Summary
Qui descriviamo un metodo semplice e riproducibile che può indurre infarto miocardico o danno da ischemia-riperfusione miocardica nei topi mediante legatura di precisione dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra attraverso la micromanipolazione.
Abstract
L'infarto miocardico acuto è una malattia cardiovascolare comune con elevata mortalità. Il danno da riperfusione miocardica può contrastare gli effetti benefici del reflusso cardiaco e indurre un danno miocardico secondario. Un modello semplice e riproducibile di infarto miocardico e danno da ischemia-riperfusione miocardica è un buon strumento per i ricercatori. Qui, viene descritto un metodo personalizzabile per creare un modello di infarto del miocardio (MI) e MIRI mediante legatura di precisione dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) attraverso la micromanipolazione. Il posizionamento accurato e riproducibile della legatura del LAD aiuta a ottenere risultati coerenti per le lesioni cardiache. Le modifiche del segmento ST possono aiutare a identificare l'accuratezza del modello. Il livello sierico di troponina T cardiaca (cTnT) viene utilizzato per valutare la lesione miocardica, l'ecografia cardiaca viene impiegata per valutare la funzione sistolica miocardica e la colorazione con cloruro di Evans-Blue/trifeniltetrazolio viene utilizzata per misurare le dimensioni dell'infarto. In generale, questo protocollo riduce la durata della procedura, garantisce dimensioni dell'infarto controllabili e migliora la sopravvivenza del topo.
Introduction
L'infarto miocardico acuto (IMA) è una malattia cardiovascolare comune in tutto il mondo e comporta un'elevata mortalità1. I progressi nelle tecnologie rendono disponibile una rivascolarizzazione precoce ed efficace per i pazienti con IMA. Dopo questi trattamenti, in alcuni pazienti, può verificarsi un danno da ischemia-riperfusione miocardica (MIRI)2. Pertanto, è di grande importanza comprendere i meccanismi delle azioni e come migliorare l'MI/MIRI. I topi sono ampiamente utilizzati come modelli a causa del loro basso costo, dei tempi di riproduzione rapidi e della facilità di apportare alterazioni genetiche3. Gli studiosi hanno sviluppato diversi metodi per modellare MIRI e MI negli animali 4,5,6,7,8,9. Questa strategia promuove la ricerca, ma i diversi criteri e metodi utilizzati complicano l'interpretazione dei risultati tra i gruppi di ricerca.
Nei topi, l'infarto miocardico è stato indotto dall'isoproterenolo 10, dalla criolesione11,12 o dalla cauterizzazione13. L'infarto miocardico può essere indotto prontamente dall'isoproterenolo, ma il processo fisiopatologico è diverso da quello dell'infarto miocardico clinico. L'infarto miocardico indotto da criolesione ha una scarsa consistenza, provoca un eccessivo danno miocardico intorno all'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) e può facilmente indurre aritmia. L'infarto miocardico indotto dalla cauterizzazione è molto diverso dal processo naturale dell'infarto del miocardio e la reazione infiammatoria nell'area in fiamme è più intensa; Inoltre, l'approccio chirurgico presenta difficoltà tecniche. Inoltre, ci sono alcuni laboratori14 che stanno sviluppando un modello di infarto miocardico in minipig utilizzando il blocco del palloncino o l'embolizzazione o il metodo della trombosi attraverso tecniche interventistiche. Tutte queste metodiche possono causare direttamente l'occlusione delle arterie coronarie, ma la necessità di dispositivi per angiografia coronarica e, soprattutto, le arterie coronarie di topo troppo sottili rende queste operazioni poco pratiche. Per MIRI, le differenze tra i diversi modelli erano piuttosto modeste, come l'uso di respiratori/micromanipolazione o meno 5,6.
Qui viene descritto un metodo semplice e affidabile in grado di indurre l'infarto miocardico e il modello MIRI, adattato dai metodi 4,5,6,7,8,9,15 precedentemente pubblicati. Questo metodo può simulare i processi fisiopatologici mediante il blocco diretto del LAD attraverso la legatura. Inoltre, alleviando la legatura, questo modello può anche simulare il danno da riperfusione. In questo protocollo, viene utilizzato un microscopio da dissezione per la visualizzazione LAD. Quindi, il ricercatore può identificare prontamente il LAD. Successivamente, un'accurata legatura del LAD porta a un'occlusione del sangue e a un'ischemia ventricolare riproducibili e prevedibili. Inoltre, le alterazioni dell'elettrocardiogramma (ECG) possono essere utilizzate per confermare l'ischemia e la riperfusione, oltre ai cambiamenti di colore del LAD osservati al microscopio. Questa strategia porta a una durata della procedura più breve, a un minor rischio di complicanze chirurgiche e a un minor numero di topi sperimentali necessari. Vengono inoltre descritti i metodi per il test della troponina-T, l'ecografia cardiaca e la colorazione del cloruro di trifeniltetrazolio (TTC). Nel complesso, questo protocollo è utile per gli studi sul meccanismo MI/MIR, nonché per la scoperta di farmaci.
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Protocol
Gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'utilizzo degli animali dell'Università di Scienza e Tecnologia di Huazhong (Wuhan, Cina).
NOTA: I topi maschi C57BL/6J (8-10 settimane) sono usati come modelli. I topi hanno libero accesso al cibo e all'acqua e vengono allevati in specifiche condizioni prive di agenti patogeni. L'ambiente viene mantenuto a temperatura controllata (22 °C ± 2 °C) e umidità (45%-65%). I topi sono esposti a un ambiente chiaro/buio di 12 ore presso la struttura per la cura degli animali della Tongji Medical School (Wuhan, Cina) secondo le linee guida stabilite da questa istituzione. Utilizzare strumenti microchirurgici sterili e forniture chirurgiche. Guanti chirurgici e maschere sono necessari durante tutta la procedura. Il flusso di lavoro sperimentale è illustrato nella Figura 1A.
1. Preparazione preoperatoria
- Utilizzare un tavolo operatorio rettangolare (OT) con un termoforo preriscaldato (37 °C) durante la procedura chirurgica (Figura 1B). Disinfettare la scheda con luce ultravioletta e alcol al 70% prima di iniziare la procedura.
- Pesare accuratamente tutti i topi per calcolare la dose di farmaci anestetici necessari. Quindi, anestetizzare i topi con ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale. Garantire un'adeguata profondità di anestesia grazie all'assenza di un riflesso di astinenza al pizzicamento delle dita dei piedi e dei riflessi di ammiccamento.
- Posizionare il topo supino sull'OT con una garza sotto la testa per evitare il surriscaldamento degli occhi. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per evitare che si secchino.
- Radere il pelo sul petto precordiale sinistro con un rasoio elettrico. Utilizzare una crema per la rimozione del pelo sul torace pre-rasato e massaggiare uniformemente con un batuffolo di cotone sterile per ~1 min. Pulisci il pelo sciolto in eccesso con una garza.
- Usa lo iodio povidone, seguito da alcol al 70% per pulire l'area. Copri il torace con una garza.
- Utilizzare una sutura 4-0 sotto gli incisivi superiori e fissarla al punto di ancoraggio (vicino al bordo dell'OT sopra il naso) per mantenere la bocca leggermente aperta e facilitare l'incannulamento.
- Tira la coda per mantenere il corpo dritto e fissa la coda all'OT usando del nastro adesivo. Fissare i quattro flettenti e serrarli sugli altri punti di ancoraggio. È importante sottolineare che non allungare eccessivamente gli arti anteriori; in caso contrario, può verificarsi una compromissione respiratoria.
- Usa pinze curve e pinze per aprire la mascella e sollevare la lingua. Usa un illuminatore per visualizzare chiaramente la gola e la glottide.
- Inserire delicatamente una cannula da 22 G con un ago smussato e troncato nella trachea attraverso la bocca ~ 1 cm in gola. Usa una mano per tenere la lingua, muovila leggermente verso l'alto con una pinza smussata e, contemporaneamente, usa l'altra mano per inserire delicatamente il tubo nella trachea. Fare attenzione a non inserire il tubo nell'esofago.
- Rimuovere l'ago delicatamente. Controllare l'intubazione inserendo il tubo nell'acqua per verificare la formazione di bolle prima di collegarlo al ventilatore.
- Collegare il tubo endotracheale a un ventilatore impostato su 120/min e volume corrente regolato a 250 μL.
NOTA: L'impostazione del ventilatore viene regolata in base al peso corporeo (in generale, un peso corporeo più elevato richiede un volume corrente più elevato). - Verificare l'intubazione controllando l'espansione simmetrica bilaterale del torace. Quindi, la connessione viene fissata all'OT con del nastro adesivo per evitare che il tubo cada.
- Posizionare gli elettrodi ECG sulle zampe e collegarli al registratore ECG. Monitorare l'elettrofisiologia cardiaca durante tutta la procedura.
2. Toracotomia
- Rimuovere la garza sul torace. Disinfettare nuovamente con alcol al 70% per le aree di incisione utilizzando tre cicli di scrub. Quindi, coprire il topo con un telo chirurgico sterile con un foro sul campo operatorio per ridurre la contaminazione del sito chirurgico.
- Praticare un'incisione cutanea obliqua (0,8-1,0 cm) lungo la linea medioclavicolare sinistra con un bisturi sterile.
- Eseguire la dissezione smussata dei tessuti sottocutanei per esporre le costole sottostanti. Fare attenzione a non ferire vasi, costole e polmoni. Arrestare l'emorragia utilizzando applicatori sterili in cotone.
- Individuare e praticare un'incisione di circa 6-8 mm nel terzo spazio intercostale. Quindi, eseguire una dissezione smussata dei tessuti nello spazio intercostiero per aprire la cavità toracica. Fare attenzione a non ferire l'arteria toracica interna.
- Usa le pinze per coprire lo spazio intercostale. Inserire i divaricatori fatti in casa pre-sterilizzati (Figura 1C) nella gabbia toracica e tirare indietro per allargare l'incisione a ~6 mm di larghezza. Fissare i divaricatori all'OT con elastici.
- Rimuovere con cautela i tessuti circostanti per esporre completamente il cuore. Staccare delicatamente il pericardio con una pinza curva senza ferire il cuore. Ora è disponibile una visione chiara del cuore.
3. Legatura LAD
NOTA: Il LAD appare come una sottile linea rossa che corre perpendicolarmente da vicino all'apice e giù attraverso il ventricolo sinistro. Il LAD è di colore rosso vivo, quindi fai attenzione a non scambiarlo per una vena. Di solito, il sito di legatura è ~1-2 mm sotto il padiglione auricolare sinistro. Questa posizione di legatura produrrà circa il 40%-50% dell'ischemia nel ventricolo sinistro. Una posizione più alta creerà una zona di infarto più estesa. Un sito più distale creerà una zona infartuale più piccola.
- Utilizzare un microscopio da dissezione e dirigere una luce focalizzata e appropriata per la visualizzazione LAD. Premere delicatamente il sito sotto la posizione di legatura scelta per ingrandire temporaneamente il LAD (≤5 s alla volta). Ricontrollare il LAD in questo modo.
- Usa un ago affusolato (3/8, 2,5 x 5) per passare un 8-0 legatura di seta sotto il LAD al microscopio da dissezione. Attenzione alla profondità dell'ago: non troppo in profondità per entrare nel ventricolo sinistro e non troppo in profondità per evitare di danneggiare il LAD.
- Legare la legatura con un doppio nodo sciolto. Il diametro dell'anello è di circa 2-3 mm.
- Posizionare un tubo in PE-10 da 2-3 mm in un anello parallelo all'arteria.
- Stringere delicatamente l'ansa di legatura fino a quando non si trova intorno all'arteria e al tubo. Quindi, fissa l'anello con un nodo scorsoio. Fare attenzione a non danneggiare la parete miocardica con un'eccessiva pressione di serraggio.
NOTA: La legatura non viene eseguita per il gruppo di operazione fittizia. - Confermare la cessazione del flusso sanguigno nel LAD: osservare un colore più pallido nella parete anteriore del ventricolo sinistro dopo la legatura. Inoltre, un significativo sopraslivellamento del tratto ST entro pochi battiti cardiaci indica anche l'occlusione16. Se è necessaria una legatura permanente (ad es. MI), rimuovere il tubo in PE-10 e legare il LAD direttamente con un nodo. Riprendere la procedura rimanente come indicato al punto 4.3 di seguito.
- Rimuovere i divaricatori dall'incisione. Quindi, chiudi temporaneamente la ferita con una pinza bulldog. La durata dell'ischemia è in accordo con il disegno sperimentale. Assicurarsi che il mouse continui a essere collegato al ventilatore.
4. Riperfusione
- Al termine del periodo di ischemia, rimuovere la pinza bulldog e inserire nuovamente i divaricatori per aprire l'incisione ed esporre il cuore (in particolare il sito di legatura).
- Sciogliere il nodo scorsoio e rimuovere il tubo in PE-10. Confermare il ripristino del flusso sanguigno in questa fase osservando il cambiamento di colore che torna al rosa-rosso entro 20 s. Allo stesso tempo, osserva attentamente l'ECG: una potenziale dissoluzione del sopraslivellamento del tratto ST suggerisce anche la riperfusione.
- Lascia l'8-0 legatura in situ per la successiva colorazione Evans-Blue e TTC. In altri casi, rimuovere la sutura in questa fase.
- Rimuovere i divaricatori e chiudere l'incisione suturando la terza e la quarta costola con una sutura di nylon 4-0. Fare attenzione a non ferire il polmone. Spingi fuori l'aria che potrebbe essere intrappolata nella cavità toracica premendo delicatamente il torace mentre lega i nodi di sutura.
- Chiudere gli strati muscolari con suture continue. Chiudere la pelle con una sutura di nylon 4-0; Sono accettabili suture continue e suture interrotte.
5. Cure postoperatorie
- Osservare attentamente il topo per segni di recupero dall'anestesia, ad esempio movimento della coda o dei baffi. Dopodiché, il topo di solito riprende un normale schema respiratorio con una frequenza respiratoria di circa 150 bpm. Estubare il mouse rimuovendo lentamente il tubo.
- Monitorare il mouse per altri 3-5 minuti per assicurarsi che il distress respiratorio sia assente.
- Somministrare 100 μL di buprenorfina (0,1 mg/mL, n.c.) dopo che il topo inizia a respirare. Per le successive 24 ore, somministrare una dose aggiuntiva ogni 4-6 ore. Fornire ibuprofene come ulteriore sollievo dal dolore nell'acqua potabile come soluzione 0,2 mg/mL per 2 giorni prima e ≤7 giorni dopo l'intervento chirurgico.
- Mantieni i topi al caldo e riduci il rischio di mortalità utilizzando coperte termoisolanti poiché i topi sono inclini all'ipotermia dopo l'anestesia.
6. Convalida dopo la procedura
- Test della troponina-T
- Raccogliere campioni di sangue dai plessi retroorbitari e isolare i sieri mediante centrifugazione (3.000 × g, 10 min, temperatura ambiente).
- Diluire 20 μL di siero a 100 μL con soluzione salina per il test della troponina-T. Conservare il resto dei campioni a -80 °C.
- Rilevare la troponina T (cTnT utilizzando un kit commerciale seguendo le istruzioni del produttore.
- Ecografia cardiaca
NOTA: L'ecografia cardiaca viene utilizzata per valutare la funzione cardiaca e le anomalie del movimento della parete in diverse fasi prima e dopo l'intervento chirurgico secondo il disegno sperimentale17,18. Vengono misurati diversi parametri come lo spessore della parete ventricolare, il volume ventricolare, il diametro della cavità ventricolare, la frazione di eiezione e la frazione di accorciamento dell'asse corto.- Anestetizzare i topi con ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale.
- Radere il petto con un rasoio elettrico. Utilizzare una crema per la rimozione del pelo e massaggiare uniformemente. Pulisci il pelo sciolto in eccesso con una garza.
- Posiziona il mouse sull'OT e fissa i quattro arti con del nastro adesivo.
- Posizionare la sonda ecografica (30 MHz) sulla regione anteriore del cuore a ~ 30° rispetto allo sterno. La sonda in questa vista è allineata con l'asse lungo del cuore. Impostare l'ecografia in B-Mode; Il ventricolo sinistro, l'atrio sinistro, la valvola mitrale e l'aorta ascendente possono essere identificati chiaramente. Utilizzare l'acquisizione video per ottenere dati per l'analisi successiva.
- Ruotando il trasduttore di 90° in senso orario, si ottiene una visione parasternale dell'asse corto a livello dei muscoli papillari per rilevare chiaramente i ventricoli sinistro e destro. Quindi utilizzare B-Mode e M-Mode per valutare la funzione cardiaca e la morfometria.
- Calcolare il diametro telediastolico del ventricolo sinistro (Dd), il diametro telesistolico (Ds) e lo spessore del setto interventricolare specificando la posizione corrispondente nelle immagini ecografiche.
NOTA: La macchina calcolerà manualmente il volume telediastolico ventricolare sinistro (LVEDV) e il volume telesistolico (LVESV). Inoltre, la macchina calcolerebbe i valori per l'accorciamento frazionario (FS) e la frazione di eiezione (EF) utilizzando le formule FS = (Dd-Ds)/Dd × 100% e EF= (LVEDV-LVESV)/LVEDV × 100%. Scegli cinque cicli cardiaci consecutivi e ottieni i loro valori medi.
- Misurazione delle dimensioni dell'infarto del miocardio
NOTA: La colorazione Evans-Blue/TTC viene utilizzata per misurare le dimensioni dell'infarto perché può valutare la vitalità dei tessuti19. Si consiglia di colorare entro 72 ore dalla riperfusione perché la cicatrice si restringerà. Questa fase viene eseguita dopo l'eutanasia dell'animale con 200 mg/kg di pentobarbital sodico tramite iniezione intraperitoneale.- Esporre nuovamente il cuore seguendo le procedure precedenti dai passaggi 2.2-2.5. Quindi, riposizionare il LAD nel sito iniziale convalidato dalla sutura menzionata al punto 4.3 al termine della durata di riperfusione desiderata.
- Incannulare l'aorta e poi perfondere il cuore con 0,3 ml di soluzione Evans Blue all'1%. Il miocardio della regione non ischemica è colorato di blu. Dopo la perfusione, rimuovere rapidamente il cuore tagliando l'aorta con le forbici.
- Quindi, lavare il cuore in una soluzione di KCl (30 mM) per fermare il battito cardiaco. Conservare a -20 °C per ≥4 h dopo aver rimosso il tessuto adiposo circostante.
- Tagliare il cuore in senso trasversale in cinque fette dello spessore di 1 mm utilizzando un bisturi affilato. Pesare le fette e poi incubarle con TTC al 2% per 40 minuti a 37 °C.
NOTA: Dopo l'incubazione, le aree dell'infarto sono delimitate come bianche, mentre i tessuti vitali nelle aree non infartuali rimangono rossi. - Fissare le fette con il 4% di formaldeide per una notte.
NOTA: Questa azione migliorerà il contrasto tra l'area dell'infarto e l'area non infartuale. Ridurrà anche le fette. - Fotografa le fette con una fotocamera digitale. Quindi, calcola l'area a rischio (AAR), l'area dell'infarto e la zona non ischemica utilizzando un software grafico.
NOTA: Dopo la doppia colorazione Evans-Blue/TTC, l'area blu è l'area "normale". Le aree rimanenti (comprese il bianco e il rosso) sono le aree a "rischio di ischemia": l'area bianca è l'area dell'infarto del miocardio (IA) e l'area rossa è l'area ischemica (ma non infartuata). Tenendo conto dell'incoerenza delle dimensioni delle fette di cuore, i risultati vengono aggiustati in base al peso.
Assegnare:
A1-A5 per l'area della zona dell'infarto/area della fetta di cuore;
B1-B5 per l'area della zona non infartuale/area della fetta di cuore;
W1-W5 per il peso della fetta di cuore.
Allora:
Peso totale del miocardio infartuato: W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5;
Peso totale del miocardio non infartuato: W1 × B1 + W2 × B2 + W3 × B3 + W4 × B4+ W5 × B5;
Peso totale di AAR = (W1 + W2 +W3 + W4 + W5) - (W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5)
Finalmente:
L'area di ischemia miocardica è calcolata come la percentuale di AAR nel ventricolo sinistro:
L'area di infarto del miocardio è calcolata come la percentuale di IA nell'AAR:
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Representative Results
Il flusso di lavoro sperimentale è illustrato nella Figura 1A. Il ricercatore può programmare i nodi temporali in base al disegno sperimentale all'inizio dello studio. La durata della legatura LAD è in base allo scopo della ricerca. Per l'infarto miocardico, la ricerca può ignorare la fase di riperfusione. L'ecografia cardiaca è disponibile in diverse fasi dello studio perché non è invasiva, mentre la colorazione Evans-Blue/TTC può essere eseguita solo quando il topo viene sacrificato. Per la ricerca che si concentra sulla fibrosi e sul rimodellamento ventricolare, il tempo di osservazione è molto più lungo.
Le immagini tipiche per una parte del processo sperimentale sono mostrate nella Figura 2A, dall'intubazione endotracheale, all'incisione cutanea, alla toracotomia, all'identificazione LAD, alla legatura LAD alla riperfusione. Per verificare l'ischemia miocardica e la riperfusione, le immagini rappresentative dell'ECG con significativo sopraslivellamento del tratto ST dopo la legatura e la dissoluzione del sopraslivellamento del tratto ST quando il nodo scorsoio è sciolto sono mostrate nella Figura 2B.
Dopo aver ottenuto campioni di sangue da tutti i topi, il test della troponina-T può essere eseguito per convalidare l'infarto. La Figura 3A mostra un aumento significativo di cTnT nei gruppi MIRI e MI rispetto ai gruppi sham. La Figura 3B mostra la doppia colorazione di Evans-Blue e TTC per cinque sezioni trasversali consecutive del cuore tra il gruppo sham e il gruppo MIRI. L'area blu suggerisce l'area normale, l'area bianca suggerisce l'area dell'infarto del miocardio e l'area rossa suggerisce l'area ischemica ma non infartuata. La Figura 3C rappresenta le immagini dell'asse lungo dell'ecografia cardiaca tra il gruppo sham e il gruppo IM. Le applicazioni software possono essere utilizzate per calcolare diversi parametri funzionali, come ad esempio un valore più elevato della frazione di eiezione per il gruppo sham nella Figura 3C rispetto a quello nel gruppo MI.
Figura 1: Configurazione chirurgica. (A) Panoramica della cronologia sperimentale. (B) Tavolo operatorio con termoforo preriscaldato e collegamento per elettrodi ECG. (C) Divaricatori fatti in casa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Processo sperimentale e cambiamenti dell'ECG. (A) Le immagini dell'intubazione endotracheale, dell'incisione cutanea, della toracotomia, dell'identificazione del LAD, della legatura del LAD e della riperfusione sono mostrate rispettivamente in 1, 2, 3, 4, 5 e 6. (B) Immagini ECG tipiche di infarto miocardico e mirico dopo legatura e riperfusione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Convalida dopo la procedura. (A) Espressione della troponina cardiaca tra i gruppi sham, MIRI 24 h e MI 3 d. (B) Evans -Blue/TTC doppia colorazione per gruppi sham e MIRI 24 h. (C) Ecografia cardiaca per i gruppi sham e IM. LVID; d, dimensione interna ventricolare sinistra telediastolica; LVID; S, dimensione interna ventricolare sinistra sistolica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Negli ultimi anni, la creazione di modelli per MI e MIRI nella ricerca clinica e scientifica si è sviluppata rapidamente20,21. Tuttavia, ci sono ancora alcune questioni, come i meccanismi d'azione e come migliorare l'MI/MIRI, che devono essere risolte. Qui viene descritto un protocollo modificato per stabilire un modello murino di MI e MIRI. Diversi punti chiave devono essere considerati attentamente.
Il primo punto chiave è l'intubazione endotracheale. Alcune procedure6,9 comportano l'incisione della pelle cervicale, la separazione dei tessuti, seguita dall'esposizione del muscolo sternoidioideo per visualizzare la trachea. In questo modo, il ricercatore può visualizzare l'inserimento del tubo nella trachea. Questo è un buon passo per ridurre il rischio di distress respiratorio. Nel metodo attuale, il ricercatore può visualizzare chiaramente la chiusura e l'apertura della glottide con la respirazione sotto un illuminatore e quindi inserire facilmente il tubo nella trachea. Quindi, un'incisione cervicale non viene eseguita per ridurre i traumi cutanei e le potenziali infezioni, il che è importante nella ricerca sulla segnalazione infiammatoria. I laringoscopi visivi sono ampiamente utilizzati nell'intubazione tracheale clinica: forse possono essere utilizzati anche nei topi. Mares et al.22 hanno riportato l'anestesia inalatoria continua con maschera senza intubazione endotracheale, che è stata eseguita mediante inalazione di isoflurano al 2% dopo induzione di isoflurano al 5% con ossigeno somministrato attraverso una maschera non invasiva posta sul naso e sulla bocca dell'animale. Può evitare danni ai tessuti e migliorare la sicurezza e l'efficienza dell'anestesia. Tuttavia, è necessaria una speciale macchina per anestesia per inalazione. Inoltre, gli anestetici volatili possono causare danni fisici all'operatore.
Il secondo e più importante punto chiave è l'identificazione e la legatura del LAD. Ogni errore nell'identificazione e nella legatura del LAD porterà a risultati incoerenti: o dimensioni dell'infarto troppo grandi con conseguente morte o dimensioni dell'infarto troppo piccole con conseguente fallimento. Possono essere applicati vari metodi per identificare il LAD e verificarne la legatura. In questo caso, viene utilizzato un microscopio da dissezione per localizzare il LAD. Il LAD di solito appare come una sottile linea rossa che corre perpendicolarmente da vicino all'apice e giù attraverso il ventricolo sinistro. Premendo delicatamente il sito sotto la posizione di legatura scelta per ingrandire temporaneamente il LAD (≤5 s alla volta), il LAD può essere controllato nuovamente. Dopo la legatura, l'occlusione LAD è verificata da un colore più pallido nella parete anteriore del ventricolo sinistro e da un significativo sopraslivellamento del tratto ST entro pochi battiti cardiaci. Quindi, la legatura viene sciolta e la riperfusione viene convalidata da un cambiamento di colore in rosa-rosso entro 20 secondi e dalla potenziale dissoluzione del sopraslivellamento del tratto ST all'ECG. Infine, il test della troponina-T, la colorazione TTC e l'ecografia cardiaca vengono impiegati per valutare il danno miocardico. Queste molteplici assicurazioni e verifiche reciproche rendono i risultati sperimentali altamente affidabili. Inoltre, la micromanipolazione suscita una maggiore precisione e meno complicazioni (ad esempio, sanguinamento). Un'altra questione importante è l'ipotesi che i vasi sanguigni dei topi siano normali, ma in realtà alcune arterie coronarie variano notevolmente e anche la circolazione collaterale può presentare23,24. Quindi, le dimensioni dell'infarto a volte non sono coerenti anche se le legature sono considerate allo stesso livello. I vantaggi del microscopio sono esposti qui. La legatura non può essere fatta solo in base all'esperienza o ai punti di riferimento anatomici: il LAD e la sua direzione devono essere verificati chiaramente prima della legatura, altrimenti i risultati saranno inaffidabili. In alcuni esperimenti6,8, i topi sono in posizione di decubito laterale destro per la comodità di osservare la parete anteriore del ventricolo sinistro e le arterie coronarie dopo l'esposizione cardiaca.
Questo modello presenta due limitazioni principali. In primo luogo, la legatura LAD non può simulare l'occlusione dell'arteria coronaria destra. Infatti, a causa delle differenze anatomiche tra gli animali25, il LAD di solito si estende fino all'apice del cuore nei topi e nei ratti, e i rami circonflessi sinistri non sono sviluppati, quindi i modelli nei topi e nei ratti sono stabiliti mediante legatura LAD. Per animali di taglia grande e media come conigli e maiali, il LAD è relativamente corto, mentre l'arteria circonflessa sinistra copre una vasta area del cuore, quindi la legatura dell'arteria circonflessa sinistra è selezionata per stabilire il modello. Sicard et al.26 hanno riportato un nuovo metodo per studiare la disfunzione ventricolare destra e l'interazione biventricolare legando l'arteria coronaria destra nei topi, che potrebbe rimediare a questa limitazione. La seconda limitazione è una dimensione incoerente dell'infarto dovuta alla variabilità nell'anatomia dell'arteria coronaria27 e all'esperienza del chirurgo. Come discusso in precedenza, il microscopio è molto importante per aumentare la coerenza verificando il LAD e la sua direzione prima della legatura, e per un ricercatore esperto, è possibile regolare la posizione di legatura dopo una valutazione completa dell'anatomia vascolare.
Alcune altre questioni meritano di essere menzionate. Ad esempio, la toracotomia e il piercing con ago causeranno inevitabilmente lievi danni ai muscoli e al miocardio, che possono avere effetti sull'infiammazione. Inoltre, è stato riportato che gli agenti analgesici hanno effetti sull'infarto miocardico28. Pertanto, questi fattori devono essere presi in considerazione quando si analizza l'infiammazione o i suoi effetti sull'infarto miocardico. Per la risoluzione dei problemi, ci sono diversi fattori che porterebbero alla morte dei topi. Ad esempio, complicanze legate all'infarto miocardico, all'incidente anestetico e al sanguinamento. Inoltre, i risultati incoerenti derivano principalmente da posizioni di legatura inappropriate: una posizione di legatura troppo alta indurrebbe infarti di dimensioni troppo grandi anche la morte dei topi; nel frattempo, la falsa identificazione di LAD comporterebbe il fallimento del modello. Alcuni dettagli devono essere migliorati in questo metodo. Ad esempio, sarebbe meglio se si potesse inserire una sonda rettale per monitorare la temperatura durante la procedura. Ultimo ma non meno importante, lo sperimentatore dovrebbe tenere a mente le differenze tra gli studi sugli animali e le realtà cliniche, in particolare che il tempo di ischemia di 30 minuti è davvero piuttosto breve per la clinica. Incoraggiamo il ricercatore a organizzare i passaggi in base al disegno dell'esperimento, compreso il tempo di ischemia. Solo in questo modo questo protocollo può essere utile per gli studi sul meccanismo e il trattamento dell'infarto miocardico/MIRI e per la scoperta di farmaci.
In breve, viene fornito un modello murino semplice e riproduttivo per MIRI e MI. Questo modello può essere utilizzato per lo studio dei meccanismi MI/MIRI e per la ricerca terapeutica.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82070317, 81700390 a Jibin Lin, 8210021880 a Bingjie Lv e 82000428 a Boyuan Wang) e dal National Key R&D Program of China (2017YFA0208000 a Shaolin He).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9 % sodium chloride solution | Kelun Industry Group,China | - | |
| 4% paraformaldehyde fixing solution | Servicebio,China | G1101 | - |
| 4-0 silk suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China | C412 | - |
| 8-0 suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China | H801 | - |
| Buprenorphine | IsoReag,China | IR-11190 | - |
| Camera | Canon,Japan | EOS 80D | - |
| Depilatory cream | Veet,French | - | |
| Elecsys Troponin T hs STAT | Roche,Germany | - | |
| Electrochemical luminescence immunoanalyzer | Roche,Germany | Elecsys 2010 | - |
| Evans blue | Sigma,America | E2129 | - |
| Eye scissors | Shanghai Medical Instruments,China | JC2303 | - |
| Haemostatic forceps | Shanghai Medical Instruments,China | J31020 | - |
| High frequency in vivo imaging systems | Visualsonics,Canada | Vevo2100 | - |
| Ibuprofen | PerFeMiKer,China | CLS-12921 | - |
| Intravenous catheter | Introcan,Germany | 4254090B | - |
| Ketamine | Sigma-Aldrich,America | K2753 | - |
| Medical alcohol | Huichang ,China | - | |
| Microneedle holders | Shanghai Medical Instruments,China | WA2040 | - |
| Microscopic shears | Shanghai Medical Instruments,China | WA1040 | - |
| Microsurgical forceps | Shanghai Medical Instruments,China | WA3020 | - |
| Mouse electrocardiograph | Techman,China | BL-420F | - |
| Needle holders | Shanghai Medical Instruments,China | JC3202 | - |
| operating floor | Chico,China | ZK-HJPT | - |
| PE-10 tube | Huamei,China | - | |
| Pentobarbital | Merck,America | 1030001 | - |
| Rodent Ventilator | Shanghai Alcott Biotech,China | ALC-V8S-P | - |
| Stereo microscope | Aomei Industry,China | SZM0745-STL3-T3 | - |
| Surgical thermostatic heating pad | Globalebio, China | GE0-20W | - |
| Triphenyltetrazolium chloride | Servicebio,China | G1017 | - |
| Xylazine | Huamaike Biochemicals and Life Science Research Prouducts,China | 323004 | - |
References
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