Zuivering van ubiquitinated p53-eiwitten uit zoogdiercellen
Summary
Het protocol beschrijft een stapsgewijze methode om ubiquitinated eiwitten uit zoogdiercellen te zuiveren met behulp van het p53 tumor suppressor-eiwit als voorbeeld. Ubiquitinated p53-eiwitten werden gezuiverd uit cellen onder strenge niet-condenserende en denaturerende omstandigheden.
Abstract
Ubiquitinatie is een soort posttranslationele modificatie die niet alleen de stabiliteit reguleert, maar ook de lokalisatie en functie van een substraateiwit. Het ubiquitinatieproces vindt intracellulair plaats in eukaryoten en reguleert bijna alle basale cellulaire biologische processen. Zuivering van ubiquitinated eiwitten helpt bij het onderzoek naar de rol van ubiquitinatie bij het beheersen van de functie van substraateiwitten. Hier wordt een stapsgewijze procedure beschreven om ubiquitinated eiwitten in zoogdiercellen te zuiveren met het p53 tumorsuppressorgeiwit als voorbeeld. Ubiquitinated p53-eiwitten werden gezuiverd onder strenge niet-denaturerende en denaturerende omstandigheden. Totaal cellulair Flag-tagged p53-eiwit werd gezuiverd met anti-Flag antilichaam-geconjugeerde agarose onder niet-denaturerende omstandigheden. Als alternatief werd het totale cellulaire His-tagged ubiquitinated eiwit gezuiverd met behulp van nikkel-geladen hars onder denatureringsomstandigheden. Ubiquitinated p53-eiwitten in de eluaten werden met succes gedetecteerd met specifieke antilichamen. Met behulp van deze procedure kunnen de alomtegenwoordige vormen van een bepaald eiwit efficiënt worden gezuiverd uit zoogdiercellen, waardoor studies naar de rol van ubiquitinatie bij het reguleren van de eiwitfunctie worden vergemakkelijkt.
Introduction
Ubiquitine is een evolutionair geconserveerd eiwit van 76 aminozuren 1,2,3. Ubiquitine bindt covalent lysineresiduen op doeleiwitten door middel van cascades met activerende (E1), conjugaterende (E2) en ligase (E3) enzymen. Ubiquitine wordt eerst geactiveerd door het E1-enzym en wordt vervolgens overgebracht naar de E2-conjugaterende enzymen. Vervolgens interageren E3-ubiquitine-ligases met zowel ubiquitine-geladen E2-enzymen als substraateiwitten en bemiddelen ze de vorming van een isopeptidebinding tussen de C-terminal van ubiquitine en een lysineresidu in het substraat 1,2,3,4,5. Ubiquitinatie omvat de aanhechting van ubiquitine moieties aan lysineresiduen op substraateiwitten of aan zichzelf, wat leidt tot eiwitmonoubiquitinatie of polyubiquitinatie. Dit ubiquitinatieproces vindt intracellulair plaats in eukaryoten en reguleert een grote verscheidenheid aan biologische processen. Ubiquitinatie resulteert in de afbraak van substraateiwitten via het ubiquitine-proteasoomsysteem 1,2,3,4,5. Bovendien moduleert ubiquitinatie eiwitsubcellulaire lokalisatie, eiwitcomplexvorming en eiwithandel in cellen 3,5. Ubiquitine moieties die aan substraateiwitten zijn toegevoegd, kunnen worden verwijderd door deubiquitinerende enzymen (DUB’s)6,7. Met name de verschillende manieren waarop ubiquitineketens worden samengesteld, bieden een groot aantal middelen om verschillende biologische processen te reguleren 1,5. De exacte rol van ubiquitinatie bij het reguleren van de substraateiwitfunctie blijft tot nu toe onvolledig begrepen. De zuivering van ubiquitinated eiwitten draagt bij aan de opheldering van de effecten van eiwitubiquitinatie op een verscheidenheid aan cellulaire processen.
Het p53-eiwit is een van de belangrijkste tumorsuppressorgeiwitten en vertoont genetische mutaties of inactivatie bij bijna alle menselijke kankers 8,9,10,11. p53 stabiliteit en activiteit worden in vivo subtiel gereguleerd door posttranslationele modificaties, waaronder ubiquitinatie, fosforylering, acetylering en methylatie12,13. Het p53-eiwit heeft een korte halfwaardetijd variërend van 6 min tot 40 minuten in verschillende cellen, wat voornamelijk het gevolg is van de polyubiquitinatie en daaropvolgende proteasomale afbraak10,12. Muis dubbele minuut 2 (Mdm2) is een E3 ubiquitine ligase van p53 dat bindt aan de N-terminus van p53 om zijn transcriptionele activiteit te remmen 12,14,15. Mdm2 bevordert de polyubiquitinatie en proteasomale afbraak van p53 om de stabiliteit ervan te beheersen en induceert monoubiquitinatie van p53 om de nucleaire export te vergemakkelijken 12,14,15,16. Hier wordt Mdm2-gemedieerde p53-ubiquitinatie als voorbeeld gebruikt om een methode voor de zuivering van ubiquitinated eiwitten uit zoogdiercellen in detail te introduceren. De regulatoren die de ubiquitinatiestatus van doeleiwitten beïnvloeden, kunnen worden geïdentificeerd met behulp van deze in vivo ubiquitinatietest wanneer ze overexpressie hebben of worden neergeslagen / uitgeschakeld in zoogdiercellen. Bovendien kunnen ubiquitinated eiwitten worden gebruikt als substraten voor in vitro deubiquitinatietest. Een high-throughput screening kan worden uitgevoerd om specifieke DUB’s voor doeleiwitten te identificeren door ubiquitinated substraten te incuberen met individuele DUB’s. Ubiquitinated eiwitten kunnen fungeren als een steiger om downstream signaaleiwitten in cellen te rekruteren. Een alomtegenwoordig doeleiwitcomplex kan worden gezuiverd door sequentiële immunoprecipitatie onder inheemse zuiveringsomstandigheden en worden geïdentificeerd door massaspectrometrie. Het huidige protocol kan uitgebreid worden gebruikt om de cellulaire eiwitten te onderzoeken die worden gereguleerd door ubiquitinatie.
Er zijn verschillende methoden vastgesteld om ubiquitinated eiwitten te zuiveren, waaronder het gebruik van affiniteit-tagged ubiquitine, ubiquitine-antilichamen, ubiquitine-bindende eiwitten en geïsoleerde ubiquitine-bindende domeinen (UBD’s)17. Hier bieden we een protocol met behulp van affiniteit-gelabeld ubiquitine als een mediator om ubiquitinated eiwitten in zoogdiercellen te zuiveren. Het gebruik van poly-His-tagged ubiquitine biedt voordelen ten opzichte van de andere methoden. Ubiquitinated eiwitten worden gezuiverd in de aanwezigheid van sterke denaturanten, die niet-specifieke binding aan nikkel-geladen hars verminderen door cellulaire eiwitten te lineariseren en eiwit-eiwitinteracties te verstoren. Daarentegen kan het gebruik van ubiquitine-antilichamen, ubiquitine-bindende eiwitten en geïsoleerde URD’s als mediatoren bindende partners niet effectief uitsluiten van doeleiwit omdat zuivering onder minder strenge voorwaarden moet worden uitgevoerd. Bovendien kan zuivering ook leiden tot een verhoogde binding van niet-gerelateerde eiwitten met behulp van deze mediatoren. Bovendien is er een bindende neiging voor verschillende ubiquitine-koppelingstypen en mono- en poly-ubiquitinatie door ubiquitine-bindende eiwitten of geïsoleerde UBD’s17. Het gebruik van poly-His-tagged ubiquitine draagt bij aan het naar beneden halen van alle cellulaire ubiquitinated eiwitten. Als alternatief maakt het gebruik van in de handel verkrijgbare anti-Flag of anti-HA antilichaam-geconjugeerde agarose het gemakkelijker om grootschalige Flag- of HA-gelabelde doeleiwitten onder niet-condenserende omstandigheden te immunopreciperen. Een tweede zuiveringsstap, bijvoorbeeld door nikkel-geladen hars gericht op poly-His-tagged ubiquitine, kan worden gebruikt om ubiquitinated doeleiwitten met een hoge zuiverheid te verkrijgen voor downstream experimenten. Met name een epitoop tagging zuiveringsstrategie kan worden aangepast wanneer een specifiek antilichaam niet kan worden verkregen om doeleiwitten effectief te immunoprecipitaat. Ten slotte behoudt de zuivering van ubiquitinated eiwitten in zoogdiercellen, in vergelijking met zuivering in vitro, de ubiquitine-koppelingsmodus van doeleiwitten onder meer fysiologische omstandigheden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ubiquitinatie speelt een cruciale rol in bijna alle fysiologische en pathologische cellulaire processen2. In de afgelopen jaren is grote vooruitgang geboekt bij het begrijpen van de moleculaire rol van ubiquitine in signaalroutes en hoe veranderingen in het ubiquitinesysteem leiden tot verschillende menselijke ziekten2. De zuivering van ubiquitinated eiwitten draagt bij aan het inzichtelijk maken van de exacte rollen van ubiquitinatie in deze processen. De mengsels van ubiq…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Natural Science Foundation of China (81972624) aan D.L.
Materials
| β-mercaptoethanol | Sangon Biotech | M6250 | |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE healthcare | NA931 | Secondary antibdoy |
| Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE healthcare | NA935 | Secondary antibdoy |
| Anti-Flag M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | FLAG/M2 beads |
| Anti-GFP monocolonal antibody | Santa cruz | sc-9996 | Primary antibody |
| Anti-HA High Affinity | Roche | 11867423001 | Primary antibody |
| Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) | Santa cruz | sc-965 | Primary antibody |
| Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) | Santa cruz | sc-126 | Primary antibody |
| EDTA | Sigma-Alddich | E5134 | solvent |
| Fetal Bovine Serum | VivaCell | C04001-500 | FBS |
| FLAG Peptide | Sigma-Alddich | F3290 | Prepare elution buffer |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | supplement |
| Guanidine-HCI | Sangon Biotech | A100287-0500 | solvent |
| H1299 | Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | ||
| Image Lab | Bio-rad | software | |
| Immidazole | Sangon Biotech | A500529-0100 | solvent |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Lipofectamine 2000 reagents | Invitrogen | 11668019 | Transfection reagent |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | solvent |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | solvent |
| NaF | Sigma-Alddich | 201154 | solvent |
| NaH2PO4 | Sangon Biotech | A501726-0500 | solvent |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30230 | nickel-charged resin |
| Nitrocellulose Blotting membrane | GE healthcare | 10600002 | 0.45 µm pore size |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Transfection medium |
| PBS | Corning | 21-040-cv | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sangon Biotech | E607011-0100 | antibiotic |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RPMI 1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | medium |
| Sarkosyl | Sigma-Alddich | L5777 | solvent |
| SDS Loading Buffer | Beyotime | P0015L | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | supplement |
| Tris-base | Sangon Biotech | A501492-0005 | solvent |
| Tris-HCI | Sangon Biotech | A610103-0250 | solvent |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A110694-0500 | reagent |
| Tween-20 | Sangon Biotech | A100777-0500 | supplement |
| Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System | Bio-rad | ChemiDoc XRS+ | |
| Urea | Sangon Biotech | A510907-0500 | solvent |
Riferimenti
- Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
- Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. Ubiquitin-binding domains – from structures to functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).
- Oh, E., Akopian, D., Rape, M. Principles of ubiquitin-dependent signaling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).
- Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).
- Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).
- Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. Surfing the p53 network. Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).
- Boutelle, A. M., Attardi, L. D. p53 and Tumor suppression: It takes a network. Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).
- Levine, A. J. p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the light: The growing complexity of p53. Cell. 137 (3), 413-431 (2009).
- Brooks, C. L., Gu, W. p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond. Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).
- Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian. Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).
- Dobbelstein, M., Levine, A. J. Mdm2: Open questions. Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).
- Kulikov, R., et al. Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).
- Li, M., et al. Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2. Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).
- Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. Methods for the purification of ubiquitinated proteins. Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).
- Green, M., Sambrook, J. . Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, 28 (2012).
