マウス後肢壊疽モデルにおける足蹠血管系の高解像度3次元イメージング
Summary
本プロトコールは、FVBマウスにおいて後肢壊疽を誘導するための一酸化窒素合成酵素阻害剤の投与と大腿動脈動脈および静脈電気凝固を組み合わせた末梢動脈疾患のユニークで臨床的に関連するモデルを記載する。心臓内DiI灌流は、その後、足蹠血管系の高解像度、3次元イメージングに使用されます。
Abstract
末梢動脈疾患(PAD)は、アテローム性動脈硬化性危険因子への慢性曝露に起因する罹患率の重要な原因である。その最も重篤な形態、慢性四肢を脅かす虚血(CLTI)に罹患している患者は、慢性疼痛、痛みのない限られた歩行距離、および治癒しない創傷を含む日常生活に対する実質的な障害に直面する。PADを研究するために様々な動物において前臨床モデルが開発されてきたが、マウス後肢虚血は依然として最も広く使用されている。これらのモデルにおける虚血性侮辱に対する応答には、使用されるマウス系統、ならびに動脈破壊の部位、数、および手段に応じて有意な変動があり得る。このプロトコルは、CLTIの組織喪失に似たフレンドウイルスB(FVB)マウスにおいて足蹠壊疽を確実に誘導するために、大腿動脈および静脈電気凝固を一酸化窒素合成酵素(NOS)阻害剤の投与と組み合わせるユニークな方法を記載している。レーザードップラー灌流イメージング(LDPI)などの再灌流を評価する従来の手段が依然として推奨されているが、親油性色素1,1′-ジオクタデシル-3,3,3′,3′-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩(DiI)の心臓内灌流は、血管系を標識するために使用される。その後のホールマウント共焦点レーザー走査顕微鏡は、後肢虚血モデルにおける再灌流を評価する従来の手段を補完する足蹠血管網の高解像度、3次元(3D)再構成を可能にする。
Introduction
末梢動脈疾患(PAD)は、アテローム性動脈硬化症による四肢への血流の減少を特徴とし、米国では650万人、世界では2億人が罹患しています1。PAD患者は四肢機能と生活の質の低下を経験し、最も重篤な形態のPADであるCLTI患者は切断および死亡のリスクが高く、5年間の死亡率は50%に近づいています2。臨床現場では、足首上腕指数(ABI)<0.9の患者はPADを有すると考えられ、ABI<0.4の患者はCLTI3を有するとして安静痛または組織喪失のいずれかに関連する。症状は、毎日の活動、虚血に対する筋肉の耐性、解剖学的変異、および側副発達の違いに応じて、同様のABIを有する患者間で変化する4。数字および四肢壊疽は、CLTIをもたらすすべての血管閉塞性疾患の中で最も重篤な症状である。それは軟部組織をミイラ化する乾燥壊死の一形態である。アテローム性動脈硬化性PADに加えて、糖尿病、バージャー病やレイノー現象などの血管炎、または末期腎疾患の設定におけるカルシフィラキシーの患者でも観察することができます5,6。
PAD/CLTIの病因を研究し、潜在的な治療法の有効性をテストするために、いくつかの前臨床モデルが開発されており、最も一般的なものはマウス後肢虚血のままである。マウスにおける後肢虚血の誘導は、典型的には、縫合結紮、電気凝固、または所望の血管を狭窄させる他の手段のいずれかによって、腸骨動脈または大腿動脈からの血流の閉塞によって達成される7。これらの技術は、後肢への灌流を劇的に減少させ、大腿部およびふくらはぎの筋肉における新生血管新生を刺激する。しかし、虚血性侮辱に対する感受性には、副次的分布の解剖学的差異に部分的に起因して、マウス系統依存的な本質的な違いがある8,9。例えば、C57BL/6マウスは後肢虚血に対して比較的耐性があり、四肢機能の低下を実証するが、一般に足蹠に壊疽の証拠はない。一方、BALB/cマウスは虚血からの回復能力が本質的に乏しく、典型的には大腿動脈結紮のみの後に足または下肢の自己切断を発症する。虚血に対するこの重篤な反応は、治療窓を狭め、四肢の再灌流および機能の縦断的評価を妨げる可能性がある。興味深いことに、マウス第7染色体に位置する単一の量的形質遺伝子座における遺伝的差異は、C57BL/6およびBALB/cマウスの組織壊死および四肢再灌流に対するこれらの異なる感受性に関与している10。
C57BL/6およびBALB/c株と比較して、FVBマウスは、大腿動脈結紮のみに対して中間的ではあるが一貫性のない応答を示す。いくつかの動物は、黒い虚血性爪またはミイラ化した数字の形で足蹠壊疽を発症するが、虚血の明白な徴候がない動物もいる11。一酸化窒素合成酵素(NOS)阻害剤であるNω-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル塩酸塩(L-NAME)の同時投与12は、代償性血管拡張機構を予防し、後肢組織における酸化ストレスをさらに増加させる。大腿動脈結紮または凝固と組み合わせて、このアプローチは、CLTIの萎縮性変化に類似しているが、四肢の自己切断にはほとんど進行しないFVBマウスにおいて、一貫して足蹠組織喪失を生じる11。酸化ストレスはPAD/CLTIの特徴の1つであり、内皮機能障害および一酸化窒素(NO)の生物学的利用能の低下によって伝播される13,14。NOは多能性分子であり、通常、動脈および毛細血管血流、血小板接着および凝集、ならびに白血球の動員および活性化に有益な効果を発揮する13。NOSのレベルの低下はまた、酸化ストレスを誘発し、アテローム性動脈硬化症の進行を促進するアンジオテンシン変換酵素を活性化することが示されている15。
後肢虚血のモデルが確立されると、その後の四肢再灌流および潜在的な治療の治療効果のモニタリングも必要である。提案されたマウス壊疽モデルにおいて、組織喪失の程度は、まず、フェーバースコアを用いて定量化して、足の総外観を評価することができる(0:正常、1〜5:スコアが罹患した爪の数を表す爪の損失、6〜10:スコアが罹患した桁数を表す桁の萎縮、11〜12:部分的および完全な足の萎縮、 それぞれ)9.その後、後肢灌流の定量的測定は、典型的にはLDPIを用いて行われ、LDPIは、関心領域(ROI)におけるピクセルレベルの灌流を示すために、レーザー光と赤血球との間のドップラー相互作用に依存する16。この技術は定量的で非侵襲的であり、反復測定には理想的ですが、後肢血管系の粒状の解剖学的詳細を提供するものではありません16。マイクロコンピュータ断層撮影法(マイクロCT)、磁気共鳴血管造影法(MRA)、X線微小血管造影などの他のイメージングモダリティは、コストがかかるか、高度な機器を必要とするか、そうでなければ技術的に困難であることが証明されています16。2008年、Liらは、親油性カルボシアニン色素DiI17で網膜内の血管を標識する技術を説明した。DiIは内皮細胞に組み込まれ、直接拡散によって、血管新生スプラウトや偽蹄形プロセスなどの血管膜構造を染色する17,18。内皮細胞への直接送達および色素の蛍光性が高いため、この手順は血管の強烈で長期的な標識を提供する。2012年、BodenらはDiI灌流の手法を、大腿動脈結紮後に採取された大腿内転筋の全マウントイメージングを介してマウス後肢虚血モデルに適応させた19。
現在の方法は、後肢虚血および遺伝子または細胞ベースの治療に応答した新生血管形成を評価するための比較的安価で技術的に実現可能な方法を提供する。さらなる適応において、このプロトコルは、足蹠血管系を高解像度で画像化し、後肢壊疽のマウスモデルにおいて3Dで画像化するためのDiI灌流の適用を記載する。
Protocol
Representative Results
Discussion
マウス後肢虚血は、PADおよびCLTIにおける新生血管新生を研究するために最も広く使用されている前臨床モデルであるが、虚血の重症度および回復には、使用される特定のマウス系統および動脈破壊の部位、数、および方法に応じて有意な変動がある。L-NAMEの大腿動脈結紮とIP投与の組み合わせは、FVBマウスにおいて後肢壊疽を確実に誘導することができる11。同じ治療は、C5…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所[R01HL149452およびVITAからZ-J LおよびOC Vへの助成金(NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]によって支援されました。我々はまた、マイアミ大学医学部の麻痺を治すためのマイアミプロジェクトの顕微鏡およびイメージング施設が、画像解析および処理ソフトウェアへのアクセスを提供してくれたことに感謝する。
Materials
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used version 2.1.0. |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
References
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