidente anestésico e sangramento. Além disso, os resultados inconsistentes provêm principalmente de posições inadequadas de ligadura: uma posição de ligadura muito alta induziria a um tamanho de infarto muito grande, mesmo a morte de camundongos; enquanto isso, a falsa identificação da LAD resultaria em falha do modelo. Alguns detalhes precisam ser melhorados neste método. Por exemplo, seria melhor se uma sonda retal pudesse ser inserida para monitorar a temperatura durante o procedimento. Por último, mas não menos importante, o experimentador deve ter em mente as diferenças entre os estudos em animais e as realidades clínicas, especialmente que o tempo de isquemia de 30 min é realmente bastante curto para o clínico. Encorajamos o pesquisador a organizar as etapas de acordo com seu desenho experimental, incluindo o tempo de isquemia. Somente assim este protocolo pode ser útil para estudos do mecanismo e tratamento do IM/MIRI e descoberta de drogas.
Em suma, um modelo murino simples e reprodutivo para MIRI e MI é fornecido. Este modelo pode ser utilizado para o estudo dos mecanismos do IM/MIRI e pesquisa terapêutica.
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Disclosures
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82070317, 81700390 para Jibin Lin, 8210021880 para Bingjie Lv e 82000428 para Boyuan Wang) e o Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China ( 2017YFA0208000 para Shaolin He).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9 % sodium chloride solution | Kelun Industry Group,China | - | |
| 4% paraformaldehyde fixing solution | Servicebio,China | G1101 | - |
| 4-0 silk suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China | C412 | - |
| 8-0 suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China | H801 | - |
| Buprenorphine | IsoReag,China | IR-11190 | - |
| Camera | Canon,Japan | EOS 80D | - |
| Depilatory cream | Veet,French | - | |
| Elecsys Troponin T hs STAT | Roche,Germany | - | |
| Electrochemical luminescence immunoanalyzer | Roche,Germany | Elecsys 2010 | - |
| Evans blue | Sigma,America | E2129 | - |
| Eye scissors | Shanghai Medical Instruments,China | JC2303 | - |
| Haemostatic forceps | Shanghai Medical Instruments,China | J31020 | - |
| High frequency in vivo imaging systems | Visualsonics,Canada | Vevo2100 | - |
| Ibuprofen | PerFeMiKer,China | CLS-12921 | - |
| Intravenous catheter | Introcan,Germany | 4254090B | - |
| Ketamine | Sigma-Aldrich,America | K2753 | - |
| Medical alcohol | Huichang ,China | - | |
| Microneedle holders | Shanghai Medical Instruments,China | WA2040 | - |
| Microscopic shears | Shanghai Medical Instruments,China | WA1040 | - |
| Microsurgical forceps | Shanghai Medical Instruments,China | WA3020 | - |
| Mouse electrocardiograph | Techman,China | BL-420F | - |
| Needle holders | Shanghai Medical Instruments,China | JC3202 | - |
| operating floor | Chico,China | ZK-HJPT | - |
| PE-10 tube | Huamei,China | - | |
| Pentobarbital | Merck,America | 1030001 | - |
| Rodent Ventilator | Shanghai Alcott Biotech,China | ALC-V8S-P | - |
| Stereo microscope | Aomei Industry,China | SZM0745-STL3-T3 | - |
| Surgical thermostatic heating pad | Globalebio, China | GE0-20W | - |
| Triphenyltetrazolium chloride | Servicebio,China | G1017 | - |
| Xylazine | Huamaike Biochemicals and Life Science Research Prouducts,China | 323004 | - |
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