वर्तमान प्रोटोकॉल परिधीय धमनी रोग के एक अद्वितीय, नैदानिक रूप से प्रासंगिक मॉडल का वर्णन करता है जो एफवीबी चूहों में हिंडलिंब गैंग्रीन को प्रेरित करने के लिए नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ अवरोधक के प्रशासन के साथ ऊरु धमनी और शिरा इलेक्ट्रोकोगुलेशन को जोड़ता है। इंट्राकार्डियक डीआईआई परफ्यूजन का उपयोग तब फुटपैड वास्कुलचर के उच्च-रिज़ॉल्यूशन, तीन-आयामी इमेजिंग के लिए किया जाता है।
परिधीय धमनी रोग (पीएडी) एथेरोस्क्लेरोटिक जोखिम कारकों के क्रोनिक एक्सपोजर के परिणामस्वरूप रुग्णता का एक महत्वपूर्ण कारण है। अपने सबसे गंभीर रूप से पीड़ित रोगियों, पुरानी अंग-धमकी ischemia (CLTI), पुराने दर्द, दर्द के बिना सीमित चलने की दूरी, और nonhealing घावों सहित दैनिक जीवन के लिए पर्याप्त हानि का सामना करना पड़ता है। पैड का अध्ययन करने के लिए विभिन्न जानवरों में प्रीक्लिनिकल मॉडल विकसित किए गए हैं, लेकिन माउस हिंडलिंब इस्केमिया सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। इन मॉडलों में इस्केमिक अपमान के जवाब में महत्वपूर्ण भिन्नता हो सकती है जो उपयोग किए गए माउस तनाव और साइट, संख्या और धमनी व्यवधान के साधनों पर निर्भर करती है। यह प्रोटोकॉल एक नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (एनओएस) अवरोधक के प्रशासन के साथ ऊरु धमनी और शिरा इलेक्ट्रोकोएगुलेशन के संयोजन की एक अनूठी विधि का वर्णन करता है ताकि मित्र वायरस बी (एफवीबी) चूहों में फुटपैड गैंग्रीन को मज़बूती से प्रेरित किया जा सके जो सीएलटीआई के ऊतक हानि जैसा दिखता है। जबकि लेजर डॉपलर परफ्यूजन इमेजिंग (एलडीपीआई) जैसे रिपरफ्यूजन का आकलन करने के पारंपरिक साधनों की अभी भी सिफारिश की जाती है, लिपोफिलिक डाई 1,1′-डायोक्टाडेसिल-3,3,3′, 3′-टेट्रामेथिलिनडोकार्बोसायनिन पर्क्लोरेट (डीआईआई) के इंट्राकार्डियक परफ्यूजन का उपयोग वास्कुलचर को लेबल करने के लिए किया जाता है। बाद में पूरे माउंट confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी उच्च संकल्प के लिए अनुमति देता है, तीन आयामी (3 डी) footpad संवहनी नेटवर्क के पुनर्निर्माण है कि hindlimb ischemia मॉडल में reperfusion का आकलन करने के पारंपरिक साधनों के पूरक.
परिधीय धमनी रोग (पीएडी), एथेरोस्क्लेरोसिस के कारण चरम सीमाओं में कम रक्त प्रवाह की विशेषता है, संयुक्त राज्य अमेरिका में 6.5 मिलियन लोगों और दुनिया भर में 200 मिलियन लोगों को प्रभावित करता है। पीएडी अनुभव वाले रोगियों ने अंग समारोह और जीवन की गुणवत्ता को कम कर दिया है, और सीएलटीआई वाले लोग, पीएडी का सबसे गंभीर रूप, 5 साल की मृत्यु दर के साथ विच्छेदन और मृत्यु के लिए जोखिम में वृद्धि हुई है। नैदानिक अभ्यास में, टखने-ब्रेकियल इंडेक्स (एबीआई) <0.9 वाले रोगियों को पीएडी माना जाता है, और एबीआई <0.4 वाले रोगियों को सीएलटीआई 3 होने के रूप में आराम के दर्द या ऊतक हानि से जुड़ा हुआ है। लक्षण दैनिक गतिविधि के आधार पर समान एबीआई वाले रोगियों के बीच भिन्न होते हैं, इस्किमिया के लिए मांसपेशियों की सहिष्णुता, एनाटॉमिक विविधताएं, और संपार्श्विक विकास में अंतर 4। अंक और अंग गैंग्रीन सभी संवहनी occlusive रोगों है कि CLTI में परिणाम की सबसे गंभीर अभिव्यक्ति है. यह शुष्क परिगलन का एक रूप है जो नरम ऊतकों को ममीफ करता है। एथेरोस्क्लेरोटिक पीएडी के अलावा, यह मधुमेह के रोगियों में भी देखा जा सकता है, जैसे कि बुएर्गर की बीमारी और रेनॉड की घटना, या अंत-चरण गुर्दे की बीमारी की स्थापना में कैल्सीफिलैक्सिस 5,6।
पीएडी / सीएलटीआई के रोगजनन का अध्ययन करने और संभावित उपचारों की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए कई प्रीक्लिनिकल मॉडल विकसित किए गए हैं, जिनमें से सबसे आम माउस हिंडलिंब इस्केमिया बना हुआ है। चूहों में हिंडलिंब इस्केमिया को प्रेरित करना आमतौर पर इलियाक या ऊरु धमनियों से रक्त प्रवाह की बाधा से पूरा होता है, या तो सीवन बंधाव, इलेक्ट्रोकोगुलेशन, या वांछित पोत को संकुचित करने के अन्य साधनों द्वारा। ये तकनीकें हिंडलिंब में परफ्यूजन को काफी कम करती हैं और जांघ और बछड़े की मांसपेशियों में नवसंवहनीकरण को उत्तेजित करती हैं। हालांकि, संपार्श्विक वितरण में शारीरिक मतभेदों के कारण आंशिक रूप से इस्केमिक अपमान के प्रति संवेदनशीलता में आवश्यक मुरीन तनाव-निर्भर अंतर हैं8,9। उदाहरण के लिए, C57BL /6 चूहे हिंडलिंब इस्केमिया के लिए अपेक्षाकृत प्रतिरोधी हैं, जो कम अंग समारोह का प्रदर्शन करते हैं, लेकिन आम तौर पर फुटपैड में गैंग्रीन का कोई सबूत नहीं है। दूसरी ओर, BALB / c चूहों में ischemia से उबरने के लिए एक स्वाभाविक रूप से खराब क्षमता होती है और आमतौर पर अकेले ऊरु धमनी बंधाव के बाद पैर या निचले पैर के ऑटो-विच्छेदन का विकास होता है। ischemia के लिए इस गंभीर प्रतिक्रिया चिकित्सीय खिड़की को संकीर्ण करता है और अंग reperfusion और समारोह के अनुदैर्ध्य मूल्यांकन को रोक सकते हैं. दिलचस्प बात यह है कि, मुरीन गुणसूत्र 7 पर स्थित एक एकल मात्रात्मक विशेषता लोकस में आनुवंशिक अंतर को ऊतक परिगलन और अंग reperfusion10 के लिए C57BL / 6 और BALB / c चूहों की इन विभेदक संवेदनशीलताओं में फंसाया गया है।
C57BL/6 और BALB/c उपभेदों की तुलना में, FVB चूहे अकेले ऊरु धमनी बंधाव के लिए एक मध्यवर्ती लेकिन असंगत प्रतिक्रिया प्रदर्शित करते हैं। कुछ जानवरों काले ischemic नाखून या mummified अंकों के रूप में footpad gangrene विकसित, फिर भी ischemia11 के किसी भी overt संकेत के बिना दूसरों. Nω-Nitro-L-arginine मिथाइल एस्टर हाइड्रोक्लोराइड (L-NAME), एक नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (NOS) अवरोधक 12 का सहवर्ती प्रशासन, प्रतिपूरक वासोडिलेटरी तंत्र को रोकता है और हिंडलिंब ऊतक में ऑक्सीडेटिव तनाव को बढ़ाता है। ऊरु धमनी बंधाव या जमावट के साथ संयोजन में, यह दृष्टिकोण लगातार एफवीबी चूहों में फुटपैड ऊतक हानि का उत्पादन करता है जो सीएलटीआई के एट्रोफिक परिवर्तनों जैसा दिखता है लेकिन शायद ही कभी अंग ऑटो-विच्छेदन 11 में प्रगति करता है। ऑक्सीडेटिव तनाव पीएडी / सीएलटीआई की पहचान में से एक है और एंडोथेलियल डिसफंक्शन और नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ) 13,14 की कम जैव उपलब्धता द्वारा प्रचारित किया जाता है। NO एक प्लुरिपोटेंट अणु है जो आमतौर पर धमनी और केशिका रक्त प्रवाह, प्लेटलेट आसंजन और एकत्रीकरण, और ल्यूकोसाइट भर्ती और सक्रियण 13 पर लाभकारी प्रभाव डालता है। एनओएस के कम स्तर को एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम को सक्रिय करने के लिए भी दिखाया गया है, जो ऑक्सीडेटिव तनाव को प्रेरित करता है और एथेरोस्क्लेरोसिस 15 की प्रगति को तेज करता है।
एक बार hindlimb ischemia का एक मॉडल स्थापित किया जाता है, बाद के अंग reperfusion और किसी भी संभावित उपचार के चिकित्सीय प्रभाव की निगरानी भी आवश्यक हैं। प्रस्तावित मुरीन गैंग्रीन मॉडल में, पैर की सकल उपस्थिति का आकलन करने के लिए फेबर स्कोर का उपयोग करके ऊतक हानि की डिग्री को पहले परिमाणित किया जा सकता है (0: सामान्य, 1-5: नाखूनों का नुकसान जहां स्कोर प्रभावित नाखूनों की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है, 6-10: अंकों का शोष जहां स्कोर प्रभावित अंकों की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है, 11-12: आंशिक और पूर्ण पैर शोष, क्रमशः) 9. हिंडलिंब परफ्यूजन के मात्रात्मक माप को आमतौर पर एलडीपीआई का उपयोग करके बनाया जाता है, जो ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) 16 में पिक्सेल-स्तर परफ्यूजन को इंगित करने के लिए लेजर लाइट और लाल रक्त कोशिकाओं के बीच डॉपलर इंटरैक्शन पर निर्भर करता है। जबकि यह तकनीक मात्रात्मक, गैर-आक्रामक और दोहराए गए माप के लिए आदर्श है, यह हिंडलिंब वास्कुलचर 16 का दानेदार शारीरिक विवरण प्रदान नहीं करती है। अन्य इमेजिंग तौर-तरीके, जैसे माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रो-सीटी), चुंबकीय अनुनाद एंजियोग्राफी (एमआरए), और एक्स-रे माइक्रोएंजियोग्राफी, या तो महंगे साबित होते हैं, जिसमें परिष्कृत इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता होती है, या अन्यथा तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण 16। 2008 में, ली एट अल ने लिपोफिलिक कार्बोसाइनिन डाई DiI17 के साथ रेटिना के भीतर रक्त वाहिकाओं को लेबल करने के लिए एक तकनीक का वर्णन किया। डीआईआई एंडोथेलियल कोशिकाओं में शामिल है और प्रत्यक्ष प्रसार द्वारा, संवहनी झिल्ली संरचनाओं जैसे एंजियोजेनिक स्प्राउट्स और स्यूडोपोडल प्रक्रियाओं को दागता है17,18। एंडोथेलियल कोशिकाओं में इसके प्रत्यक्ष वितरण और डाई की अत्यधिक फ्लोरोसेंट प्रकृति के कारण, यह प्रक्रिया रक्त वाहिकाओं की तीव्र और लंबे समय तक चलने वाली लेबलिंग प्रदान करती है। 2012 में, बोडेन एट अल ने डीआईआई परफ्यूजन की तकनीक को मुरीन हिंडलिंब इस्केमिया मॉडल के लिए अनुकूलित किया, जो ऊरु धमनी बंधाव के बाद काटी गई जांघ एडक्टर मांसपेशियों के पूरे-माउंट इमेजिंग के माध्यम से था।
वर्तमान विधि hindlimb ischemia और जीन या सेल आधारित चिकित्सीय के जवाब में neovascularization का आकलन करने के लिए एक अपेक्षाकृत सस्ती और तकनीकी रूप से व्यवहार्य तरीका प्रदान करता है। एक और अनुकूलन में, यह प्रोटोकॉल उच्च रिज़ॉल्यूशन में फुटपैड वास्कुलचर की छवि के लिए डीआईआई परफ्यूजन के आवेदन का वर्णन करता है और हिंडलिंब गैंग्रीन के एक मुरीन मॉडल में 3 डी।
जबकि माउस hindlimb ischemia PAD और CLTI में neovascularization का अध्ययन करने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया preclinical मॉडल है, वहाँ ischemia गंभीरता और वसूली में महत्वपूर्ण भिन्नता विशिष्ट माउस तनाव और साइट, संख्या, और धमनी व्यवधान …
The authors have nothing to disclose.
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों [R01HL149452 और VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)] से Z-J L और OC V को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम मियामी परियोजना की माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग सुविधा को भी धन्यवाद देते हैं ताकि मियामी स्कूल ऑफ मेडिसिन विश्वविद्यालय में उनकी छवि विश्लेषण और प्रसंस्करण सॉफ़्टवेयर तक पहुंच प्रदान की जा सके।
Binder clips (small) | Office supply store | ||
Buprenorphine (sustained-release) | |||
Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used version 2.1.0. |
HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Ketamine | |||
L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
Needles (27 G) | BD | 305109 | |
Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
Xylazine |