Очистка убиквитинированных белков p53 из клеток млекопитающих
Summary
Протокол описывает пошаговый метод очистки убиквитинированных белков из клеток млекопитающих с использованием белка-супрессора опухоли p53 в качестве примера. Убиквитинированные белки р53 были очищены из клеток в строгих условиях неденатурации и денатурации.
Abstract
Убиквитинация — это тип посттрансляционной модификации, которая регулирует не только стабильность, но и локализацию и функцию субстратного белка. Процесс убиквитинирования происходит внутриклеточным образом у эукариот и регулирует практически все основные клеточные биологические процессы. Очистка убиквитинированных белков помогает исследовать роль убиквитинирования в контроле функции субстратных белков. Здесь описана пошаговая процедура очистки убиквитинированных белков в клетках млекопитающих с помощью белка-супрессора опухоли p53 в качестве примера. Убиквитинированные белки р53 очищали в строгих условиях неденатурации и денатурации. Общий клеточный белок p53, помеченный флагом, очищали антифланг-конъюгированной агарозой в неденатурирующих условиях. Альтернативно, общий клеточный убиквитинированный белок, помеченный His, очищали с использованием никелевой смолы в условиях денатурации. Убиквитинированные белки р53 в элюатах были успешно обнаружены со специфическими антителами. Используя эту процедуру, убиквитинированные формы данного белка могут быть эффективно очищены от клеток млекопитающих, что облегчает исследования роли убиквитинирования в регулировании функции белка.
Introduction
Убиквитин представляет собой эволюционно сохраненный белок из 76 аминокислот 1,2,3. Убиквитин ковалентно связывает остатки лизина с белками-мишенями через каскады, включающие активирующие (E1), конъюгирующие (E2) и лигазные (E3) ферменты. Убиквитин сначала активируется ферментом E1, а затем переносится на конъюгирующие ферменты E2. Впоследствии лигазы убиквитина Е3 взаимодействуют как с убиквитин-нагруженными ферментами Е2, так и с белками субстрата и опосредуют образование изопептидной связи между С-терминалом убиквитина и остатком лизина в субстрате 1,2,3,4,5. Убиквитинирование включает в себя присоединение фрагментов убиквитина к остаткам лизина на белках субстрата или к самому себе, что приводит к моноубиквитинированию белка или полиубиквитинированию. Этот процесс убиквитинирования происходит внутриклеточным образом у эукариот и регулирует большое разнообразие биологических процессов. Убиквитинирование приводит к деградации белков субстрата через убиквитин-протеасомную систему 1,2,3,4,5. Кроме того, убиквитинирование модулирует субклеточную локализацию белка, образование белкового комплекса и незаконный оборот белка в клетках 3,5. Фрагменты убиквитина, лигированные белкам субстрата, могут быть удалены деубиквитинирующими ферментами (DUBs)6,7. Примечательно, что различные способы, которыми собраны цепи убиквитина, обеспечивают множество средств для регулирования различных биологических процессов 1,5. Точные роли убиквитинирования в регуляции функции субстратного белка до сих пор остаются не полностью изученными. Очистка убиквитинированных белков способствует выяснению влияния убиквитинирования белка на различные клеточные процессы.
Белок p53 является одним из наиболее важных белков-супрессоров опухолей и проявляет генетические мутации или инактивацию почти во всех раковых заболеваниях человека 8,9,10,11. Стабильность и активность p53 деликатно регулируются in vivo посттрансляционными модификациями, включая убиквитинирование, фосфорилирование, ацетилирование и метилирование12,13. Белок p53 имеет короткий период полувыведения от 6 мин до 40 мин в различных клетках, что является результатом в основном его полиубиквитинирования и последующей протеасомальной деградации10,12. Мышиная двойная минута 2 (Mdm2) представляет собой E3-убиквитин-лигазу p53, которая связывается с N-концом p53 для ингибирования его транскрипционной активности 12,14,15. Mdm2 способствует полиубиквитинированию и протеасомальной деградации р53 для контроля его стабильности и индуцирует моноубиквитинацию р53 для облегчения его ядерного экспорта 12,14,15,16. Здесь Mdm2-опосредованная p53 убиквитинация используется в качестве примера для введения способа очистки убиквитинированных белков из клеток млекопитающих в деталях. Регуляторы, которые влияют на статус убиквитинации белков-мишеней, могут быть идентифицированы с помощью этого анализа убиквитинирования in vivo, когда они чрезмерно экспрессируются или сбиваются / выбиваются в клетках млекопитающих. Кроме того, убиквитинированные белки могут быть использованы в качестве субстратов для анализа деубиквитинации in vitro. Высокопроизводительный скрининг может быть выполнен для идентификации конкретных DUB для целевых белков путем инкубации убиквитинированных субстратов с отдельными DUB. Убиквитинированные белки могут действовать как каркас для набора нисходящих сигнальных белков в клетках. Убиквитинированный целевой белковый комплекс может быть очищен последовательным иммунопреципитацией в условиях нативной очистки и идентифицирован масс-спектрометрией. Текущий протокол может быть широко использован для исследования клеточных белков, регулируемых убиквитинацией.
Было установлено несколько методов очистки убиквитинированных белков, которые включают использование аффинно-меченого убиквитина, антител убиквитина, убиквитин-связывающих белков и изолированных убиквитин-связывающих доменов (UBD)17. Здесь мы предоставляем протокол, использующий убиквитин с аффинными метками в качестве медиатора для очистки убиквитинированных белков в клетках млекопитающих. Использование поли-Гис-меченого убиквитина дает преимущества по сравнению с другими методами. Убиквитинированные белки очищаются в присутствии сильных денатурантов, что снижает неспецифическое связывание с никелевой смолой путем линеаризации клеточных белков и нарушения белково-белковых взаимодействий. Напротив, использование убиквитиновых антител, убиквитин-связывающих белков и изолированных UBD в качестве медиаторов не может эффективно исключать связывающих партнеров из целевого белка, потому что очистка должна выполняться в менее строгих условиях. Кроме того, очистка может также привести к усилению связывания несвязанных белков с использованием этих медиаторов. Кроме того, существует склонность к связыванию для различных типов связей убиквитина, а также моно- и полиубиквитинирования убиквитин-связывающими белками или изолированными UBDs17. Использование поли-Гис-меченого убиквитина способствует снижению всех клеточных убиквитинированных белков. Альтернативно, использование коммерчески доступной анти-Флаг или анти-ГК антитело-конъюгированной агарозы облегчает иммунопреципитацию крупномасштабных флаг- или ГК-меченых целевых белков в неденатурирующих условиях. Вторая стадия очистки, например, никелевой смолой, нацеленной на поли-Гис-меченый убиквитин, может быть использована для получения убиквитинированных целевых белков с высокой чистотой для последующих экспериментов. Примечательно, что стратегия очистки эпитопных меток может быть адаптирована, когда специфическое антитело не может быть приобретено для эффективного иммунопреципитации белков-мишеней. Наконец, очистка убиквитинированных белков в клетках млекопитающих, по сравнению с очисткой in vitro, сохраняет режим убиквитиновой связи белков-мишеней в более физиологических условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Убиквитинация играет важнейшую роль практически во всех физиологических и патологических клеточных процессах2. В последние годы был достигнут большой прогресс в понимании молекулярной роли убиквитина в сигнальных путях и того, как изменения в системе убиквитина приводя?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Национального фонда естественных наук Китая (81972624) D.L.
Materials
| β-mercaptoethanol | Sangon Biotech | M6250 | |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE healthcare | NA931 | Secondary antibdoy |
| Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE healthcare | NA935 | Secondary antibdoy |
| Anti-Flag M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | FLAG/M2 beads |
| Anti-GFP monocolonal antibody | Santa cruz | sc-9996 | Primary antibody |
| Anti-HA High Affinity | Roche | 11867423001 | Primary antibody |
| Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) | Santa cruz | sc-965 | Primary antibody |
| Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) | Santa cruz | sc-126 | Primary antibody |
| EDTA | Sigma-Alddich | E5134 | solvent |
| Fetal Bovine Serum | VivaCell | C04001-500 | FBS |
| FLAG Peptide | Sigma-Alddich | F3290 | Prepare elution buffer |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | supplement |
| Guanidine-HCI | Sangon Biotech | A100287-0500 | solvent |
| H1299 | Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | ||
| Image Lab | Bio-rad | software | |
| Immidazole | Sangon Biotech | A500529-0100 | solvent |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Lipofectamine 2000 reagents | Invitrogen | 11668019 | Transfection reagent |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | solvent |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | solvent |
| NaF | Sigma-Alddich | 201154 | solvent |
| NaH2PO4 | Sangon Biotech | A501726-0500 | solvent |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30230 | nickel-charged resin |
| Nitrocellulose Blotting membrane | GE healthcare | 10600002 | 0.45 µm pore size |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Transfection medium |
| PBS | Corning | 21-040-cv | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sangon Biotech | E607011-0100 | antibiotic |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RPMI 1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | medium |
| Sarkosyl | Sigma-Alddich | L5777 | solvent |
| SDS Loading Buffer | Beyotime | P0015L | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | supplement |
| Tris-base | Sangon Biotech | A501492-0005 | solvent |
| Tris-HCI | Sangon Biotech | A610103-0250 | solvent |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A110694-0500 | reagent |
| Tween-20 | Sangon Biotech | A100777-0500 | supplement |
| Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System | Bio-rad | ChemiDoc XRS+ | |
| Urea | Sangon Biotech | A510907-0500 | solvent |
Riferimenti
- Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
- Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. Ubiquitin-binding domains – from structures to functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).
- Oh, E., Akopian, D., Rape, M. Principles of ubiquitin-dependent signaling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).
- Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).
- Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).
- Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. Surfing the p53 network. Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).
- Boutelle, A. M., Attardi, L. D. p53 and Tumor suppression: It takes a network. Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).
- Levine, A. J. p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the light: The growing complexity of p53. Cell. 137 (3), 413-431 (2009).
- Brooks, C. L., Gu, W. p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond. Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).
- Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian. Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).
- Dobbelstein, M., Levine, A. J. Mdm2: Open questions. Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).
- Kulikov, R., et al. Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).
- Li, M., et al. Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2. Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).
- Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. Methods for the purification of ubiquitinated proteins. Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).
- Green, M., Sambrook, J. . Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, 28 (2012).
