يصف هذا البروتوكول نموذجا فريدا ذا صلة سريرية لأمراض الشرايين الطرفية يجمع بين التخثر الكهربائي للشريان الفخذي والوريد مع إعطاء مثبط سينثاز أكسيد النيتريك للحث على الغرغرينا الخلفية في فئران FVB. ثم يتم استخدام التروية DiI داخل القلب للتصوير عالي الدقة ثلاثي الأبعاد للأوعية الدموية لوسادة القدم.
يعد مرض الشرايين المحيطية (PAD) سببا مهما للمراضة الناتجة عن التعرض المزمن لعوامل الخطر لتصلب الشرايين. يواجه المرضى الذين يعانون من أشد أشكاله ، نقص التروية المزمن الذي يهدد الأطراف (CLTI) ، إعاقات كبيرة في الحياة اليومية ، بما في ذلك الألم المزمن ، ومسافة المشي المحدودة دون ألم ، والجروح غير الشافية. تم تطوير نماذج ما قبل السريرية في مختلفة لدراسة PAD ، لكن نقص تروية الأطراف الخلفية للفئران لا يزال الأكثر استخداما. يمكن أن يكون هناك تباين كبير في الاستجابة للإهانة الإقفارية في هذه النماذج اعتمادا على سلالة الماوس المستخدمة وموقع ورقم ووسائل تعطيل الشرايين. يصف هذا البروتوكول طريقة فريدة تجمع بين التخثر الكهربائي للشريان الفخذي والوريد مع إعطاء مثبط سينثاز أكسيد النيتريك (NOS) للحث بشكل موثوق على غرغرينا وسادة القدم في الفئران Friend Virus B (FVB) التي تشبه فقدان الأنسجة من CLTI. في حين أن الوسائل التقليدية لتقييم التروية مثل التصوير بالليزر دوبلر التروية (LDPI) لا تزال موصى بها ، فإن التروية داخل القلب للصبغة المحبة للدهون 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) تستخدم لتسمية الأوعية الدموية. يسمح الفحص المجهري اللاحق بالليزر متحد البؤرة كامل التركيب بإعادة بناء عالية الدقة ثلاثية الأبعاد (3D) لشبكات الأوعية الدموية في وسادة القدم التي تكمل الوسائل التقليدية لتقييم التروية في نماذج نقص تروية الأطراف الخلفية.
يؤثر مرض الشرايين المحيطية (PAD)، الذي يتميز بانخفاض تدفق الدم إلى الأطراف بسبب تصلب الشرايين، على 6.5 مليون شخص في الولايات المتحدة و200 مليون شخص في جميع أنحاء العالم1. المرضى الذين يعانون من PAD يعانون من انخفاض وظائف الأطراف ونوعية الحياة ، وأولئك الذين يعانون من CLTI ، وهو أشد أشكال PAD ، معرضون لخطر متزايد للبتر والوفاة بمعدل وفيات لمدة 5 سنوات يقترب من 50٪ 2. في الممارسة السريرية ، يعتبر المرضى الذين يعانون من مؤشرات الكاحل العضدي (ABI) <0.9 لديهم PAD ، وأولئك الذين يعانون من ABI <0.4 المرتبطة إما بألم الراحة أو فقدان الأنسجة على أنهم مصابون ب CLTI3. تختلف الأعراض بين المرضى الذين يعانون من ABIs مماثلة اعتمادا على النشاط اليومي ، وتحمل العضلات لنقص التروية ، والاختلافات التشريحية ، والاختلافات في التطور الجانبي4. الغرغرينا الرقمية والأطراف هي أشد مظاهر جميع أمراض انسداد الأوعية الدموية التي تؤدي إلى CLTI. وهو شكل من أشكال النخر الجاف الذي يحنط الأنسجة الرخوة. بالإضافة إلى PAD تصلب الشرايين ، يمكن ملاحظته أيضا في المرضى الذين يعانون من مرض السكري ، والأوعية الدموية مثل مرض بورغر وظاهرة رينود ، أو التأق التكلسي في وضع مرض الكلى في المرحلة النهائية5,6.
تم تطوير العديد من النماذج قبل السريرية لدراسة التسبب في PAD / CLTI واختبار فعالية العلاجات المحتملة ، وأكثرها شيوعا لا يزال نقص تروية الأطراف الخلفية للفئران. عادة ما يتم تحقيق نقص تروية الأطراف الخلفية في الفئران عن طريق عرقلة تدفق الدم من الشرايين الحرقفية أو الفخذية، إما عن طريق ربط الخياطة أو التخثر الكهربائي أو غيرها من الوسائل لتضييق الوعاء المطلوب7. هذه التقنيات تقلل بشكل كبير من التروية إلى الطرف الخلفي وتحفز الأوعية الدموية الجديدة في عضلات الفخذ والساق. ومع ذلك ، هناك اختلافات أساسية تعتمد على سلالة الفئران في الحساسية للإهانة الإقفارية جزئيا بسبب الاختلافات التشريحية في التوزيع الجانبي8,9. على سبيل المثال، الفئران C57BL/6 مقاومة نسبيا لنقص تروية الأطراف الخلفية، مما يدل على انخفاض وظيفة الأطراف ولكن عموما لا يوجد دليل على وجود الغرغرينا في وسادة القدم. من ناحية أخرى ، فإن الفئران BALB / c لديها قدرة ضعيفة بطبيعتها على التعافي من نقص التروية وعادة ما تتطور إلى البتر التلقائي للقدم أو أسفل الساق بعد ربط الشريان الفخذي وحده. هذه الاستجابة الشديدة لنقص التروية تضيق النافذة العلاجية ويمكن أن تمنع التقييم الطولي لتروية الأطراف ووظيفتها. ومن المثير للاهتمام أن الاختلافات الجينية في موضع سمة كمية واحدة تقع على كروموسوم الفئران الفئران 7 قد تورطت في هذه الحساسيات التفاضلية للفئران C57BL/6 و BALB / c لنخر الأنسجة وتروية الأطراف10.
بالمقارنة مع سلالات C57BL/6 و BALB / c ، تظهر فئران FVB استجابة وسيطة ولكنها غير متسقة لربط الشريان الفخذي وحده. تصاب بعض الحيوانات بغرغرينا وسادة القدم في شكل أظافر إقفارية سوداء أو أرقام محنطة ، ولكن البعض الآخر دون أي علامات علنية على نقص التروية11. الإدارة المصاحبة لهيدروكلوريد ميثيل استر Nω-Nitro-L-arginine (L-NAME) ، وهو مثبط لأكسيد النيتريك (NOS) 12 ، يمنع آليات توسيع الأوعية التعويضية ويزيد من الإجهاد التأكسدي في أنسجة الأطراف الخلفية. بالاقتران مع ربط الشريان الفخذي أو تخثره ، ينتج عن هذا النهج باستمرار فقدان أنسجة وسادة القدم في فئران FVB التي تشبه التغيرات الضمورية في CLTI ولكنها نادرا ما تتطور إلى البتر التلقائي للأطراف11. الإجهاد التأكسدي هو أحد السمات المميزة ل PAD / CLTI وينتشر عن طريق الخلل البطاني وانخفاض التوافر البيولوجي لأكسيد النيتريك (NO) 13,14. NO هو جزيء متعدد القدرات يمارس عادة تأثيرات مفيدة على تدفق الدم الشرياني والشعري ، والتصاق الصفائح الدموية وتجميعها ، وتجنيد الكريات البيض وتنشيطها 13. كما ثبت أن المستويات المنخفضة من NOS تنشط الإنزيم المحول للأنجيوتنسين ، والذي يحفز الإجهاد التأكسدي ويسرع تطور تصلب الشرايين15.
بمجرد إنشاء نموذج لنقص تروية الأطراف الخلفية ، هناك حاجة أيضا إلى مراقبة إعادة تروية الأطراف اللاحقة والتأثير العلاجي لأي علاجات محتملة. في نموذج غرغرينا الفئران المقترح ، يمكن أولا تحديد درجة فقدان الأنسجة باستخدام درجة Faber لتقييم المظهر الإجمالي للقدم (0: طبيعي ، 1-5: فقدان الأظافر حيث تمثل النتيجة عدد الأظافر المتأثرة ، 6-10: ضمور الأرقام حيث تمثل النتيجة عدد الأرقام المتأثرة ، 11-12: ضمور القدم الجزئي والكامل ، على التوالي)9. ثم يتم إجراء القياسات الكمية لتروية الأطراف الخلفية عادة باستخدام LDPI ، والذي يعتمد على تفاعلات دوبلر بين ضوء الليزر وخلايا الدم الحمراء للإشارة إلى التروية على مستوى البكسل في منطقة ذات أهمية (ROI)16. في حين أن هذه التقنية كمية وغير غازية ومثالية للقياسات المتكررة، إلا أنها لا توفر تفاصيل تشريحية دقيقة للأوعية الدموية للأطراف الخلفية16. أما طرائق التصوير الأخرى، مثل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT)، وتصوير الأوعية بالرنين المغناطيسي (MRA)، وتصوير الأوعية بالأشعة السينية، فتثبت أنها إما مكلفة، وتتطلب أجهزة متطورة، أو أنها تشكل تحديا تقنيا16. في عام 2008 ، وصف لي وآخرون تقنية لوضع العلامات على الأوعية الدموية داخل شبكية العين باستخدام صبغة الكربوسيانين المحبة للدهون DiI17. يدمج DiI في الخلايا البطانية ، وعن طريق الانتشار المباشر ، يصبغ هياكل الأغشية الوعائية مثل البراعم الوعائية والعمليات الزائفة17،18. نظرا لتوصيله المباشر إلى الخلايا البطانية والطبيعة الفلورية العالية للصبغة ، يوفر هذا الإجراء وضع علامات مكثفة وطويلة الأمد على الأوعية الدموية. في عام 2012 ، قام Boden et al. بتكييف تقنية تروية DiI مع نموذج نقص تروية الأطراف الخلفية الفئران عبر تصوير كامل لعضلات الفخذ المقربة التي تم حصادها بعد ربط الشريان الفخذي 19.
توفر الطريقة الحالية طريقة غير مكلفة نسبيا وممكنة تقنيا لتقييم الأوعية الدموية الجديدة استجابة لنقص تروية الأطراف الخلفية والعلاجات القائمة على الجينات أو الخلايا. في مزيد من التكيف ، يصف هذا البروتوكول تطبيق تروية DiI لتصوير الأوعية الدموية وسادة القدم بدقة عالية و 3D في نموذج الفئران من الغرغرينا الخلفية.
في حين أن نقص تروية الأطراف الخلفية للفأر هو النموذج قبل السريري الأكثر استخداما على نطاق واسع لدراسة الأوعية الدموية الجديدة في PAD و CLTI ، هناك تباين كبير في شدة نقص التروية والانتعاش اعتمادا على سلالة الفأر المحددة المستخدمة وموقع وعدد وطريقة تعطيل الشرايين. يمكن أن يؤدي الجمع بين ربط ال?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من خلال منح إلى Z-J L و OC V من المعاهد الوطنية للصحة [R01HL149452 و VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. كما نشكر مرفق الفحص المجهري والتصوير التابع لمشروع ميامي لعلاج الشلل في كلية الطب بجامعة ميامي على توفير إمكانية الوصول إلى برامج تحليل الصور ومعالجتها.
Binder clips (small) | Office supply store | ||
Buprenorphine (sustained-release) | |||
Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used version 2.1.0. |
HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Ketamine | |||
L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
Needles (27 G) | BD | 305109 | |
Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
Xylazine |