Summary
Protokollet beskriver en modifiering av den snabba Golgi-metoden, som kan anpassas till någon del av nervsystemet, för färgning av neuroner i hippocampus och medial prefrontal cortex hos råttan.
Abstract
Golgi-impregnering, med användning av Golgi-färgningssatsen med mindre anpassningar, används för att impregnera dendritiska spines i råtta hippocampus och medial prefrontal cortex. Denna teknik är en markant förbättring jämfört med tidigare metoder för Golgi-impregnering eftersom de förblandade kemikalierna är säkrare att använda, neuroner är konsekvent väl impregnerade, det finns mycket mindre bakgrundsskräp och för en given region finns det extremt små avvikelser i ryggradstätheten mellan experimenten. Dessutom kan hjärnor ackumuleras efter en viss punkt och hållas frysta tills vidare bearbetning. Med hjälp av denna metod kan någon hjärnregion av intresse studeras. När den väl har färgats och locket glidit bestäms dendritisk ryggradstäthet genom att räkna antalet spines för en längd av dendrit och uttryckas som ryggradstäthet per 10 μm dendrit.
Introduction
Metoden att använda kaliumdikromat och silvernitrat för att märka neuroner beskrevs först av Camillo Golgi 1,2 och användes därefter av Santiago Ramon y Cajal för att producera en enorm mängd arbete som skiljer neuronala och gliala subtyper. En nyligen publicerad bok med hans illustrationer finns nu tillgänglig3. Efter Ramon y Cajals studier, som publicerades för mer än 100 år sedan, användes mycket lite Golgi-impregnering. Golgi-impregnering är en mödosam process som möjliggör tredimensionell visualisering av neuroner med ett ljusmikroskop. Det har skett många modifieringar av Golgi-metoden genom åren för att göra metoden enklare och färgningen mer konsekvent4. År 1984 beskrev Gabbott och Somogyi5 det enda sektionen Golgi-impregneringsförfarandet som möjliggjorde snabbare bearbetning. Denna Golgi-impregneringsmetod kräver perfusion med 4% paraformaldehyd och 1,5% pikrinsyra, efterfixering följt av vibratomsektion i ett bad av 3% kaliumdikromat. Sektioner monteras på glasrutschbanor, de fyra hörnen av täckglas limmade så att diffusionen gradvis är nedsänkt i silvernitrat. Täckglas poppas sedan av, sektionerna är uttorkade och så småningom glider locket permanent med monteringsmedium. Denna teknik användes framgångsrikt för att märka neuroner och glia 6,7,8 i hippocampus. Den snabba Golgi-metoden som beskrivs här är en förbättring eftersom det finns mycket mindre exponering för både kaliumdikromat och silvernitrat och ingen paraformaldehyd och pikrinsyra används. Dessutom, även om celler som impregnerades med hjälp av modifieringar av Gabbott- och Somogyi5-metoden kunde analyseras, var sektionerna ofta över- eller underexponerade eller föll av bilderna under uttorkningssteget och i allmänhet måste flera experiment samlas för att ha tillräckligt med celler för analys.
Det föreliggande protokollet beskriver användningen av Golgi-färgningssatsen (se Materialtabell) för att märka dendriter och dendritiska spines i hippocampus och medial prefrontal cortex (mPFC) hos råttan. Fördelarna med denna metod jämfört med tidigare är att den är snabb, det finns mindre exponering för skadliga kemikalier för forskaren och det finns konsekvent färgning av neuroner. Protokollet som beskrivs nedan har använts med mindre modifieringar för att bedöma dendritisk ryggradstäthet i hippocampus och mPFC hos råtta i många studier 9,10,11,12,13,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella förfaranden är godkända av Sacred Heart University Institutional Animal Care and Use Committee och är i enlighet med NIH Guide for the Care and Use of Animals.
1. Isolering och infiltration av hjärnvävnad
- Förblandningslösningar A och B i Golgi-färgningssatsen 24 timmar före användning och förvara i mörka flaskor och / eller i mörker. Gör cirka 80 ml lösning A- och B-blandning som är tillräcklig för att byta lösning efter 24 timmar. Förvara i lufttäta flaskor.
OBS: Perfusion med antingen saltlösning eller paraformaldehyd är inte nödvändigt. - Offra råttor med giljotin efter koldioxidavlivning och ta bort hjärnor inom några sekunder. Skölj hjärnan i saltlösning om det behövs men är inte nödvändigt.
- Placera hjärnan, cortex ner så att hypotalamus är synlig eftersom skärningarna görs främre och bakre till den, på en icke-porös yta. Skär i ett främre (innehåller prefrontal cortex) och bakre (innehåller hippocampus) block som visas i figur 1.
- Placera block i de förblandade lösningarna av A och B, se till att de är väl nedsänkta i lösningen. Se till att volymen av lösningarna A och B är tillräcklig för att fördjupa blocken. Förvara block i antingen bruna flaskor eller klara flaskor täckta med folie (för att hålla ljuset ute) i mörkret vid rumstemperatur.
- Byt ut lösningen efter 24 timmar och håll i mörkret i ytterligare 13 dagar vid rumstemperatur.
OBS: Om det används med mushjärlor behöver du inte blockera, och hela hjärnan kan placeras i lösningen. Om färgning av hjärnområden, som är olika i storlek, kan tiden i lösningarna A och B behöva bestämmas av försök och fel. - Efter två veckor infiltreras vävnaden väl med lösningarna A och B, överför blocken till kryoprotektantlösningen (lösning C i Golgi-färgningssatsen) och låt dem stå i 48-72 timmar vid 4 °C.
OBS: Efter kryoprotektion kan block frysas tills vidare bearbetning. Observera också att alla lösningar från satsen samlas in och bortskaffas som farligt avfall. - Frys hjärnan, cortex ner, på en glasrutschbana på torris. När den är fryst skärs antingen på kryostaten eller förvaras vid -80 ° C tills den är sektion med en kryostat.
OBS: Frys inte i flytande kväve eftersom det ger sprickor i vävnaden.
2. Sektionering av hjärnvävnader
- Placera en liten mängd vävnadsmedium på en förkyld kryostatchuck. Montera block på kryostatchuckar genom att tina ena sidan av blocket något i handen (handske) och placera det på vävnadsmediet.
OBS: Det är inte nödvändigt att bädda in vävnaden. Blocket som innehåller hippocampus är något lättare att skära än blocket med prefrontal cortex eftersom den senare är främre mot corpus callosum och de två halvorna är separata. - Skär 100 μm sektioner på en kryostat vid -22 ° C och montera på underbäddsrutschbanor. Sektioner upp till 150 μm tjocklek kan användas. Försök att montera 3-4 koronalsektioner per bild eftersom detta minskar antalet bilder som kräver bearbetning. Använd någon av följande tekniker för att hålla sektionerna frysta tills de kommer på bilden.
OBS: Dessa sektioner är inte fixerade på vanligt sätt och därför tenderar de att smälta snabbt. Låt sektionerna smälta på bilden. Om de börjar smälta innan de placeras på bilden är det omöjligt att få dem att vara plana på bilden. Det finns flera tekniker för att göra detta.- Använd en frysspray på kniven och blocket. Beroende på temperatur och luftfuktighet i rummet kan detta vara nödvändigt för varje sektion. Använd antingen antirulleplattan eller en borste för att hålla sektionen platt under skärning.
OBS: Se till att ha tillräckligt med frysspray. Flera burkar kan användas vid skärning av 20 block. - Tina fäste, om möjligt, genom att använda en rumstemperaturglid och snabbt anpassa den till sektionen. Med övning kan man montera flera sektioner samtidigt. Om detta inte fungerar, håll diabilder i kryostaten så att de är mycket kalla och överför sektionen med kalla pincett eller en kall pensel och tina sedan fästet.
- Använd en frysspray på kniven och blocket. Beroende på temperatur och luftfuktighet i rummet kan detta vara nödvändigt för varje sektion. Använd antingen antirulleplattan eller en borste för att hålla sektionen platt under skärning.
- Rengör kniven med pappersservetter mellan skivorna. Om kniven kräver mer rengöring, använd 100% etanol (EtOH) och låt den torka innan du skär nästa skiva.
- När du har monterat på bilden, placera bilden platt på kartongbrickor och låt sektionerna torka vid rumstemperatur (i flera timmar till högst 48 timmar) i mörkret. Täck inte över glidfacket. Se till att sektionerna är helt torra före Golgi-impregnering. Förvara platt, i mörkret, på glidbrickor tills Golgi-impregnering.
OBS: Torkning av sektionerna orsakar ingen skada.
3. Färgning och uttorkning av hjärnvävnad
- Utför färgning i glasfärgningsrätter. Blanda lösningarna D och E omedelbart före färgning. Enligt protokollet, tillsätt en del av lösning D, en del av lösning E och två delar destillerat vatten. För glasfärgningsskålar, gör en 200 ml lösning för att helt nedsänka sektionerna. För Koplinburkar kräver detta mindre volym.
- Placera diabilder i rack som är tillräckligt långt ifrån varandra för att ge lösningsåtkomst till sektioner.
- Placera sektioner i destillerat vatten i 4 min (2x) innan du placerar dem i Golgi-impregneringsfärgningslösningen i 10 min. Byt färgningslösningen var 70: e sektion. Byt destillerat vatten när det blir gult.
OBS: Tidpunkten för färgningssteget är kritisk. För kort tillåter inte tillräckligt med färgning och för långa orsaker över färgning, vilket gör dendriterna svåra att separera när man gör analys. En gång ur färgningslösningen är tidpunkten mindre kritisk. - Dehydrera sektionerna enligt följande: 70% EtOH (5 min), 95% EtOH (5 min; 2x), 100% EtOH (5 min; 2x), clearingmedel (5 min; 3x). Byt alla lösningar ofta, särskilt 100% EtOH och clearingmedel för att säkerställa att sektionerna förblir vattenfria.
OBS: Det är inte nödvändigt att gå igenom ett 50% EtOH-steg. Motfärgning behövs inte för cellvisualisering eftersom Golgi-impregneringen ger tillräcklig kontrast. Användningen av andra clearingagenter har inte fungerat lika bra som den som används här (se Materialtabell). - Täckglas med glasöverdrag som är 60 mm långa med en generös mängd monteringsmedium. Se till att det finns så få luftbubblor som möjligt. Om det behövs, ta försiktigt bort och gör om täckglaset (kan göras även veckor senare). Gör detta mycket långsamt för att inte skada sektionen (kan göras på grund av den stora mängden monteringsmedium).
OBS: En stor mängd monteringsmedium är något rörigt men ändå nödvändigt eftersom tillräckligt med monteringsmedium måste användas för att täcka de tjocka 100 μm sektionerna. - För att säkerställa att endast en täckglas placeras på sektionerna, separera täckglasen före processen.
- När locket har glidit, glider torra bilder platt på något icke-poröst papper i 3-5 dagar, flyttar dem något, särskilt efter den första dagen, för att undvika att fastna. Efter 3-5 dagar överför bilderna till glidhållare och helst torra bilder i minst 3 veckor innan du undersöker dem. Håll bilderna platta för att minska risken för att luftbubblor bildas.
4. Bestämning av dendritisk ryggradstäthet
- För analys av dendritisk ryggradstäthet i pyramidala nervceller i både mPFC- och CA1-regionen i hippocampus, undersök de mest laterala sekundära basala dendriterna och de mest laterala tertiära apikala dendriterna som beskrivs i steg 4.1.1 (Figur 2).
- Välj en dendrit, mät längden på dendriten med hjälp av ett bildanalysprogram, räkna ryggraden på dendriterna med hjälp av en handräknare och registrera både längd och antal spines.
- Studera och analysera sex celler per region (mPFC, CA1) per hjärna. Kvantifiera minst sex hjärnor per grupp som tidigare beskrivits 7,8. Välj neuroner som uppfyller följande kriterier för analys: cellkroppar och dendriter är väl impregnerade; dendriter kan särskiljas från intilliggande celler och är kontinuerliga.
- Räkna ryggraden vid 1000x (oljenedsänkning) för handräkning med ett ljusmikroskop och mät dendritisk längd med hjälp av ett bildanalysprogram. Beräkna ryggradstätheten genom att dividera ryggradsnumret med dendritens längd och uttrycka data som antalet spines / 10 μm dendrit.
OBS: Det finns mycket mer sofistikerade metoder för att differentiera ryggradssubtyper och dendritisk arkitektur som kan användas, men handräkning med ett ljusmikroskop vid 1000x kan ge ett snabbt resultat som sedan kan avgöra om ytterligare undersökning är nödvändig. Även om alla ansträngningar görs för att konsekvent prova liknande dendriter, finns det variationer i tjocklek som kan påverka räkningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av den snabba Golgi-metoden impregneras cellerna konsekvent väl så att det finns gott om celler att analysera. Detta är en markant förbättring jämfört med tidigare metoder där experiment måste slås samman för att ha tillräckligt med data för analys. Därför kan fler prover bearbetas på en gång och hjärnor kan lagras frysta tills bearbetning. Exempel på Golgi-impregnerade celler i CA1-regionen i hippocampus visas vid låg och hög effekt i figur 3. Räkning av spines i en viss region ger konsekventa resultat med små standardfel. Detta är också viktigt eftersom man kan göra jämförelser mellan experiment. Figur 4 illustrerar ett experiment där basal dendritisk ryggradstäthet ökade på pyramidala celler hos unga han- och honråttor efter miljöberikning (EE) i både CA1 och mPFC. Kortfattat avvändades han- och honråttor vid postnatal dag (PND) 21 och tilldelades kontroll- eller berikade grupper. EE-gruppen tillbringade 2 timmar / dag i berikade bostäder från PND 24-42 medan kontrollgruppen var inrymd i vanliga burar under denna tid. EE inducerade, hos ungdomar av båda könen, en ökning av basal dendritisk ryggradstäthet i både CA1 och mPFC. Observera det lilla standardfelet för medelvärdet (SEM) i alla dendritiska ryggradsvärden.
Figur 1: Ventral yta av råtthjärnan. Fotografi av den ventrala ytan på en färsk råtthjärna som indikerar var man ska skära i främre och bakre block innan de nedsänker block i initiala lösningar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Typisk pyramidal cell. Schematisk av en pyramidal cell, som illustrerar apikala och basala dendriter som analyseras för dendritisk ryggradstäthet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Golgi impregnerad neuron. Exempel på Golgi impregnerade neuroner i CA1-regionen i råtta hippocampus. Vänster: Flera impregnerade pyramidala celler. Skalstång = 25 μm. Uppe till höger: Basala dendriter. Skalstång = 12,5 μm. Nedre högra: Exempel på en sekundär basal dendrit. Pilar betecknar spines. Skala bar = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Ryggradstäthet. En datauppsättning som illustrerar basal och apikal dendritisk ryggradstäthet i mPFC- och CA1-regionen i hippocampus (CA1) efter miljöanrikning (EE) jämfört med kontroll (CON) hos han- (M) och honråttor (F). Histogram visar det genomsnittliga antalet spines/10 μm dendrit + SEM. Data analyserades med hjälp av statistisk analysprogramvara (se Materialtabell). Tvåvägs (kön X EE) ANOVAs användes för att testa för gruppskillnader och Fishers LSD-tester användes för post-hoc-analys. Signifikanta effekter är p<0,05. t betecknar en signifikant skillnad. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det föreliggande protokollet beskriver en metod för Golgi-impregnering som möjliggör snabb samtidig bearbetning av många sektioner. Det är en förbättring jämfört med tidigare beskrivna5 mer arbetsintensiva metoder och ger konsekvent impregnerade neuroner för analys. Dessutom finns det mindre exponering för giftiga kemikalier som används vid Golgi-impregnering. Den mest utmanande delen av processen är att få sektionerna att vara platta på bilderna, vilket kräver stor övning. Att hålla allt så kallt som möjligt med användning av frysspray är viktigt.
När bilderna är torra och analys kan utföras är det mycket viktigt att vara konsekvent när man väljer de celler som räknas. Hippocampala pyramidala celler väljs från CA1. För mPFC, som har flera underdelar, används pyramidala celler från den infralimbiska cortexen. Av skäl som inte är tydliga färgas färre celler i mPFC än i CA1-regionen i hippocampus. Dessutom är det möjligt att kombinera experiment när alla sektioner inte kan bearbetas tillsammans av logistiska skäl. För konsistens bör samma person räkna en given uppsättning celler.
Begränsningarna för denna metod liknar alla Golgi-impregneringsmetoder. Det faktum att endast ett litet antal celler är färgade är en fördel. Det lilla antalet celler impregnerade möjliggör visualisering av hela cellen i tre dimensioner. Nackdelen med Golgi-metoden är att det inte är klart vilken delmängd av cellerna som är märkt. Därför måste man i experiment anta att cellerna impregnerade för både kontroll- och experimentgrupper är desamma. Även om denna metod resulterar i mycket bättre färgning än tidigare metoder, finns det alltid celler som inte kan analyseras eftersom de är täckta av skräp, en luftbubbla eller har brutna dendriter.
Sammanfattningsvis är den snabba Golgi-metoden som beskrivs här en snabb, säker metod för konsekvent och reproducerbar märkning av neuroner som kan användas för alla hjärnregioner. Förutom att märka celler i prefrontal cortex17,18 och hippocampus 10,12,19, har den också använts i amygdala20, cerebellum21 och cortex22. Förutsatt att man är bekant med anatomin och snabbt kan identifiera celler, kan handräkning av ryggradstäthet ge ett snabbt resultat, men det ger inte information om dendritiska subtyper som kräver mer sofistikerade analysmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Sacred Heart University Undergraduate Research InitiativeGrants.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
References
- Pannese, E. The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences. Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).
- Bentivoglio, M., et al. The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3 (2019).
- Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal. , Abrams. 208 (2017).
- Dall'Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. The "single-section" Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The 'single' section Golgi-impregnation procedure: methodological description. Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone. Glia. 3 (4), 283-292 (1990).
- Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood. Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).
- Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).
- Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat. Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).
- Frankfurt, M., Luine, V. The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol. Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).
- Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age. Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).
- Bowman, R. E., et al. Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats. Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).
- Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats. Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).
- Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines. Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).
- Jacome, L. F., et al. Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats. Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).
- Frankfurt, M. Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory. Research Features. , https://researchfeatures.com/wp-content/uploads/2021/05/Maya-Frankfurt.pdf (2021).
- Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex. Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).
- Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats. Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).
- Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood. Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).
- Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density. Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).
- Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia. Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).
- Zemmar, A., et al. Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex. Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).
