Imagem tridimensional de alta resolução da Vasculatura do Footpad em um Modelo de Gangrena Hindlimb Murine
Summary
O presente protocolo descreve um modelo único e clinicamente relevante de doença arterial periférica que combina artéria femoral e eletrocoagulação venosa com a administração de um inibidor de sinthase de óxido nítrico para induzir gangrena de copulxina em camundongos FVB. A perfusão II intracardiac é então usada para imagens tridimensionais de alta resolução da vasculatura do footpad.
Abstract
A doença arterial periférica (PAD) é uma causa significativa de morbidade resultante da exposição crônica a fatores de risco ateroscleróticos. Pacientes que sofrem de sua forma mais grave, isquemia crônica ameaçadora de membros (CLTI), enfrentam prejuízos substanciais para a vida diária, incluindo dor crônica, distância de caminhada limitada sem dor e feridas não ogêsicas. Modelos pré-clínicos foram desenvolvidos em vários animais para estudar PAD, mas a isquemia de pândico do rato continua sendo a mais utilizada. Pode haver variação significativa na resposta ao insulto isquêmico nesses modelos, dependendo da cepa do mouse usada e do site, número e meios de interrupção arterial. Este protocolo descreve um método único que combina artéria femoral e eletrocoagulação venosa com a administração de um inibidor de óxido nítrico (NOS) para induzir de forma confiável gangrena de footpad em camundongos Friend Virus B (FVB) que se assemelha à perda de tecido de CLTI. Enquanto os meios tradicionais de avaliação da reperfusão, como a imagem de perfusão de doppler laser (LDPI) ainda são recomendados, a perfusão intracardiac do corante lipofílico 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) é usada para rotular a vasculatura. A microscopia de varredura a laser confocal subsequente permite a reconstrução de redes vasculares de alto nível (3D) de alta resolução tridimensional (3D) que complementa os meios tradicionais de avaliar a reperfusão em modelos de isquemia hindlimb.
Introduction
A doença arterial periférica (PAD), caracterizada pela redução do fluxo sanguíneo para as extremidades devido à aterosclerose, afeta 6,5 milhões de pessoas nos Estados Unidos e 200 milhões de pessoas em todo o mundo1. Pacientes com PAD experimentam função reduzida dos membros e qualidade de vida, e aqueles com CLTI, a forma mais grave de PAD, estão em risco aumentado de amputação e morte com uma taxa de mortalidade de 5 anos próxima de 50%2. Na prática clínica, são considerados pacientes com índices de tornozelo-braquial (ABI) <0,9, sendo aqueles com ABI <0,4 associados à dor de repouso ou perda de tecido como tendo CLTI3. Os sintomas variam entre pacientes com IIS semelhantes dependendo da atividade diária, tolerância muscular à isquemia, variações anatômicas e diferenças no desenvolvimento colateral4. A gangrena de dígitos e membros é a manifestação mais grave de todas as doenças oclusivas vasculares que resultam em CLTI. É uma forma de necrose seca que mumifica os tecidos moles. Além do PAD aterosclerótico, também pode ser observado em pacientes com diabetes, vasculitídeos como a doença de Buerger e o fenômeno de Raynaud, ou calcifilaxia no cenário da doença renal em estágio terminal5,6.
Vários modelos pré-clínicos foram desenvolvidos para estudar a patogênese do PAD/CLTI e testar a eficácia de tratamentos potenciais, sendo o mais comum a isquemia de pêblico posterior do camundongo. Induzir isquemia de retrocessão em camundongos é tipicamente realizada pela obstrução do fluxo sanguíneo das artérias ilíacas ou femorais, seja por ligadura de sutura, eletrocoagulação ou outros meios de constrição do vaso desejado7. Essas técnicas reduzem drasticamente a perfusão ao retrocesso e estimulam a neovascularização nos músculos da coxa e da panturrilha. No entanto, existem diferenças essenciais de sensibilidade à sensibilidade isquêmica ao insulto isquêmico parcialmente devido a diferenças anatômicas na distribuição colateral8,9. Por exemplo, os camundongos C57BL/6 são relativamente resistentes à isquemia hindlimb, demonstrando função reduzida do membro, mas geralmente não há evidência de gangrena no footpad. Por outro lado, os camundongos BALB/c têm uma capacidade inerentemente ruim de se recuperar da isquemia e normalmente desenvolvem auto-amputação do pé ou perna inferior após a ligadura da artéria femoral sozinho. Esta resposta severa à isquemia estreita a janela terapêutica e pode impedir a avaliação longitudinal da reperfusão e função dos membros. Curiosamente, as diferenças genéticas em um único locus de traço quantitativo localizado no cromossomo murine 7 foram implicadas nessas suscetibilidades diferenciais de camundongos C57BL/6 e BALB/c à necrose tecidual e reperfusão de membros10.
Em comparação com as cepas C57BL/6 e BALB/c, os camundongos FVB demonstram uma resposta intermediária, mas inconsistente, apenas à ligadura da artéria femoral. Alguns animais desenvolvem gangrena de footpad na forma de unhas isquêmicas pretas ou dígitos mumificados, mas outros sem qualquer sinal de isquemia11. Administração concomitante de Cloridrato de Éster de Élíste de Metila Nω-Nitro-L-arginina (L-NAME), um inibidor de sintetizador de óxido nítrico (NOS)12, previne mecanismos vasodilatários compensatórios e aumenta ainda mais o estresse oxidativo no tecido hindlimb. Em combinação com ligação ou coagulação da artéria femoral, esta abordagem produz consistentemente perda de tecido de footpad em camundongos FVB que se assemelha às alterações atroficas de CLTI, mas raramente progride para auto-amputação de membros11. O estresse oxidativo é uma das marcas do PAD/CLTI e é propagado por disfunção endotelial e biodisponibilidade diminuída de óxido nítrico (NO)13,14. NO é uma molécula pluripotente que geralmente exerce efeitos benéficos sobre o fluxo sanguíneo arterial e capilar, a adesão e agregação de plaquetas, e recrutamento e ativação de leucócitos13. Níveis reduzidos de NOS também têm sido mostrados para ativar a enzima conversora de angiotensina, que induz o estresse oxidativo e acelera a progressão da aterosclerose15.
Uma vez estabelecido um modelo de isquemia de escalada posterior, também são necessários monitorar a reperfusão subsequente do membro e o efeito terapêutico de quaisquer tratamentos potenciais. No modelo de gangrena murina proposto, o grau de perda de tecido pode ser quantificado primeiro usando a pontuação de Faber para avaliar o aparecimento bruto do pé (0: normal, 1-5: perda de pregos onde a pontuação representa o número de pregos afetados, 6-10: atrofia de dígitos onde a pontuação representa o número de dígitos afetados, 11-12: atrofia parcial e completa do pé, respectivamente)9. As medições quantitativas da perfusão de limbo hind são então tipicamente feitas usando LDPI, que se baseia em interações do Doppler entre luz laser e glóbulos vermelhos para indicar perfusão em nível de pixel em uma região de interesse (ROI)16. Embora esta técnica seja quantitativa, não invasiva e ideal para medições repetidas, ela não fornece detalhes anatômicos granulares da vasculatura hindlimb16. Outras modalidades de imagem, como tomografia microcomputante (micro-TC), angiografia de ressonância magnética (MRA) e microangiografia de raios-X, se mostram dispendidas, exigindo instrumentação sofisticada ou tecnicamente desafiadora16. Em 2008, Li et al. descreveram uma técnica para rotular vasos sanguíneos dentro da retina com o corante lipofílico de carbocianina DiI17. O DII incorpora em células endoteliais e, por difusão direta, mancha estruturas de membrana vascular, como brotos angiogênicos e processos pseudopodais17,18. Devido à sua entrega direta em células endoteliais e à natureza altamente fluorescente do corante, este procedimento fornece rotulagem intensa e duradoura dos vasos sanguíneos. Em 2012, Boden et al. adaptaram a técnica de perfusão dii ao modelo de isquemia de hindlimb murina através de imagens de montagem integral dos músculos adutores da coxa colhidas após a ligadura da artéria femoral19.
O método atual fornece uma maneira relativamente barata e tecnicamente viável para avaliar a neovascularização em resposta à isquemia de liminar e terapêuticas baseadas em genes ou células. Em outra adaptação, este protocolo descreve a aplicação da perfusão diI à imagem da vasculatura do bloco de pés em alta resolução e 3D em um modelo murino de gangrena hindlimb.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora a isquemia de cetameira do rato seja o modelo pré-clínico mais utilizado para estudar a neovascularização em PAD e CLTI, há uma variação significativa na gravidade e recuperação da isquemia, dependendo da cepa específica do rato utilizada e do local, número e método de ruptura arterial. A combinação de ligadura da artéria femoral e administração IP de L-NAME pode induzir de forma confiável gangrena hindlimb em camundongos FVB11. O mesmo tratamento resulta em isquemia hindl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios ao Z-J L e OC V dos Institutos Nacionais de Saúde [R01HL149452 e VITA (NHLBL-CSB-HV-2017-01-JS)]. Agradecemos também ao Centro de Microscopia e Imagem do Projeto Miami para Curar Paralisia na Faculdade de Medicina da Universidade de Miami por fornecer acesso ao software de análise e processamento de imagens.
Materials
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used version 2.1.0. |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
References
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