Hochauflösende dreidimensionale Abbildung der Fußpolstervaskulatur in einem murinen Hinterbein-Gangränmodell

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein einzigartiges, klinisch relevantes Modell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit, das die Elektrokoagulation der Oberschenkelarterie und der Venen mit der Verabreichung eines Stickstoffmonoxid-Synthase-Inhibitors kombiniert, um bei FVB-Mäusen Gangrän der Hintergliedmaßen zu induzieren. Die intrakardiale DiI-Perfusion wird dann für die hochauflösende, dreidimensionale Bildgebung des Gefäßes des Fußpolsters verwendet.

Abstract

Die periphere arterielle Verschlusskrankheit (PAVK) ist eine signifikante Ursache für Morbidität, die sich aus einer chronischen Exposition gegenüber atherosklerotischen Risikofaktoren ergibt. Patienten, die an ihrer schwersten Form, der chronischen gliedmaßenbedrohlichen Ischämie (CLTI), leiden, haben erhebliche Beeinträchtigungen des täglichen Lebens, einschließlich chronischer Schmerzen, begrenzter Gehstrecke ohne Schmerzen und nicht heilender Wunden. Präklinische Modelle wurden an verschiedenen Tieren entwickelt, um PAD zu untersuchen, aber die Ischämie der Maus-Hinterbeine bleibt die am weitesten verbreitete. Es kann in diesen Modellen signifikante Unterschiede in der Reaktion auf ischämische Beleidigung geben, abhängig von der verwendeten Mausbelastung und der Stelle, Anzahl und Art der arteriellen Störung. Dieses Protokoll beschreibt eine einzigartige Methode, die die Elektrokoagulation der Oberschenkelarterie und der Venen mit der Verabreichung eines Stickoxid-Synthase-Inhibitors (NOS) kombiniert, um bei FVB-Mäusen (Friend Virus B) zuverlässig Fußpolstergangrän zu induzieren, das dem Gewebeverlust von CLTI ähnelt. Während traditionelle Mittel zur Beurteilung der Reperfusion wie die Laser-Doppler-Perfusionsbildgebung (LDPI) weiterhin empfohlen werden, wird die intrakardiale Perfusion des lipophilen Farbstoffs 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′-tetramethylindocarbocyaninperchlorat (DiI) zur Markierung des Gefäßsystems verwendet. Die anschließende konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie für die gesamte Montierung ermöglicht eine hochauflösende, dreidimensionale (3D) Rekonstruktion von Fußpolster-Gefäßnetzwerken, die traditionelle Mittel zur Beurteilung der Reperfusion in Hindlimb-Ischämiemodellen ergänzt.

Introduction

Die periphere arterielle Verschlusskrankheit (PAVK), die durch einen verminderten Blutfluss zu den Extremitäten aufgrund von Atherosklerose gekennzeichnet ist, betrifft 6,5 Millionen Menschen in den Vereinigten Staaten und 200 Millionen Menschen ^weltweit1. Patienten mit PAD erleben eine verminderte Gliedmaßenfunktion und Lebensqualität, und diejenigen mit CLTI, der schwersten Form von PAVK, haben ein erhöhtes Risiko für Amputation und Tod mit einer 5-Jahres-Sterblichkeitsrate von fast 50%^2. In der klinischen Praxis wird bei Patienten mit Knöchel-Arm-Indizes (ABI) <0,9 PAD und bei Patienten mit ABI <0,4, die entweder mit Ruheschmerzen oder Gewebeverlust assoziiert sind^{, CLTI3} angesehen. Die Symptome variieren bei Patienten mit ähnlichen ABIs in Abhängigkeit von der täglichen Aktivität, der Muskeltoleranz gegenüber Ischämie, anatomischen Variationen und Unterschieden in der Kollateralentwicklung4^. Digit- und Gliedmaßengangrän ist die schwerste Manifestation aller vaskulären Verschlusserkrankungen, die zu CLTI führen. Es ist eine Form der trockenen Nekrose, die die Weichteile mumifiziert. Neben dem atherosklerotischen PAD kann es auch bei Patienten mit Diabetes, Vaskulitiden wie Morbus Buerger und Raynaud-Phänomen oder Calciphylaxie im Endstadium beobachtet ^werden5,6.

Mehrere präklinische Modelle wurden entwickelt, um die Pathogenese von PAVK / CLTI zu untersuchen und die Wirksamkeit potenzieller Behandlungen zu testen, von denen die häufigste nach wie vor eine Ischämie der Maus-Hintergliedmaßen ist. Die Induktion einer Ischämie der Hintergliedmaßen bei Mäusen wird typischerweise durch die Behinderung des Blutflusses aus den Becken- oder Oberschenkelarterien erreicht, entweder durch Nahtligatur, Elektrokoagulation oder andere Mittel zur Verengung des gewünschten ^Gefäßes7. Diese Techniken reduzieren die Durchblutung der Hinterbeine drastisch und stimulieren die Neovaskularisation in der Oberschenkel- und Wadenmuskulatur. Es gibt jedoch wesentliche murine stammabhängige Unterschiede in der Empfindlichkeit gegenüber ischämischer Beleidigung, die teilweise auf anatomische Unterschiede in der Kollateralverteilung zurückzuführen ^sind8,9. Zum Beispiel sind C57BL/6-Mäuse relativ resistent gegen Ischämie der Hinterbeine und zeigen eine verminderte Gliedmaßenfunktion, aber im Allgemeinen keine Hinweise auf Gangrän im Fußpolster. Auf der anderen Seite haben BALB / c-Mäuse eine von Natur aus schlechte Fähigkeit, sich von einer Ischämie zu erholen und entwickeln typischerweise eine Autoamputation des Fußes oder des Unterschenkels nach der Ligatur der Oberschenkelarterie allein. Diese schwere Reaktion auf Ischämie verengt das therapeutische Fenster und kann eine longitudinale Beurteilung der Reperfusion und Funktion der Gliedmaßen ausschließen. Interessanterweise wurden genetische Unterschiede in einem einzigen quantitativen Merkmalslocus auf dem murinen Chromosom 7 mit diesen differentiellen Anfälligkeiten von C57BL/6- und BALB/c-Mäusen für Gewebenekrose und Gliedmaßenreperfusion in Verbindung ^gebracht10.

Im Vergleich zu C57BL/6- und BALB/c-Stämmen zeigen FVB-Mäuse eine intermediäre, aber inkonsistente Reaktion auf die Ligatur der Oberschenkelarterie allein. Einige Tiere entwickeln Fußpolstergangrän in Form von schwarzen ischämischen Nägeln oder mumifizierten Ziffern, wieder andere ohne offensichtliche Anzeichen von ^Ischämie11. Die gleichzeitige Gabe von Nω-Nitro-L-arginininmethylesterhydrochlorid (L-NAME), einem Stickstoffmonoxidsynthase (NOS^{)-Inhibitor12,} verhindert kompensatorische vasodilatatorische Mechanismen und erhöht den oxidativen Stress im Hinterbeingewebe weiter. In Kombination mit der Ligatur oder Koagulation der Oberschenkelarterie führt dieser Ansatz bei FVB-Mäusen konsequent zu einem Verlust von Fußpolstergewebe, der den atrophischen Veränderungen von CLTI ähnelt, aber selten zu einer Selbstamputation der Gliedmaßen ^{fortschreitet11.} Oxidativer Stress ist eines der Markenzeichen von PAD/CLTI und wird durch endotheliale Dysfunktion und verminderte Bioverfügbarkeit von Stickstoffmonoxid (NO)^13,14 verbreitet. NO ist ein pluripotentes Molekül, das in der Regel positive Auswirkungen auf den arteriellen und kapillaren Blutfluss, die Adhäsion und Aggregation von Blutplättchen sowie die Rekrutierung und Aktivierung von Leukozyten ^ausübt13. Es wurde auch gezeigt, dass reduzierte NOS-Spiegel das Angiotensin-Converting-Enzym aktivieren, das oxidativen Stress induziert und das Fortschreiten der Atherosklerose ^{beschleunigt15.}

Sobald ein Modell der Ischämie der Hintergliedmaßen etabliert ist, ist auch die Überwachung der nachfolgenden Reperfusion der Gliedmaßen und der therapeutischen Wirkung potenzieller Behandlungen erforderlich. Im vorgeschlagenen murinen Gangränmodell kann der Grad des Gewebeverlusts zunächst mit dem Faber-Score quantifiziert werden, um das grobe Erscheinungsbild des Fußes zu beurteilen (0: normal, 1-5: Verlust von Nägeln, wobei der Score die Anzahl der betroffenen Nägel darstellt, 6-10: Atrophie der Ziffern, wobei der Score die Anzahl der betroffenen Ziffern darstellt, 11-12: teilweise und vollständige Fußatrophie, (⁹) Quantitative Messungen der Perfusion der Hinterbeine werden dann typischerweise mit LDPI durchgeführt, das auf Doppler-Wechselwirkungen zwischen Laserlicht und roten Blutkörperchen beruht, um eine Perfusion auf Pixelebene in einer Region von Interesse (ROI) ^anzuzeigen16. Während diese Technik quantitativ, nicht-invasiv und ideal für wiederholte Messungen ist, liefert sie keine granularen anatomischen Details des Gefäßsystems der ^{Hinterbeine16.} Andere Bildgebungsmodalitäten wie die Mikrocomputertomographie (Mikro-CT), die Magnetresonanzangiographie (MRA) und die Röntgenmikroangiographie erweisen sich entweder als kostspielig, erfordern eine ausgeklügelte Instrumentierung oder sind anderweitig technisch ^{anspruchsvoll16.} Im Jahr 2008 beschrieben Li et al. eine Technik zur Markierung von Blutgefäßen innerhalb der Netzhaut mit dem lipophilen Carbocyaninfarbstoff ^DiI17. DiI integriert sich in Endothelzellen und färbt durch direkte Diffusion vaskuläre Membranstrukturen wie angiogene Sprossen und pseudopodale ^{Prozesse17,18}. Aufgrund seiner direkten Abgabe in Endothelzellen und der stark fluoreszierenden Natur des Farbstoffs ermöglicht dieses Verfahren eine intensive und lang anhaltende Markierung der Blutgefäße. Im Jahr 2012 passten Boden et al. die Technik der DiI-Perfusion an das Modell der murinen Hinterbein-Ischämie an, indem sie die geernteten Oberschenkeladduktorenmuskeln nach der Ligatur der Oberschenkelarterie vollständig ^aufnahmen19.

Die aktuelle Methode bietet eine relativ kostengünstige und technisch machbare Möglichkeit, die Neovaskularisation als Reaktion auf eine Ischämie der Hintergliedmaßen und gen- oder zellbasierte Therapeutika zu beurteilen. In einer weiteren Anpassung beschreibt dieses Protokoll die Anwendung der DiI-Perfusion, um das Gefäßsystem des Fußpolsters in hoher Auflösung und 3D in einem murinen Modell von Hinterbeingangrän abzubilden.

Protocol

Alle im Protokoll beschriebenen Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Miami genehmigt. FVB-Mäuse, sowohl männliche als auch weibliche, im Alter von 8-12 Wochen, wurden für die Studie verwendet. 1. Herstellung der L-NAME-Lösung Bereiten Sie unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube eine L-NAME-Stammlösung vor, indem Sie 1 g L-NAME-Pulver (siehe Materialtabelle) mit 20 ml sterile…

Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt ein zuverlässiges Mittel zur Induktion von Ischämie und Gewebeverlust im murinen Fußpolster unter Verwendung einer Kombination aus Oberschenkelarterie und Venenkoagulation mit L-NAME-Verabreichung, einem Stickstoffmonoxid-Synthase-Hemmer, bei anfälligen FVB-Mäusen. Abbildung 1 zeigt die Anatomie der vaskulatur der murinen Hinterbeine und zeigt die Stellen der Oberschenkelarterie und der Venengerinnung (gelbes X), nur proximal zur lateralen zirkumflexen Obersc…

Discussion

Während die Ischämie der Maus-Hintergliedmaßen das am weitesten verbreitete präklinische Modell zur Untersuchung der Neovaskularisation bei PAD und CLTI ist, gibt es signifikante Unterschiede in der Schwere und Genesung der Ischämie, abhängig von dem spezifischen verwendeten Mausstamm und der Stelle, Anzahl und Methode der arteriellen Störung. Die Kombination aus Femurarterieligatur und IP-Verabreichung von L-NAME kann bei FVB-Mäusen zuverlässig Gangrän der Hintergliedmaßen ^{induzieren11.</sup…}

Materials

Binder clips (small)	Office supply store
Buprenorphine (sustained-release)
Butterfly needle (25 G with Luer-Lok)	VWR	10148-584
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP5
DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)	Invitrogen	D282
Electrocautery device	Gemini Cautery System	5917
Ethanol (100%)	VWR	89370-084
Fiji (ImageJ) software	NIH		Used version 2.1.0. Free download, no license required.
Foam biopsy pads	Fisher Scientific	22-038-221
Formalin (neutral buffered, 10%)	VWR	89370-094
FVB mice	Jackson Laboratory	001800
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Used version 2.1.0.
HCl (1 M)	Sigma-Aldrich	13-1700
Imaris software	Oxford Instruments		Used version 9.6.0.
Isoflurane	Pivetal	NDC 46066-755-04
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Ketamine
L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride)	Sigma-Aldrich	N5751
Laser Doppler perfusion imager	MoorLDI	moorLDI2-HIR	Used moorLDI V5 software.
Microscope slides (25 x 75 x 1 mm)	VWR	48311-703
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282
NaOH	Sigma-Aldrich	S8263
Needles (27 G)	BD	305109
Povidone-iodine swabstick (10%)	Medline	MDS093901ZZ
Surgical instruments	Roboz Surgical		Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended.
Suture (5-0 absorbable)	DemeTECH	G275017B0P
Syringes (10 mL)	BD	305482
Three-way stopcocks	Cole-Parmer	19406-49
Vascular Analysis Plugin			Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015).
Xylazine