Murin Arka Ekstremite Kangren Modelinde Footpad Vaskülatürünün Yüksek Çözünürlüklü Üç Boyutlu Görüntülenmesi
Summary
Bu protokol, FVB farelerde arka bacak kangrenini indüklemek için femoral arter ve ven elektrokoagülasyonunu nitrik oksit sentaz inhibitörü uygulamasıyla birleştiren benzersiz, klinik olarak ilgili bir periferik arter hastalığı modelini tanımlamaktadır. İntrakardiyak DiI perfüzyonu daha sonra ayak yastığı vaskülatürünün yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu görüntülenmesi için kullanılır.
Abstract
Periferik arter hastalığı (PAH), aterosklerotik risk faktörlerine kronik maruziyet sonucu ortaya çıkan önemli bir morbidite nedenidir. En şiddetli formu olan kronik uzuvları tehdit eden iskemiden (CLTI) muzdarip hastalar, kronik ağrı, ağrısız sınırlı yürüme mesafesi ve iyileşmeyen yaralar dahil olmak üzere günlük yaşamda önemli bozukluklarla karşı karşıyadır. PAD’i incelemek için çeşitli hayvanlarda preklinik modeller geliştirilmiştir, ancak fare arka bacak iskemisi en yaygın kullanılanı olmaya devam etmektedir. Bu modellerde iskemik hakarete cevaben, kullanılan fare suşuna ve arteriyel bozulmanın yerine, sayısına ve araçlarına bağlı olarak önemli farklılıklar olabilir. Bu protokol, CLTI’nin doku kaybına benzeyen Friend Virus B (FVB) farelerinde ayak tabanı kangrenini güvenilir bir şekilde indüklemek için femoral arter ve ven elektrokoagülasyonunu nitrik oksit sentaz (NOS) inhibitörü uygulamasıyla birleştiren benzersiz bir yöntemi açıklamaktadır. Lazer Doppler perfüzyon görüntüleme (LDPI) gibi geleneksel reperfüzyon değerlendirme yöntemleri hala önerilmekle birlikte, vaskülatürü etiketlemek için lipofilik boya 1,1′-dioktadesil-3,3,3′,3′-tetrametilindokarbosiyanin perkloratın (DiI) intrakardiyak perfüzyonu kullanılmaktadır. Daha sonraki tam montajlı konfokal lazer tarama mikroskopisi, arka bacak iskemi modellerinde reperfüzyonu değerlendirmenin geleneksel yollarını tamamlayan ayak yastığı vasküler ağlarının yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyonuna izin verir.
Introduction
Ateroskleroz nedeniyle ekstremitelere kan akışının azalması ile karakterize periferik arter hastalığı (PAD), Amerika Birleşik Devletleri’nde 6,5 milyon kişiyi ve dünya çapında 200 milyon insanı etkilemektedir1. PAD’li hastalar uzuv fonksiyonlarında ve yaşam kalitesinde azalma yaşarken, PAD’in en şiddetli formu olan CLTI’lı hastalar, 5 yıllık mortalite oranı %50’ye yaklaşarak amputasyon ve ölüm riski altındadır2. Klinik pratikte, ayak bileği-brakiyal indeksleri (ABI) <0.9 olan hastalarda PAD, ABI <0.4 olanlarda ise dinlenme ağrısı veya doku kaybı ile ilişkili CLTI3 olarak kabul edilir. Semptomlar benzer ABI’li hastalar arasında günlük aktiviteye, iskemiye karşı kas toleransına, anatomik varyasyonlara ve kollateral gelişimdeki farklılıklara bağlı olarak değişir4. Basamak ve ekstremite kangreni, CLTI ile sonuçlanan tüm vasküler tıkayıcı hastalıkların en şiddetli belirtisidir. Yumuşak dokuları mumyalayan bir kuru nekroz şeklidir. Aterosklerotik PAH’a ek olarak, diyabetli hastalarda, Buerger hastalığı ve Raynaud fenomeni gibi vaskülitlerde veya son dönem böbrek hastalığı ortamında kalsifilaksi hastalarında da gözlenebilir5,6.
PAD/CLTI’nın patogenezini incelemek ve potansiyel tedavilerin etkinliğini test etmek için çeşitli preklinik modeller geliştirilmiştir ve bunlardan en yaygın olanı fare arka bacak iskemisi olmaya devam etmektedir. Farelerde arka bacak iskemisinin indüklenmesi tipik olarak iliak veya femoral arterlerden kan akışının engellenmesiyle, sütür ligasyonu, elektrokoagülasyon veya istenen damarı daraltmanın diğer yollarıyla gerçekleştirilir7. Bu teknikler arka bacağa perfüzyonu büyük ölçüde azaltır ve uyluk ve baldır kaslarında neovaskülarizasyonu uyarır. Bununla birlikte, kısmen kollateral dağılımdaki anatomik farklılıklar nedeniyle iskemik hakarete duyarlılıkta murin suşuna bağlı temel farklılıklar vardır8,9. Örneğin, C57BL / 6 fareleri, arka bacak iskemisine nispeten dirençlidir, uzuv fonksiyonunun azaldığını gösterir, ancak genellikle ayak tabanında kangren kanıtı yoktur. Öte yandan, BALB / c fareleri, iskemiden kurtulmak için doğal olarak zayıf bir kapasiteye sahiptir ve tipik olarak tek başına femoral arter ligasyonunu takiben ayağın veya alt bacağın otomatik amputasyonunu geliştirir. İskemiye verilen bu şiddetli yanıt terapötik pencereyi daraltır ve ekstremite reperfüzyonu ve fonksiyonunun uzunlamasına değerlendirilmesini engelleyebilir. İlginçtir ki, murin kromozomu 7 üzerinde bulunan tek bir kantitatif özellik lokusundaki genetik farklılıklar, C57BL/6 ve BALB/c farelerinin doku nekrozuna ve ekstremite reperfüzyonuna karşı bu diferansiyel duyarlılıklarında rol oynamıştır10.
C57BL / 6 ve BALB / c suşları ile karşılaştırıldığında, FVB fareleri tek başına femoral arter ligasyonuna orta fakat tutarsız bir yanıt göstermektedir. Bazı hayvanlarda siyah iskemik tırnaklar veya mumyalanmış rakamlar şeklinde ayak tabanı kangreni gelişirken, diğerleri herhangi bir açık iskemi belirtisi yoktur11. Bir nitrik oksit sentaz (NOS) inhibitörü olan Nω-Nitro-L-arginin metil ester hidroklorürün (L-NAME)12 eşzamanlı uygulanması, telafi edici vazodilatatör mekanizmaları önler ve arka bacak dokusunda oksidatif stresi daha da arttırır. Femoral arter ligasyonu veya pıhtılaşma ile kombinasyon halinde, bu yaklaşım sürekli olarak FVB farelerde CLTI’nın atrofik değişikliklerine benzeyen ancak nadiren uzuv oto-amputasyonuna ilerleyen ayak yastığı doku kaybına neden olur11. Oksidatif stres, PAD/CLTI’nin ayırt edici özelliklerinden biridir ve endotel disfonksiyonu ve nitrik oksidin (NO)13,14 biyoyararlanımının azalması ile yayılır. NO, genellikle arteriyel ve kılcal kan akışı, trombosit yapışması ve agregasyonu ve lökosit alımı ve aktivasyonu üzerinde yararlı etkiler gösteren pluripotent bir moleküldür13. Azalmış NOS seviyelerinin, oksidatif stresi indükleyen ve aterosklerozun ilerlemesini hızlandıran anjiyotensin dönüştürücü enzimi aktive ettiği de gösterilmiştir15.
Bir arka bacak iskemisi modeli oluşturulduktan sonra, sonraki ekstremite reperfüzyonunun izlenmesi ve herhangi bir potansiyel tedavinin terapötik etkisinin de izlenmesi gerekir. Önerilen murin kangren modelinde, doku kaybının derecesi ilk önce ayağın brüt görünümünü değerlendirmek için Faber skoru kullanılarak ölçülebilir (0: normal, 1-5: skorun etkilenen tırnak sayısını temsil ettiği tırnak kaybı, 6-10: skorun etkilenen basamak sayısını temsil ettiği basamakların atrofisi, 11-12: kısmi ve tam ayak atrofisi, sırasıyla)9. Arka bacak perfüzyonunun kantitatif ölçümleri daha sonra tipik olarak, ilgilenilen bir bölgede (ROI) piksel düzeyinde perfüzyonu belirtmek için lazer ışığı ve kırmızı kan hücreleri arasındaki Doppler etkileşimlerine dayanan LDPI kullanılarak yapılır16. Bu teknik kantitatif, invaziv olmayan ve tekrarlanan ölçümler için ideal olsa da, arka bacak vaskülatürünün granüler anatomik detayını sağlamaz16. Mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-BT), manyetik rezonans anjiyografi (MRA) ve X-ışını mikroanjiyografisi gibi diğer görüntüleme yöntemleri ya maliyetli, sofistike enstrümantasyon gerektiren ya da teknik olarak zorlayıcı olduğu kanıtlanmıştır16. 2008 yılında, Li ve ark. retinadaki kan damarlarını lipofilik karbosiyanin boyası DiI17 ile etiketlemek için bir teknik tanımladılar. DiI, endotel hücrelerine dahil olur ve doğrudan difüzyon yoluyla, anjiyojenik filizler ve psödopodal süreçler gibi vasküler membran yapılarını boyar17,18. Endotel hücrelerine doğrudan verilmesi ve boyanın yüksek floresan doğası nedeniyle, bu prosedür kan damarlarının yoğun ve uzun süreli etiketlenmesini sağlar. 2012 yılında Boden ve ark., femoral arter ligasyonunu takiben hasat edilen uyluk adduktör kaslarının tam montajlı görüntülenmesi yoluyla DiI perfüzyon tekniğini murin arka bacak iskemi modeline uyarlamışlardır19.
Mevcut yöntem, arka bacak iskemisi ve gen veya hücre bazlı terapötiklere yanıt olarak neovaskülarizasyonu değerlendirmek için nispeten ucuz ve teknik olarak uygulanabilir bir yol sunmaktadır. Başka bir uyarlamada, bu protokol, ayak yastığı vaskülatürünü yüksek çözünürlükte ve 3D’de arka bacak kangreninin bir murin modelinde görüntülemek için DiI perfüzyonunun uygulanmasını açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fare arka bacak iskemisi, PAD ve CLTI’da neovaskülarizasyonu incelemek için en yaygın kullanılan preklinik model olsa da, kullanılan spesifik fare suşuna ve arteriyel bozulmanın yerine, sayısına ve yöntemine bağlı olarak iskemi şiddeti ve iyileşmesinde önemli farklılıklar vardır. Femoral arter ligasyonu ve L-NAME’in IP uygulamasının kombinasyonu, FVB farelerde arka bacak kangrenini güvenilir bir şekilde indükleyebilir11. Aynı tedavi, C57BL / 6 farelerde doku kaybı olmadan …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden [R01HL149452 ve VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)] Z-J L ve OC V’ye verilen hibelerle desteklenmiştir. Ayrıca, Miami Üniversitesi Tıp Fakültesi’ndeki Felç Tedavisi için Miami Projesi’nin Mikroskopi ve Görüntüleme Tesisi’ne, görüntü analiz ve işleme yazılımlarına erişim sağladığı için teşekkür ederiz.
Materials
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used version 2.1.0. |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature. Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).
- Mills, J. L., et al. The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI). Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).
- Conte, M. S., et al. Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).
- Yeager, R. A. Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease. Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).
- Al Wahbi, A. Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Parikh, P. P., et al. A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene. Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).
- Kopincová, J., Púzserová, A., Bernátová, I. L-NAME in the cardiovascular system – nitric oxide synthase activator. Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).
- Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).
- McDermott, M. M., et al. Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).
- Usui, M., et al. Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats. Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).
- Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).
- Boden, J., et al. Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI. BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).
- Elfarnawany, M. H. Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography. Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106 (2015).
- Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency. Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
- Ammermann, F., et al. Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography. European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).
- Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).
- Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).
- Hlushchuk, R., Haberthür, D., Djonov, V. Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging. Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Lee, J. J., et al. Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).
