Høyoppløselig tredimensjonal bildebehandling av footpad vaskulaturen i en Murine hindlimb gangrene modell
Summary
Den nåværende protokollen beskriver en unik, klinisk relevant modell av perifer arteriell sykdom som kombinerer lårarterie og veneelektrokoagulasjon med administrering av en nitrogenoksidsyntasehemmer for å indusere hindlimb gangren hos FVB-mus. Intracardiac DiI perfusjon brukes deretter til høyoppløselig, tredimensjonal bildebehandling av fotputens vaskulatur.
Abstract
Perifer arteriell sykdom (PAD) er en betydelig årsak til sykelighet som følge av kronisk eksponering for aterosklerotiske risikofaktorer. Pasienter som lider av sin mest alvorlige form, kronisk lem-truende iskemi (CLTI), står overfor betydelige svekkelser i dagliglivet, inkludert kronisk smerte, begrenset gangavstand uten smerte og ikke-helbredende sår. Prekliniske modeller er utviklet i ulike dyr for å studere PAD, men musens bakbens iskemi er fortsatt den mest brukte. Det kan være betydelig variasjon som svar på iskemisk fornærmelse i disse modellene, avhengig av musestammen som brukes og nettstedet, antallet og midler til arteriell forstyrrelse. Denne protokollen beskriver en unik metode som kombinerer lårarterie og veneelektrokoagulasjon med administrering av en nitrogenoksidsyntase (NOS)-hemmer for pålitelig indusering av gangren i fotpute i Friend Virus B (FVB) mus som ligner vevstapet av CLTI. Mens tradisjonelle metoder for å vurdere reperfusjon som laser Doppler perfusjonsavbildning (LDPI) fortsatt anbefales, intrakariac perfusjon av lipofilt fargestoff 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) brukes til å merke vaskulaturen. Etterfølgende helmontert konfokal laserskanning mikroskopi gir mulighet for høyoppløselig, tredimensjonal (3D) rekonstruksjon av fotpute vaskulære nettverk som utfyller tradisjonelle måter å vurdere reperfusjon i bakbenet iskemi modeller.
Introduction
Perifer arteriell sykdom (PAD), preget av redusert blodstrøm til ekstremiteter på grunn av aterosklerose, påvirker 6,5 millioner mennesker i USA og 200 millioner mennesker over hele verden1. Pasienter med PAD opplever redusert lemfunksjon og livskvalitet, og de med CLTI, den mest alvorlige formen for PAD, har økt risiko for amputasjon og død med en 5-års dødelighet nær 50%2. I klinisk praksis anses pasienter med ankel-brachial indekser (ABI) <0,9 å ha PAD, og de med ABI <0,4 forbundet med enten hvilesmerter eller vevstap som å ha CLTI3. Symptomene varierer mellom pasienter med lignende ABIer avhengig av daglig aktivitet, muskeltoleranse for iskemi, anatomiske variasjoner og forskjeller i sikkerhetsutvikling4. Siffer og lem koldbrann er den mest alvorlige manifestasjonen av alle vaskulære okklusive sykdommer som resulterer i CLTI. Det er en form for tørr nekrose som mumifiserer bløtvevet. I tillegg til aterosklerotisk PAD, kan det også observeres hos pasienter med diabetes, vaskulitter som Buergers sykdom og Raynauds fenomen, eller kalsipylakse i innstillingen av end-stage nyresykdom5,6.
Flere prekliniske modeller er utviklet for å studere patogenesen av PAD / CLTI og teste effekten av potensielle behandlinger, hvorav den vanligste forblir mus hindlimb iskemi. Induserende hindlimb iskemi hos mus oppnås vanligvis ved hindring av blodstrøm fra iliac eller lårarterier, enten ved suturligasjon, elektrokoagulasjon eller andre midler for å begrense ønsket fartøy7. Disse teknikkene reduserer perfusjonen drastisk til bakbenet og stimulerer neovascularization i lår- og kalvemuskulaturen. Imidlertid er det essensielle murine belastningsavhengige forskjeller i følsomhet for iskemisk fornærmelse delvis på grunn av anatomiske forskjeller i sikkerhetsfordeling8,9. For eksempel er C57BL / 6 mus relativt motstandsdyktige mot bakbens iskemi, som demonstrerer redusert lemfunksjon, men generelt ingen tegn på koldbrann i fotputen. På den annen side har BALB / c mus en iboende dårlig kapasitet til å komme seg fra iskemi og utvikler vanligvis automatisk amputasjon av foten eller underbenet etter lårarterie ligation alene. Denne alvorlige responsen på iskemi begrenser det terapeutiske vinduet og kan utelukke langsgående vurdering av lemreperfusjon og funksjon. Interessant nok har genetiske forskjeller i et enkelt kvantitativt trekklocus plassert på murinkromosom 7 blitt involvert i disse differensialskepsibilitetene til C57BL / 6 og BALB / c mus til vevnekrose og lemreperfusjon10.
Sammenlignet med C57BL/6- og BALB/c-stammer, viser FVB-mus en mellomliggende, men inkonsekvent respons på femoral arterieligasjon alene. Noen dyr utvikler footpad gangrene i form av svarte iskemiske negler eller mumifiserte sifre, men andre uten noen overt tegn på iskemi11. Samtidig administrering av Nω-Nitro-L-arginin metylsterhydroklorid (L-NAME), en nitrogenoksidsyntase (NOS) inhibitor12, forhindrer kompenserende vasodilaterende mekanismer og øker ytterligere oksidativt stress i bakbensvev. I kombinasjon med femoral arterie ligation eller koagulasjon, produserer denne tilnærmingen konsekvent fotputevevstap hos FVB-mus som ligner de atrofiske endringene i CLTI, men utvikler seg sjelden til lem auto-amputasjon11. Oksidativt stress er et av kjennetegnene til PAD/CLTI og forplantes ved endotel dysfunksjon og redusert biotilgjengelighet av nitrogenoksid (NO)13,14. NO er et pluripotent molekyl som vanligvis utøver gunstige effekter på arteriell og kapillær blodstrøm, blodplateadhesjon og aggregering, og leukocyttrekruttering og aktivering13. Reduserte nivåer av NOS har også vist seg å aktivere angiotensin-konverterende enzymet, som induserer oksidativt stress og akselererer utviklingen av aterosklerose15.
Når en modell av hindlimb iskemi er etablert, overvåke etterfølgende lem reperfusjon og den terapeutiske effekten av eventuelle behandlinger er også nødvendig. I den foreslåtte murine gangrene-modellen kan graden av vevstap først kvantifiseres ved hjelp av Faber-poengsummen for å vurdere fotens brutto utseende (0: normal, 1-5: tap av negler der score representerer antall negler som er berørt, 6-10: atrofi av sifre der score representerer antall sifre berørt, 11-12: delvis og fullstendig fotatrofi, henholdsvis)9. Kvantitative målinger av hindlimb perfusjon gjøres da vanligvis ved hjelp av LDPI, som er avhengig av Doppler interaksjoner mellom laserlys og røde blodlegemer for å indikere perfusjon på pikselnivå i en interesseregion (ROI)16. Selv om denne teknikken er kvantitativ, ikke-invasiv og ideell for gjentatte målinger, gir den ikke granulær anatomiske detaljer av bakbenet vaskulatur16. Andre avbildningsmodaliteter, som mikro-beregnet tomografi (mikro-CT), magnetisk resonansangiografi (MRA) og røntgenmikroangiografi, viser seg enten kostbart, krever sofistikert instrumentering eller på annen måte teknisk utfordrende16. I 2008 beskrev Li et al. en teknikk for merking av blodkar i netthinnen med lipofil karbocyaninfarge DiI17. DiI inkorporerer i endotelceller og, ved direkte diffusjon, flekker vaskulære membranstrukturer som angiogene spirer og pseudopodale prosesser17,18. På grunn av sin direkte levering til endotelceller og fargestoffets svært fluorescerende natur, gir denne prosedyren intens og langvarig merking av blodkar. I 2012 tilpasset Boden et al. teknikken for DiI-perfusjon til murin hindlimb iskemimodellen via helmontert avbildning av høstede lår adductor muskler etter lårarterie ligation19.
Den nåværende metoden gir en relativt billig og teknisk mulig måte å vurdere neovascularization som svar på hindlimb iskemi og gen- eller cellebaserte terapeutiske midler. I en ytterligere tilpasning beskriver denne protokollen anvendelsen av DiI-perfusjon for å avbilde fotputevaskulaturen i høy oppløsning og 3D i en murinmodell av bakbenet koldbrann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens mus hindlimb iskemi er den mest brukte prekliniske modellen for å studere neovascularization i PAD og CLTI, er det betydelig variasjon i iskemi alvorlighetsgrad og utvinning avhengig av den spesifikke musestammen som brukes og nettstedet, antall og metode for arteriell forstyrrelse. Kombinasjonen av femoral arterie ligation og IP-administrasjon av L-NAME kan pålitelig indusere hindlimb gangren i FVB mus11. Den samme behandlingen resulterer i hindlimb iskemi uten vevstap hos C57BL/6 mus, men…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd til Z-J L og OC V fra National Institutes of Health [R01HL149452 og VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Vi takker også Microscopy and Imaging Facility of the Miami Project for å kurere lammelse ved University of Miami School of Medicine for å gi tilgang til deres bildeanalyse- og prosesseringsprogramvare.
Materials
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used version 2.1.0. |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature. Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).
- Mills, J. L., et al. The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI). Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).
- Conte, M. S., et al. Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).
- Yeager, R. A. Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease. Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).
- Al Wahbi, A. Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Parikh, P. P., et al. A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene. Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).
- Kopincová, J., Púzserová, A., Bernátová, I. L-NAME in the cardiovascular system – nitric oxide synthase activator. Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).
- Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).
- McDermott, M. M., et al. Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).
- Usui, M., et al. Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats. Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).
- Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).
- Boden, J., et al. Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI. BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).
- Elfarnawany, M. H. Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography. Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106 (2015).
- Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency. Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
- Ammermann, F., et al. Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography. European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).
- Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).
- Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).
- Hlushchuk, R., Haberthür, D., Djonov, V. Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging. Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Lee, J. J., et al. Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).
