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Bioingegneria

用于微生物化学和蛋白质生产的光控发酵

Published: March 22, 2022
doi:
10.3791/63269
, ,
1Department of Chemical and Biological Engineering,Princeton University, 2The Andlinger Center for Energy and the Environment,Princeton University, 3Department of Molecular Biology,Princeton University, 4High Meadows Environmental Institute,Princeton University

Summary

微生物代谢的光遗传学控制为发酵过程提供了灵活的动态控制。这里的实验方案展示了如何建立蓝光调节的发酵，用于不同体积尺度的化学和蛋白质生产。

Abstract

微生物细胞工厂为从可再生原料生产化学品和重组蛋白提供了一种可持续的替代方案。然而，通过基因修饰使微生物负担过重会降低宿主的适应性和生产力。这个问题可以通过使用动态控制来克服：酶和途径的诱导表达，通常使用基于化学或营养的添加剂，以平衡细胞生长和生产。光遗传学提供了一种非侵入性，高度可调和可逆的动态调节基因表达的方法。在这里，我们描述了如何建立工程 大肠杆菌 和 酿酒酵母 的光控发酵，以生产化学物质或重组蛋白。我们讨论了如何在选定的时间和剂量下应用光，以分离微生物生长和生产，以改善发酵控制和生产率，以及获得最佳结果的关键优化考虑因素。此外，我们还描述了如何为实验室规模的生物反应器实验实施光控制。这些方案有助于在工程微生物中采用光遗传学控制，以提高发酵性能。

Introduction

光遗传学是利用光响应蛋白控制生物过程的一种新策略，为动态控制微生物发酵以进行化学和蛋白质生产提供了一种新策略1，2。工程代谢途径的负担以及某些中间体和产品的毒性通常会损害细胞生长3。这种压力会导致生物质积累不良并降低生产力3。这一挑战可以通过将发酵暂时划分为生长和生产阶段来解决，这些阶段将代谢资源分别用于生物质积累或产品合成4。我们最近表明，在这种两相发酵中，从生长到生产的过渡可以通过照明条件的变化来诱导5，6，7。光输入的高可调性、可逆性和正交性8 为光控发酵提供了独特的优势，而这些发酵剂很难或不可能用用于传统两相发酵动态控制的化学诱导剂复制4，9，10，11。

来自乳酸红杆菌的蓝光响应性EL222蛋白已被用于开发几种光遗传学电路，用于酿酒酵母的代谢工程5，7，12，13。EL222包含一个光氧电压传感器（LOV）结构域，该结构域在蓝光激活（465nm）时经历构象位移，使其能够与其同源DNA序列（C120）13结合。将EL222融合到病毒VP16激活结构域（VP16-EL222）可产生蓝光响应转录因子，该转录因子可逆地激活酿酒酵母7和其他生物体14中合成启动子PC120中的基因表达。基于EL222的几个电路已经开发并用于酿酒酵母的化学生产，例如基本的光激活OptoEXP系统7，其中目的基因直接从PC120表达（图1A）。然而，在发酵生产阶段通常遇到的高细胞密度下的光穿透问题促使我们开发在黑暗中诱导的倒置电路，例如OptoINVRT和OptoQ-INVRT电路（图1B）5，7，13。这些系统分别利用酿酒酵母和克拉沙猪笼草的半乳糖（GAL）或奎宁（Q）调节剂，用VP16-EL222控制其相应的抑制因子（GAL80和QS），以抑制光照下的基因表达，并在黑暗中强烈诱导。结合OptoEXP和OptoINVRT电路，可以双向控制基因表达，实现两相发酵，其中生长阶段由蓝光诱导，生产阶段与黑暗（图2A）5，7。

在生产阶段使用光而不是黑暗来诱导基因表达将大大扩展光遗传学控制的能力，但也需要克服在这个发酵阶段通常遇到的高细胞密度的光穿透限制。为此，我们开发了称为OptoAMP和OptoQ-AMP的电路，可以放大对蓝光刺激的转录响应。这些电路分别使用VP16-EL222的野生型或超敏突变体来控制GAL或Q调节子的转录激活剂Gal4p或QF2的产生，从而在光照下实现增强的灵敏度和更强的基因表达12，13（图1C）。OptoAMP电路可以在光密度（在600nm下测量;OD600）值至少为40，仅约0.35%的照度（仅在约7%的体积表面上为5%的光剂量）。与OptoEXP相比，这显示出更高的灵敏度，OptoEXP需要接近100%的照明12。在高细胞密度下用光有效诱导基因表达的能力为发酵的动态控制开辟了新的机会。这包括在两个以上的时间阶段进行发酵，例如三相发酵，其中生长，诱导和生产阶段以独特的轻计划建立，以优化化学生产（图2B）12。

Figure 1
图1：用于动态控制酿酒酵母的光遗传学电路。 OptoEXP、OptoINVRT 和 OptoAMP 电路基于光敏 VP16-EL222 系统。（A）在OptoEXP电路中，暴露于蓝光会导致VP16-EL222的构象变化和二聚化，从而暴露DNA结合结构域并允许从PC120转录。该图由Zhao等人修改为7。（B） OptoINVRT电路利用GAL（如图所示）或Q调节子在黑暗中诱导表达。在基于GAL的电路中，VP16-EL222和GAL4是本构表达的，而PC120驱动GAL80抑制器的表达（在基于Q的电路中，GAL4和GAL80分别被QF2和QS取代，并且使用合成的含QUAS的启动子代替GAL启动子）。在光照下，Gal80p阻止了PGAL1目的基因的激活。在黑暗中，GAL80不被表达，并通过将其融合到一个本构的degron结构域（小的棕色结构域）而迅速降解，这允许Gal4p激活PGAL1。该图由Zhao等人修改为5。（C） 光电放大器电路还使用 VP16-EL222 来控制 GAL（如图所示）或 Q 重稳态。在这些电路中，GAL80抑制器（或QS）被组成表达并融合到光敏的degron（小蓝色域），确保在黑暗中进行严格的抑制。PC120和超敏的VP16-EL222突变体控制表达的GAL4（或QF2）与光，其强烈激活光中的PGAL1（或含QUAS的启动子）。GAL衍生的电路可以使用工程形式的PGAL1，例如PGAL1-M或PGAL1-S，它们具有增加的活性，以及由GAL调节子（PGAL1，PGAL10，PGAL2，PGAL7）控制的野生型启动子。该图由 Zhao 等人修改而来。请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 2
图 2：随时间推移的两相和三相发酵。 （A） 采用倒置回路操作的两相发酵包括光驱动的生长阶段和黑暗的生产阶段。在生长阶段，随着生产途径的抑制，生物质会积累。在达到所需的OD 600时，细胞被转移到黑暗中以代谢调整，然后重悬于新鲜培养基中以进行生产阶段。（B）在三阶段过程中，生长，孵化和生产阶段由独特的光照时间表定义，其中可能包括黑暗的生长期，脉冲孵育和完全照明的生产阶段。使用Biorender创建的图。 请点击此处查看此图的放大版本。

还开发了光遗传学电路，用于动态控制大肠杆菌中的化学和蛋白质产生。OptoLAC 电路使用基于 YF1/FixJ 双组分系统6 的光响应 pDawn 电路控制细菌 LacI 抑制器（图 3）。与OptoINVRT5类似，OptoLAC电路旨在抑制光中的基因表达并在黑暗中诱导基因表达。使用 OptoLAC 电路的表达水平可以达到或超过标准异丙基β-d-1-硫代乳糖焦氰胺苷 （IPTG） 诱导达到的水平，从而保持化学诱导的强度，同时提供增强的可调性和可逆性6。因此，OptoLAC电路能够为大肠杆菌的代谢工程提供有效的光遗传学控制。

Figure 3
图 3：用于动态控制 大肠杆菌的 OptoLAC 电路。 OptoLAC电路调整pDawn系统和lac操纵子，以实现黑暗中的激活和光照下的抑制。在黑暗中，YF1磷酸化FixJ，然后激活PFixK2 启动子以表达 cI 抑制剂。 cI 抑制因子阻止来自PR启动子的 lacI 抑制因子的表达，PR 启动子允许从含 lacO的启动子转录目的基因。相反，蓝光降低YF1网激酶活性，逆转FixJ磷酸化，从而逆转 cI 表达，从而抑制 lacI 的表达并阻止含 lacO的启动子的表达。该图已从Lalwani等人6修改而来。 请点击此处查看此图的放大版本。

我们在这里描述了 酿酒酵母 和 大肠 杆菌用于化学或蛋白质生产的光控发酵的基本方案。对于酵母和细菌，我们首先关注由 OptoINVRT 和 OptoLAC 电路实现的光驱动生长阶段和黑暗诱导生产阶段的发酵。随后，我们描述了一种由OptoAMP电路实现的三相（生长，诱导，生产）光控发酵的协议。此外，我们还描述了如何将光遗传学控制的发酵从微孔板扩大到实验室规模的生物反应器。通过该协议，我们的目标是为化学或蛋白质生产进行光控发酵提供完整且易于重复的指南。

Protocol

1. 使用 酿酒酵母 光电光IVT7电路进行光控化学生产 应变结构 获得具有 他的3 auxotrophy的菌株，因为该标记对于大多数现有的OptoINVRT质粒是必需的5。如果寻求 酿酒酵母原生基因的光遗传学调控，请构建一个菌株，其中删除该基因的任何内源性拷贝。 对含有 OptoINVRT7 电路（如 EZ-L4395）的质粒进行线性化处理?…

Representative Results

微生物代谢的光遗传学调节已成功实施，以生产多种产品，包括生物燃料，散装化学品，蛋白质和天然产物5，6，7，12，13。这些过程中的大多数都是为了在光照下进行细胞生长而设计的（当低细胞密度对光穿透的挑战最小时），以及一旦细胞生长，黑暗就会诱导生产。使用?…

Discussion

长期以来，动态控制一直被应用于提高代谢工程和重组蛋白生产的产量4。酶表达的转变通常使用化学诱导剂（如IPTG21，半乳糖22和四环素23）来实现，但也使用温度和pH等工艺条件介导。基因表达的光遗传学控制消除了改变发酵参数或培养基组成的需要，使其成为传统诱导策略的易于应用的替代方案。打开或关闭灯光的容易程…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项研究得到了美国能源部，科学办公室，生物和环境研究办公室奖编号DE-SC0019363，NSF CAREER奖CBET-1751840，皮尤慈善信托基金和Camille Dreyfus教师学者奖的支持。

Materials

Light-controlled chemical production using S. cerevisiae
24-well culture plate USA Scientific CC7672-7524
Agar powder Thermo Fisher Scientific 303991049
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Blue LED panel HQRP 884667106091218
EZ-L439 OptoINVRT7 Plasmid N/A N/A See Reference 1
Glucose Thermo Fisher Scientific 501879892 (G8270-5KG)
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Petri dish Celltreat 229656
PmeI New England Biolabs R0560L
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
Replica-plating device Thomas Scientific F37848-0000
Replica-plating pads Sunrise Science Products 3005-012
SC-His powder Sunrise Science Products 1303-030
SC Complete powder Sunrise Science Products 1459-100
Sterile sealing film Excel Scientific STR-SEAL-PLT
YPD agar plates VWR 100217-054
Zeocin Thermo Fisher Scientific R25005
Light-controlled protein production using E. coli
6X SDS Sample Buffer Cepham Life Sciences 10502
12% Acrylamide protein gels Thermo Fisher Scientific NP0341BOX
24-well culture plate USA Scientific CC7672-7524
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Blue LED panel HQRP 884667106091218
Coomassie Brilliant Blue G-250 Thermo Fisher Scientific 20279
Electrophoresis cell Bio-Rad 1658004
Electrophoresis power supply Bio-Rad 1645050
LB broth (Miller) Fisher Scientific BP97235
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
NaCl Thomas Scientific SX0425-1
OptoLAC plasmids N/A N/A See Reference 2
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Petri dish Celltreat 229656
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
SOC medium Thermo Fisher Scientific 15544034
Thermomixer Eppendorf 5382000015
Tris base Fisher Scientific BP1521
Three-phase fermentation using S. cerevisiae
Same materials as "Light-controlled chemical production using S. cerevisiae" protocol plus the following:
EZ-L580 OptoAMP4 Plasmid N/A N/A See Reference 10
Chemical production in a light-controlled bioreactor
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
Antifoam Sigma-Aldrich A8311
Bioreactor with control station Eppendorf B120110001
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Bleach VWR Scientific 89501-620 (CS)
Blue LED panel HQRP 884667106091218
BPT tubing Fisher Scientific 14-170-15
Glucose Thermo Fisher Scientific 501879892 (G8270-5KG)
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific 7647-01-0
M9 Minimal Salts Thermo Fisher Scientific A1374401
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
NH4OH Solution Sigma-Aldrich I0503-1VL
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
SC Complete powder Sunrise Science Products 1459-100
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Riferimenti

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Hoffman, S. M., Lalwani, M. A., Avalos, J. L. Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production. J. Vis. Exp. (181), e63269, doi:10.3791/63269 (2022).
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