Summary
Protokollen beskriver en modifikasjon av den raske Golgi-metoden, som kan tilpasses enhver del av nervesystemet, for farging av nevroner i hippocampus og medial prefrontal cortex av rotten.
Abstract
Golgi impregnering, ved hjelp av Golgi farging kit med mindre tilpasninger, brukes til å impregnere dendritiske spines i rotte hippocampus og medial prefrontal cortex. Denne teknikken er en markert forbedring i forhold til tidligere metoder for Golgi impregnering fordi de forhåndsmiksede kjemikaliene er tryggere å bruke, nevroner er konsekvent godt impregnert, det er langt mindre bakgrunnsavfall, og for en gitt region er det ekstremt små avvik i ryggtetthet mellom eksperimenter. Videre kan hjerner akkumuleres etter et visst punkt og holdes frosset til videre behandling. Ved hjelp av denne metoden kan enhver hjerneregion av interesse studeres. Når farget og deksel gled, bestemmes dendritisk ryggtetthet ved å telle antall spines for en lengde av dendrit og uttrykt som ryggtetthet per 10 μm dendrit.
Introduction
Metoden for å bruke kaliumdikromat og sølvnitrat for å merke nevroner ble først beskrevet av Camillo Golgi 1,2 og deretter brukt av Santiago Ramon y Cajal for å produsere en enorm kropp av arbeid som differensierer nevronale og gliale undertyper. En nylig utgitt bok med illustrasjonene hans er nå tilgjengelig3. Etter Ramon y Cajals studier, som ble publisert for mer enn 100 år siden, ble det brukt svært lite Golgi impregnering. Golgi impregnering er en arbeidskrevende prosess som tillater tredimensjonal visualisering av nevroner med et lysmikroskop. Det har vært mange modifikasjoner av Golgi-metoden gjennom årene for å gjøre metoden enklere og fargingen mer konsistent4. I 1984 beskrev Gabbott og Somogyi5 enkeltdelen Golgi impregneringsprosedyre som tillot raskere behandling. Denne Golgi impregneringsmetoden krever perfusjon med 4% paraformaldehyd og 1,5% picrinsyre, post-fiksering etterfulgt av vibratome seksjonering i et bad på 3% kaliumdikromat. Seksjoner er montert på glasssklier, de fire hjørnene av deksler limt slik at når de er nedsenket i sølvnitrat, blir diffusjon gradvis. Deksler poppes deretter av, seksjoner dehydreres, og til slutt dekselet glir permanent med monteringsmedium. Denne teknikken ble vellykket brukt til å merke nevroner og glia 6,7,8 i hippocampus. Den raske Golgi-metoden beskrevet her er en forbedring fordi det er langt mindre eksponering for både kaliumdikromat og sølvnitrat, og ingen paraformaldehyd og picrinsyre brukes. I tillegg, selv om celler som ble impregnert ved hjelp av modifikasjoner av Gabbott- og Somogyi5-metoden kunne analyseres, var ofte seksjonene over- eller undereksponerte eller falt av lysbildene under dehydreringstrinnet, og generelt måtte flere eksperimenter samles for å ha nok celler til analyse.
Den nåværende protokollen beskriver bruken av Golgi-fargesettet (se Tabell over materialer) for å merke dendritter og dendritiske spines i og medial prefrontal cortex (mPFC) av rotten. Fordelene med denne metoden over tidligere er at den er rask, det er mindre eksponering for skadelige kjemikalier for forskeren, og det er konsekvent farging av nevroner. Protokollen beskrevet nedenfor har blitt brukt med mindre modifikasjoner for å vurdere dendritisk ryggtetthet i hippocampus og mPFC av rotten i mange studier 9,10,11,12,13,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer er godkjent av Sacred Heart University Institutional Animal Care and Use Committee og er i samsvar med NIH Guide for omsorg og bruk av dyr.
1. Isolasjon og infiltrasjon av hjernevev
- Forblandingsløsninger A og B i Golgi-fargesettet 24 timer før bruk og oppbevare dem i mørke flasker og/eller i mørke. Lag ca. 80 ml oppløsning A og B-blanding som er tilstrekkelig til å endre oppløsningen etter 24 timer. Oppbevars i lufttette flasker.
MERK: Perfusjon med enten saltvann eller paraformaldehyd er ikke nødvendig. - Ofre rotter med giljotin etter karbondioksid eutanasi og fjern hjernen i løpet av sekunder. Skyll hjernen i saltvann om nødvendig, men er ikke nødvendig.
- Plasser hjernen, cortex ned slik at hypothalamus er synlig fordi kuttene er gjort fremre og bakre til det, på en ikke-porøs overflate. Skjær i en fremre (inneholder prefrontal cortex) og bakre (inneholder hippocampus) blokk som vist i figur 1.
- Plasser blokker i de forhåndsblandede løsningene til A og B, og sørg for at de er godt nedsenket i løsningen. Påse at volumet av løsning A og B er tilstrekkelig til å senke blokkene ned. Oppbevar blokker i enten brune flasker eller klare flasker dekket med folie (for å holde lyset ute) i mørket ved romtemperatur.
- Skift ut oppløsningen etter 24 timer og hold den i mørket i ytterligere 13 dager ved romtemperatur.
MERK: Hvis det brukes med musehjerner, er det ikke nødvendig å blokkere, og hele hjernen kan plasseres i løsningen. Hvis farging av hjerneområder, som er forskjellige i størrelse, kan tiden i løsning A og B måtte bestemmes av prøving og feiling. - Etter to uker infiltreres vevet godt med løsning A og B, overfør blokkene til kryopreotektantløsningen (løsning C i Golgi-fargesettet), og la dem stå i 48-72 timer ved 4 °C.
MERK: Etter kryobeskyttelse kan blokker fryses inntil videre behandling. Vær også oppmerksom på at alle løsninger fra settet samles inn og avhendes som farlig avfall. - Frys hjernen, cortex ned, på et glasssklie på tørris. Når frossen enten kuttet på cryostat eller lagre ved -80 °C til seksjonering ved hjelp av en kryostat.
MERK: Ikke frys i flytende nitrogen, da dette gir sprekker i vevet.
2. Seksjonering av hjernevev
- Legg en liten mengde vevsmedium på en ferdigkjølt kryostat chuck. Monter blokker på kryostat chucker ved å tine den ene siden av blokken litt i hånden (hanske) og plassere den på vevsmediet.
MERK: Det er ikke nødvendig å legge inn vevet. Blokken som inneholder hippocampus er noe lettere å kutte enn blokken med prefrontal cortex fordi sistnevnte er fremre til corpus callosum og de to halvdelene er separate. - Klipp 100 μm seksjoner på en kryostat ved -22 °C og monter på undersengede lysbilder. Seksjoner opp til 150 μm tykkelse kan brukes. Prøv å montere 3-4 koronal seksjoner per lysbilde, da dette reduserer antall lysbilder som krever behandling. Bruk en av følgende teknikker for å holde inndelingene frosne til de kommer på lysbildet.
MERK: Disse seksjonene er ikke festet på vanlig måte, og derfor har de en tendens til å smelte raskt. La delene smelte på lysbildet. Hvis de begynner å smelte før de plasseres på lysbildet, er det umulig å få dem til å være flate på lysbildet. Det er flere teknikker for å gjøre dette.- Bruk en frysespray på kniven og blokken. Avhengig av temperatur og fuktighet i rommet kan dette være nødvendig for hver seksjon. Bruk enten antirollplaten eller en børste for å holde delen flat mens du skjærer.
MERK: Sørg for å ha nok frysespray. Flere bokser kan brukes ved kutting av 20 blokker. - Tine braketten, om mulig, ved å bruke en romtemperatursklie og raskt appose den til delen. Med praksis kan man montere flere seksjoner samtidig. Hvis dette ikke fungerer, hold lysbilder i kryostaten slik at de er veldig kalde og overfør delen med kalde tang eller en kald pensel og tine deretter braketten.
- Bruk en frysespray på kniven og blokken. Avhengig av temperatur og fuktighet i rommet kan dette være nødvendig for hver seksjon. Bruk enten antirollplaten eller en børste for å holde delen flat mens du skjærer.
- Rengjør kniven med papirservietter mellom skiver. Hvis kniven krever mer rengjøring, bruk 100% etanol (EtOH), og la den tørke før du kutter neste skive.
- Når den er montert på lysbildet, plasserer du lysbildet flatt på pappskuffer og lar seksjonene tørke ved romtemperatur (i flere timer til maksimalt 48 timer) i mørket. Ikke dekk til skyvebrettet. Pass på at seksjonene er helt tørre før Golgi impregnering. Oppbevar flatt, i mørket, på glidebrett til Golgi impregnering.
MERK: Tørking av seksjonene forårsaker ingen skade.
3. Farging og dehydrering av hjernevev
- Utfør farging i glassfargingsretter. Bland løsning D og E umiddelbart før farging. I henhold til protokollen legger du til en del av løsning D, en del av løsning E og to deler destillert vann. For glassfargingsretter, lag en 200 ml løsning for å helt nedsenke seksjonene. For Koplin-krukker krever dette mindre volum.
- Plasser lysbilder i stativer som er plassert langt nok fra hverandre til å gi løsningstilgang til inndelinger.
- Plasser seksjoner i destillert vann i 4 min (2x) før du plasserer dem i Golgi impregneringsfargingsløsning i 10 min. Endre fargeløsningen hver 70. Bytt destillert vann når det blir gult.
MERK: Tidspunktet for fargingstrinnet er kritisk. For kort tillater ikke nok farging og for lange årsaker over farging, noe som gjør dendrittene vanskelige å skille når du gjør analyse. Når du er ute av fargeløsningen, er timingen mindre kritisk. - Dehydrer seksjonene som følger: 70% EtOH (5 min), 95% EtOH (5 min; 2x), 100% EtOH (5 min; 2x), clearing agent (5 min; 3x). Endre alle løsninger ofte, spesielt 100% EtOH og clearing agent for å sikre at seksjonene forblir vannfri.
MERK: Det er ikke nødvendig å gå gjennom et 50% EtOH-trinn. Tellere er ikke nødvendig for cellevisualisering fordi Golgi-impregneringen gir tilstrekkelig kontrast. Bruken av andre avregningsmidler har ikke fungert så godt som den som brukes her (se Materialliste). - Deksler med glassdeksler som er 60 mm lange med en sjenerøs mengde monteringsmedium. Pass på at det er så få luftbobler som mulig. Om nødvendig, fjern forsiktig og gjør om dekslene (kan gjøres enda uker senere). Gjør dette veldig sakte for ikke å skade delen (kan gjøres på grunn av den store mengden monteringsmedium).
MERK: En stor mengde monteringsmedium er noe rotete, men likevel nødvendig fordi nok monteringsmedium må brukes til å dekke de tykke 100 μm seksjonene. - For å sikre at bare ett deksler er plassert på seksjonene, separer dekslene i forkant av prosessen.
- Når dekselet gled, glir tørre lysbilder flatt på ikke-porøst papir i 3-5 dager, og flytter dem litt, spesielt etter den første dagen, for å unngå å stikke. Etter 3-5 dager overføre lysbildene til lysbildeholdere og ideelt sett tørre lysbilder i minst 3 uker før du undersøker dem. Hold lysbildene flate for å redusere muligheten for at luftbobler dannes.
4. Bestemmelse av dendrittisk ryggtetthet
- For analyse av dendritisk ryggradstetthet i pyramidale nevroner av både mPFC og CA1-regionen i hippocampus, undersøk de mest laterale sekundære basale dendritter og de mest laterale tertiære apical dendritter som beskrevet i trinn 4.1.1 (figur 2).
- Velg en dendrit, mål lengden på dendritten ved hjelp av et bildeanalyseprogram, tell ryggradene på dendrittene ved hjelp av en håndteller, og registrer både lengde og antall ryggrader.
- Studer og analyser seks celler per region (mPFC, CA1) per hjerne. Kvantifisere minimum seks hjerner per gruppe som tidligere beskrevet 7,8. Velg nevroner som oppfyller følgende kriterier for analyse: cellelegemer og dendritter er godt impregnert; dendritter skiller seg fra tilstøtende celler og er kontinuerlige.
- Tell ryggradene ved 1000x (oljeinnlevelse) for håndtelling med et lett mikroskop og mål dendritisk lengde ved hjelp av et bildeanalyseprogram. Beregn ryggtetthet ved å dele ryggradsnummeret på lengden på dendritten og uttrykke data som antall ryggrader/ 10 μm dendrit.
MERK: Det finnes langt mer sofistikerte metoder for differensiering av ryggradsundertyper og dendrittisk arkitektur som kan brukes, men håndtelling med et lysmikroskop ved 1000x kan gi et raskt resultat som deretter kan avgjøre om videre undersøkelser er nødvendig. Selv om det gjøres alt for å konsekvent prøve lignende dendritter, er det variasjoner i tykkelse som kan påvirke tellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av den raske Golgi-metoden er cellene konsekvent godt impregnert slik at det er mange celler å analysere. Dette er en markant forbedring i forhold til tidligere metoder der eksperimenter måtte samles for å ha nok data til analyse. Derfor kan flere prøver behandles samtidig, og hjernen kan lagres frosset til behandling. Eksempler på Golgi impregnerte celler i CA1-regionen i hippocampus er vist ved lav og høy effekt i figur 3. Telling av spines i en gitt region gir konsistente resultater med små standardfeil. Dette er også viktig fordi man kan gjøre sammenligninger mellom eksperimenter. Figur 4 illustrerer et eksperiment der basal dendritisk ryggtetthet ble økt på pyramideceller hos unge hann- og hunnrotter etter miljøberikelse (EE) i både CA1 og mPFC. Kort sagt ble mannlige og kvinnelige rotter avventet på barseldag (PND) 21 og tildelt kontroll eller berikede grupper. EE-gruppen tilbrakte 2 timer/dag i berikede boliger fra PND 24-42 mens kontrollgruppen var plassert i ordinære merder i løpet av denne tiden. EE indusert, hos ungdom av begge kjønn, en økning i basal dendritisk ryggrad tetthet i både CA1 og mPFC. Legg merke til den lille standardfeilen for gjennomsnittet (SEM) i alle dendrittiske ryggradsverdier.
Figur 1: Ventral overflate av rottehjernen. Fotografi av den ventrale overflaten av en frisk rottehjerne som indikerer hvor du skal kutte i fremre og bakre blokker før du nedsenker blokker i innledende løsninger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Typisk pyramidecelle. Skjematisk av en pyramidecelle, som illustrerer apikale og basale dendritter som analyseres for dendrittisk ryggtetthet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Golgi Impregnert neuron. Eksempler på Golgi impregnerte nevroner i CA1-regionen av rotte hippocampus. Venstre: Flere impregnerte pyramideceller. Skalastang = 25 μm. Øverst til høyre: Basal dendritter. Skalastang = 12,5 μm. Nederst til høyre: Eksempel på en sekundær basal dendrit. Piler angir ryggrader. Skalalinje = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Tetthet i ryggraden. Et datasett som illustrerer basal og apikal dendritisk ryggtetthet i mPFC- og CA1-regionen i hippocampus (CA1) etter miljøberikelse (EE) sammenlignet med kontroll (CON) hos hann (M) og hunnrotter (F). Histogrammer viser gjennomsnittlig antall spines/10 μm dendrite + SEM. Data ble analysert ved hjelp av statistisk analyseprogramvare (se Tabell over materialer). Toveis (sex X EE) ANOVAer ble brukt til å teste for gruppeforskjeller og Fishers LSD-tester ble brukt til post-hoc-analyse. Signifikante effekter er p<0,05. t angir en signifikant forskjell. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende protokollen beskriver en metode for Golgi impregnering som muliggjør rask samtidig behandling av mange seksjoner. Det er en forbedring i forhold til tidligere beskrevne5 mer arbeidsintensive metoder og gir konsekvent impregnerte nevroner for analyse. I tillegg er det mindre eksponering for giftige kjemikalier som brukes i Golgi impregnering. Den mest utfordrende delen av prosessen er å få seksjonene til å være flate på lysbildene, noe som krever betydelig praksis. Å holde alt så kaldt som mulig ved bruk av frysespray er viktig.
Når lysbildene er tørre og analysen kan utføres, er det svært viktig å være konsekvent når du velger cellene som telles. Hippocampal pyramideceller er valgt fra CA1. For mPFC, som har flere underdeler, brukes pyramideceller fra den infralimbe cortex. Av grunner som ikke er klare, er færre celler i mPFC farget enn i CA1-regionen i hippocampus. I tillegg er det mulig å kombinere eksperimenter når alle seksjonene ikke kan behandles sammen av logistiske grunner. For konsistens bør den samme personen telle et gitt sett med celler.
Begrensningene i denne metoden ligner alle Golgi impregneringsmetoder. Det faktum at bare et lite antall celler er farget, er en fordel. Det lille antallet celler impregnert tillater visualisering av hele cellen i tre dimensjoner. Ulempen med Golgi-metoden er at det ikke er klart hvilket delsett av celler som er merket. Derfor, i eksperimenter, må man anta at cellene impregnert for både kontroll og eksperimentelle grupper er de samme. Selv om denne metoden resulterer i langt bedre farging enn tidligere metoder, er det alltid celler som ikke kan analyseres fordi de er dekket av rusk, en luftboble eller har ødelagte dendritter.
Til slutt er den raske Golgi-metoden beskrevet her en rask, sikker metode for konsistent og reproduserbar merking av nevroner som kan brukes til enhver hjerneregion. I tillegg til å merke celler i prefrontal cortex17,18 og hippocampus 10,12,19, har den også blitt brukt i amygdala20, cerebellum 21 og cortex22. Forutsatt at man er kjent med anatomien og raskt kan identifisere celler, kan håndtelling av ryggtetthet gi et raskt resultat, men det gir ikke informasjon om dendritiske undertyper som krever mer sofistikerte analysemetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Sacred Heart University Undergraduate Research InitiativeGrants.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
References
- Pannese, E. The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences. Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).
- Bentivoglio, M., et al. The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3 (2019).
- Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal. , Abrams. 208 (2017).
- Dall'Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. The "single-section" Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The 'single' section Golgi-impregnation procedure: methodological description. Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone. Glia. 3 (4), 283-292 (1990).
- Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood. Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).
- Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).
- Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat. Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).
- Frankfurt, M., Luine, V. The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol. Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).
- Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age. Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).
- Bowman, R. E., et al. Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats. Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).
- Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats. Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).
- Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines. Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).
- Jacome, L. F., et al. Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats. Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).
- Frankfurt, M. Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory. Research Features. , https://researchfeatures.com/wp-content/uploads/2021/05/Maya-Frankfurt.pdf (2021).
- Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex. Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).
- Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats. Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).
- Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood. Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).
- Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density. Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).
- Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia. Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).
- Zemmar, A., et al. Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex. Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).
