Högupplöst tredimensionell avbildning av fotplattan Vasculature i en Murine Hindlimb Gangrene Modell
Summary
Detta protokoll beskriver en unik, kliniskt relevant modell av perifera kranskärlens sjukdom som kombinerar femorala gatan och ven elektrokoagulering med administrering av en kväveoxid syntas inhibitor att inducera hindlimb kallbrand i FVB möss. Intracardiac DiI perfusion används sedan för högupplöst, tredimensionell avbildning av fotplattan vaskulatur.
Abstract
Perifera kranskärlens sjukdom (PAD) är en betydande orsak till sjuklighet till följd av kronisk exponering för aterosklerotiska riskfaktorer. Patienter som lider av dess allvarligaste form, kronisk lemhotande ischemi (CLTI), står inför betydande försämringar i det dagliga livet, inklusive kronisk smärta, begränsat gångavstånd utan smärta och icke-healing sår. Prekliniska modeller har utvecklats i olika djur för att studera PAD, men mus hindlimb ischemi är fortfarande den mest använda. Det kan finnas betydande variation som svar på skandinaviska förolämpning i dessa modeller beroende på mus stam som används och platsen, antalet och medel för kranskärlens störningar. Detta protokoll beskriver en unik metod som kombinerar femorala gatan och ven elektrokoagulering med administrering av en kväveoxid syntas (NOS) hämmare att tillförlitligt inducera footpad kallbrand i Friend Virus B (FVB) möss som liknar vävnad förlust av CLTI. Medan traditionella metoder för att bedöma reperfusion såsom laser Doppler perfusion imaging (LDPI) rekommenderas fortfarande, intracardiac perfusion av lipophilic färgämnet 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanin perklorat (DiI) används för att märka vaskulaturen. Efterföljande helmonterade konfokala laserskanningsmikroskopi möjliggör högupplöst, tredimensionell (3D) rekonstruktion av fotplatta vaskulär nätverk som kompletterar traditionella sätt att bedöma reperfusion i hindlimb ischemia modeller.
Introduction
Perifer arteriell sjukdom (PAD), kännetecknas av minskat blodflöde till extremiteterna på grund av åderförkalkning, påverkar 6,5 miljoner människor i USA och 200 miljoner människor över hela världen1. Patienter med PAD upplever nedsatt lemfunktion och livskvalitet, och de med CLTI, den allvarligaste formen av PAD, löper ökad risk för amputation och död med en 5-årig dödlighet som närmar sig 50%2. I klinisk praxis anses patienter med ankel-brachial index (ABI) <0,9 ha PAD, och de med ABI <0,4 i samband med antingen vilosmärta eller vävnadsförlust som att ha CLTI3. Symtomen varierar mellan patienter med liknande ADI beroende på daglig aktivitet, muskeltolerans mot ischemi, anatomiska variationer och skillnader i säkerhet utveckling4. Siffer- och lem kallbrand är den allvarligaste manifestationen av alla vaskulär ocklusiva sjukdomar som resulterar i CLTI. Det är en form av torr nekros som mumifierar mjukvävnaderna. Förutom aterosklerotisk PAD kan det också observeras hos patienter med diabetes, vaskuliter som Buergers sjukdom och Raynauds fenomen, eller calciphylaxi i inställningen av njursjukdom i slutstadiet5,6.
Flera prekliniska modeller har utvecklats för att studera patogenesen vid PAD/CLTI och testa effekten av potentiella behandlingar, varav den vanligaste är mus hindlimb ischemi. Inducera hindlimb ischemi hos möss uppnås vanligtvis genom obstruktion av blodflödet från iliaca eller femorala artärer, antingen genom sutur ligatur, elektrokoagulering eller andra sätt att begränsa det önskade kärlet7. Dessa tekniker drastiskt minska perfusion till hindlimb och stimulera neovascularization i lår och kalv muskler. Det finns dock väsentliga murin stamberoende skillnader i känslighet för skandinavisk förolämpning delvis på grund av anatomiska skillnader i säkerhet distribution8,9. Till exempel är C57BL/6 möss relativt resistenta mot hindlimb ischemi, visar minskad lem funktion men i allmänhet inga tecken på kallbrand i fotplattan. Å andra sidan har BALB/c möss en inneboende dålig kapacitet att återhämta sig från ischemi och vanligtvis utveckla auto-amputation av foten eller underbenet efter femorala arteriell ligatur ensam. Detta allvarliga svar på ischemi begränsar det terapeutiska fönstret och kan utesluta longitudinell bedömning av lem reperfusion och funktion. Intressant nog har genetiska skillnader i en enda kvantitativ egenskap locus ligger på murine kromosom 7 varit inblandade i dessa differentiella känsligheter av C57BL/6 och BALB/c möss till vävnad nekros och lem reperfusion10.
Jämfört med C57BL/6 och BALB/c stammar, FVB möss visar ett mellanliggande men inkonsekvent svar på femorala gatan ligatur ensam. Vissa djur utvecklar fotpad kallbrand i form av svarta ischemiska naglar eller mumifierade siffror, men andra utan några stora tecken på ischemi11. Samtidig administrering av Nω-Nitro-L-arginin metylesterhydroklorid (L-NAME), en nitrisk oxidsyntas (NOS) hämmare12, förhindrar kompensatoriska vasodilatory mekanismer och ytterligare ökar oxidativ stress i hindlimb vävnad. I kombination med femorala gatan ligatur eller koagulering, producerar detta tillvägagångssätt konsekvent footpad vävnad förlust i FVB möss som liknar de bestod förändringarna av CLTI men sällan utvecklas till lem auto-amputation11. Oxidativ stress är ett av kännetecknen för PAD/CLTI och förökas av endotel dysfunktion och minskad biotillgänglighet av kväveoxid (NO)13,14. NEJ är en pluripotent molekyl som vanligtvis utövar positiva effekter på arteriellt och kapillärblodflöde, trombocyt vidhäftning och aggregering samt leukocytrekrytering och aktivering13. Minskade nivåer av NOS har också visat sig aktivera angiotensin-omvandla enzymet, som inducerar oxidativ stress och påskyndar utvecklingen av ateroskleros15.
När en modell av hindlimb ischemi är etablerad, övervakning efterföljande lem reperfusion och den terapeutiska effekten av eventuella behandlingar behövs också. I den föreslagna murin kallbrandsmodellen kan graden av vävnadsförlust först kvantifieras med hjälp av Faber-poängen för att bedöma fotens bruttoutseende (0: normalt, 1-5: förlust av naglar där poängen representerar antalet drabbade naglar, 6-10: atrofi av siffror där poängen representerar antalet siffror som påverkas, 11-12: partiell och fullständig fotatrofi, respektive)9. Kvantitativa mätningar av hindlimb perfusion görs sedan vanligtvis med hjälp av LDPI, som förlitar sig på Doppler interaktioner mellan laserljus och röda blodkroppar för att indikera pixelnivåperfusion i en region av intresse (ROI)16. Även om denna teknik är kvantitativ, icke-invasiv och idealisk för upprepade mätningar, ger den inte granulära anatomiska detaljer i hindlimb vaskulatur16. Andra bildframställning modaliteter, såsom mikro-datortomografi (micro-CT), magnetisk resonans angiografi (MRA) och röntgen mikroangiography, visar sig antingen kostsamma, kräver sofistikerad instrumentering, eller på annat sätt tekniskt utmanande16. 2008 beskrev Li et al. en teknik för märkning av blodkärl i näthinnan med det lipofila karbacyyaninfärgämnet DiI17. DiI införlivar i endotelceller och, genom direkt diffusion, fläckar vaskulär membran strukturer såsom angiogena groddar och pseudopodala processer17,18. På grund av dess direkta leverans till endotelceller och färgämnets mycket fluorescerande natur ger denna procedur intensiv och långvarig märkning av blodkärl. 2012 anpassade Boden et al. tekniken för DiI perfusion till murine hindlimb ischemi modellen via hela mount imaging av skördade lår adductor muskler efter femorala arteriell ligatur19.
Den nuvarande metoden ger ett relativt billigt och tekniskt genomförbart sätt att bedöma neovaskularisering som svar på hindlimb ischemi och gen- eller cellbaserade terapier. I en ytterligare anpassning beskriver detta protokoll tillämpningen av DiI perfusion för att avbilda footpad vaskulatur i hög upplösning och 3D i en murin modell av hindlimb kallbrand.
Protocol
Representative Results
Discussion
Medan mus hindlimb ischemi är den mest använda prekliniska modellen för att studera neovaskularisering i PAD och CLTI, finns det betydande variation i ischemi svårighetsgrad och återhämtning beroende på den specifika mus stam som används och platsen, antalet och metoden för kranskärlens störning. Kombinationen av femorala arteriell ligatur och IP administration av L-NAME kan tillförlitligt inducera hindlimb kallbrand i FVB möss11. Samma behandling resulterar i hindlimb ischemi utan v?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag till Z-J L och OC V från National Institutes of Health [R01HL149452 och VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Vi tackar också Mikroskopi- och bildbehandlingsanläggningen i Miami Project to Cure Paralysis vid University of Miami School of Medicine för att ha gett tillgång till deras bildanalys- och bearbetningsprogram.
Materials
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used version 2.1.0. |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature. Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).
- Mills, J. L., et al. The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI). Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).
- Conte, M. S., et al. Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).
- Yeager, R. A. Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease. Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).
- Al Wahbi, A. Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Parikh, P. P., et al. A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene. Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).
- Kopincová, J., Púzserová, A., Bernátová, I. L-NAME in the cardiovascular system – nitric oxide synthase activator. Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).
- Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).
- McDermott, M. M., et al. Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).
- Usui, M., et al. Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats. Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).
- Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).
- Boden, J., et al. Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI. BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).
- Elfarnawany, M. H. Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography. Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106 (2015).
- Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency. Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
- Ammermann, F., et al. Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography. European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).
- Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).
- Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).
- Hlushchuk, R., Haberthür, D., Djonov, V. Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging. Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Lee, J. J., et al. Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).
