Tredimensionel billeddannelse i høj opløsning af fodpudevaskulaturen i en Murine Hindlimb Gangrene Model
Summary
Den nuværende protokol beskriver en unik, klinisk relevant model af perifer arteriel sygdom, der kombinerer lårbensarterie og veneelektrokoagulering med administration af en nitrogenoxidsyntasehæmmer for at inducere bagbengangren i FVB-mus. Intrakardial DiI-perfusion anvendes derefter til tredimensionel billeddannelse i høj opløsning af fodpudens vaskulatur.
Abstract
Perifer arteriel sygdom (PAD) er en væsentlig årsag til sygelighed som følge af kronisk eksponering for aterosklerotiske risikofaktorer. Patienter, der lider af sin mest alvorlige form, kronisk lemmer-truende iskæmi (CLTI), står over for betydelige svækkelser i dagligdagen, herunder kroniske smerter, begrænset gåafstand uden smerte og nonhealing sår. Prækliniske modeller er blevet udviklet i forskellige dyr for at studere PAD, men musehænglet iskæmi er fortsat den mest anvendte. Der kan være betydelig variation som reaktion på iskæmisk fornærmelse i disse modeller afhængigt af den anvendte musestamme og stedet, antallet og midlerne til arteriel forstyrrelse. Denne protokol beskriver en unik metode, der kombinerer lårbensarterie og veneelektrokoagulering med administration af en nitrogenoxidsyntase (NOS) hæmmer for pålideligt at inducere fodpudegangren i Friend Virus B (FVB) mus, der ligner vævstabet af CLTI. Mens traditionelle midler til vurdering af reperfusion såsom laser Doppler perfusionsbilleddannelse (LDPI) stadig anbefales, anvendes intrakardiel perfusion af det lipofile farvestof 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyaninperchlorat (DiI) til at mærke vaskulaturen. Efterfølgende helmonteret konfokal laserscanningsmikroskopi muliggør højopløselig, tredimensionel (3D) rekonstruktion af fodpudevaskulære netværk, der supplerer traditionelle midler til vurdering af reperfusion i bagbensiskæmimodeller.
Introduction
Perifer arteriel sygdom (PAD), der er karakteriseret ved nedsat blodgennemstrømning til ekstremiteterne på grund af aterosklerose, påvirker 6,5 millioner mennesker i USA og 200 millioner mennesker over hele verden1. Patienter med PAD oplever nedsat lemfunktion og livskvalitet, og dem med CLTI, den mest alvorlige form for PAD, har øget risiko for amputation og død med en 5-årig dødelighed, der nærmer sig 50%2. I klinisk praksis anses patienter med ankel-brachiale indekser (ABI) <0,9 for at have PAD, og dem med ABI <0,4 forbundet med enten hvilesmerter eller vævstab som havende CLTI3. Symptomerne varierer blandt patienter med lignende ABI’er afhængigt af daglig aktivitet, muskeltolerance over for iskæmi, anatomiske variationer og forskelle i sikkerhedsudvikling4. Ciffer og lemmer koldbrand er den mest alvorlige manifestation af alle vaskulære okklusive sygdomme, der resulterer i CLTI. Det er en form for tør nekrose, der mumificerer det bløde væv. Ud over aterosklerotisk PAD kan det også observeres hos patienter med diabetes, vaskulitider såsom Buerger’s sygdom og Raynauds fænomen eller calciphylaxis i indstillingen af nyresygdom i slutstadiet5,6.
Flere prækliniske modeller er blevet udviklet til at studere patogenesen af PAD / CLTI og teste effekten af potentielle behandlinger, hvoraf den mest almindelige forbliver musehælkæmi. Inducerende bagbensiskæmi hos mus opnås typisk ved obstruktion af blodgennemstrømningen fra iliac- eller lårbensarterierne, enten ved suturligation, elektrokoagulation eller andre midler til at indsnævre det ønskede kar7. Disse teknikker reducerer drastisk perfusion til bagbenet og stimulerer neovaskularisering i lår- og lægmusklerne. Der er dog væsentlige murine-stammeafhængige forskelle i følsomhed over for iskæmisk fornærmelse, delvis på grund af anatomiske forskelle i sikkerhedsfordeling8,9. For eksempel er C57BL/6-mus relativt resistente over for bagbensiskæmi, hvilket viser nedsat lemfunktion, men generelt ingen tegn på koldbrand i fodpuden. På den anden side har BALB / c-mus en iboende dårlig kapacitet til at komme sig efter iskæmi og udvikler typisk auto amputation af foden eller underbenet efter lårbensarterieligation alene. Denne alvorlige reaktion på iskæmi indsnævrer det terapeutiske vindue og kan udelukke langsgående vurdering af lemmer reperfusion og funktion. Interessant nok har genetiske forskelle i et enkelt kvantitativt træk locus placeret på murinkromosom 7 været impliceret i disse differentielle modtageligheder af C57BL/6 og BALB/c mus til vævsnekrose og lemmer reperfusion10.
Sammenlignet med C57BL/6 og BALB/c stammer viser FVB-mus et mellemliggende, men inkonsekvent respons på lårbensarterieligation alene. Nogle dyr udvikler gangren i form af sorte iskæmiske negle eller mumificerede cifre, mens andre uden åbenlyse tegn på iskæmi11. Samtidig administration af Nω-Nitro-L-argininmethylesterhydrochlorid (L-NAME), en nitrogenoxidsyntase (NOS)-hæmmer12, forhindrer kompenserende vasodilatoriske mekanismer og øger yderligere oxidativt stress i bagbensvæv. I kombination med lårbensarterieligation eller koagulation producerer denne tilgang konsekvent fodpudevævstab hos FVB-mus, der ligner de atrofiske ændringer af CLTI, men sjældent udvikler sig til lemmer auto-amputation11. Oxidativ stress er et af kendetegnene ved PAD / CLTI og formeres af endoteldysfunktion og nedsat biotilgængelighed af nitrogenoxid (NO) 13,14. NO er et pluripotent molekyle, der normalt udøver gavnlige virkninger på arteriel og kapillær blodgennemstrømning, blodpladeadhæsion og aggregering og leukocytrekruttering og aktivering13. Reducerede niveauer af NOS har også vist sig at aktivere det angiotensinkonverterende enzym, som inducerer oxidativt stress og fremskynder udviklingen af åreforkalkning15.
Når en model af bagbensiskæmi er etableret, er der også behov for overvågning af efterfølgende lemmereperfusion og den terapeutiske virkning af eventuelle behandlinger. I den foreslåede murinegangrenmodel kan graden af vævstab først kvantificeres ved hjælp af Faber-scoren til vurdering af fodens bruttoudseende (0: normal, 1-5: tab af negle, hvor score repræsenterer antallet af berørte negle, 6-10: atrofi af cifre, hvor score repræsenterer antallet af berørte cifre, 11-12: delvis og fuldstændig fodatrofi, henholdsvis)9. Kvantitative målinger af bagbensperfusion foretages derefter typisk ved hjælp af LDPI, som er afhængig af Doppler-interaktioner mellem laserlys og røde blodlegemer for at indikere perfusion på pixelniveau i en region af interesse (ROI)16. Selvom denne teknik er kvantitativ, ikke-invasiv og ideel til gentagne målinger, giver den ikke granulære anatomiske detaljer i bagbensvaskulaturen16. Andre billeddannelsesmetoder, såsom mikrocomputertomografi (mikro-CT), magnetisk resonansangiografi (MRA) og røntgenmikroangiografi, viser sig enten at være dyre, kræver sofistikeret instrumentering eller på anden måde teknisk udfordrende16. I 2008 beskrev Li et al. en teknik til mærkning af blodkar i nethinden med det lipofile carbocyaninfarvestof DiI17. DiI inkorporerer i endotelceller og pletter ved direkte diffusion vaskulære membranstrukturer såsom angiogene spirer og pseudopodale processer17,18. På grund af dets direkte levering til endotelceller og farvestoffets stærkt fluorescerende karakter giver denne procedure intens og langvarig mærkning af blodkar. I 2012 tilpassede Boden et al. teknikken diI-perfusion til murine hindlimb iskæmi-modellen via helmonteret billeddannelse af høstede lår adduktormuskler efter lårbensarterieligation19.
Den nuværende metode giver en relativt billig og teknisk gennemførlig måde at vurdere neovaskularisering som reaktion på bagbensiskæmi og gen- eller cellebaseret terapi. I en yderligere tilpasning beskriver denne protokol anvendelsen af DiI-perfusion til at afbilde fodpudevaskulaturen i høj opløsning og 3D i en murinmodel af bagbengangren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens musehælkæmi er den mest anvendte prækliniske model til at studere neovaskularisering i PAD og CLTI, er der signifikant variation i iskæmi sværhedsgrad og genopretning afhængigt af den specifikke musestamme, der anvendes, og stedet, antallet og metoden til arteriel forstyrrelse. Kombinationen af lårbensarterieligation og IP-administration af L-NAME kan pålideligt inducere bagbengangren i FVB-mus11. Den samme behandling resulterer i bagbensiskæmi uden vævstab hos C57BL/6-mus, mens aut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud til Z-J L og OC V fra National Institutes of Health [R01HL149452 og VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Vi takker også Mikroskopi og Imaging Facility i Miami Project to Cure Paralysis ved University of Miami School of Medicine for at give adgang til deres billedanalyse- og behandlingssoftware.
Materials
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used version 2.1.0. |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature. Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).
- Mills, J. L., et al. The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI). Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).
- Conte, M. S., et al. Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).
- Yeager, R. A. Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease. Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).
- Al Wahbi, A. Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Parikh, P. P., et al. A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene. Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).
- Kopincová, J., Púzserová, A., Bernátová, I. L-NAME in the cardiovascular system – nitric oxide synthase activator. Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).
- Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).
- McDermott, M. M., et al. Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).
- Usui, M., et al. Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats. Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).
- Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).
- Boden, J., et al. Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI. BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).
- Elfarnawany, M. H. Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography. Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106 (2015).
- Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency. Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
- Ammermann, F., et al. Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography. European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).
- Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).
- Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).
- Hlushchuk, R., Haberthür, D., Djonov, V. Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging. Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Lee, J. J., et al. Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).
