Memeli Hücrelerinden Ubikitinlenmiş p53 Proteinlerinin Saflaştırılması
Summary
Protokol, örnek olarak p53 tümör baskılayıcı proteini kullanarak memeli hücrelerinden ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için adım adım bir yöntemi açıklar. Ubikitinlenmiş p53 proteinleri, sıkı denatüre olmayan ve denatüre edici koşullar altında hücrelerden saflaştırıldı.
Abstract
Ubikitinasyon, bir substrat proteininin sadece stabilitesini değil, aynı zamanda lokalizasyonunu ve işlevini de düzenleyen bir tür posttranslasyonel modifikasyondur. Ubikitinasyon süreci ökaryotlarda hücre içi olarak gerçekleşir ve neredeyse tüm temel hücresel biyolojik süreçleri düzenler. Ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması, substrat proteinlerinin işlevini kontrol etmede ubikitinasyonun rolünün araştırılmasına yardımcı olur. Burada, memeli hücrelerinde ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için adım adım bir prosedür, örnek olarak p53 tümör baskılayıcı protein ile tanımlanmıştır. Ubikitinlenmiş p53 proteinleri, sıkı denatüre olmayan ve denatüre edici koşullar altında saflaştırıldı. Total hücresel Bayrak etiketli p53 proteini, denatüre olmayan koşullar altında anti-Flag antikor konjuge agaroz ile saflaştırıldı. Alternatif olarak, toplam hücresel His etiketli ubikitinlenmiş protein, denatüre edici koşullar altında nikel yüklü reçine kullanılarak saflaştırıldı. Elatlardaki ubikitinlenmiş p53 proteinleri, spesifik antikorlarla başarılı bir şekilde tespit edildi. Bu prosedürü kullanarak, belirli bir proteinin ubikitinlenmiş formları, memeli hücrelerinden verimli bir şekilde saflaştırılabilir ve bu da protein fonksiyonunun düzenlenmesinde ubikitinasyonun rolleri üzerine çalışmaları kolaylaştırır.
Introduction
Ubikitin, 76 amino asit 1,2,3’ün evrimsel olarak korunmuş bir proteinidir. Ubikitin, hedef proteinler üzerindeki lizin kalıntılarını, aktive edici (E1), konjuge edici (E2) ve ligaz (E3) enzimlerini içeren kaskadlar yoluyla kovalent olarak bağlar. Ubikitin ilk önce E1 enzimi tarafından aktive edilir ve daha sonra E2 konjuge edici enzimlere aktarılır. Daha sonra, E3 ubikitin ligazları hem ubikitin yüklü E2 enzimleri hem de substrat proteinleri ile etkileşime girer ve ubikitinin C-terminali ile substrat 1,2,3,4,5’teki bir lizin kalıntısı arasında bir izopeptit bağının oluşumuna aracılık eder. Ubikitinasyon, ubikitin moieties substrat proteinleri üzerindeki lizin kalıntılarına veya kendisine bağlanmasını içerir ve bu da protein monoubikitinasyonuna veya poliubikitinasyona yol açar. Bu ubikitinasyon süreci ökaryotlarda hücre içi olarak gerçekleşir ve çok çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Ubikitinasyon, substrat proteinlerinin ubikitin-proteazom sistemi 1,2,3,4,5 yoluyla parçalanmasıyla sonuçlanır. Ek olarak, ubikitinasyon protein hücre altı lokalizasyonunu, protein kompleks oluşumunu ve hücrelerdeki protein kaçakçılığını modüle eder 3,5. Substrat proteinlerine bağlı ubikitin moieties deubikitinating enzimler (DUB’ler) tarafından uzaklaştırılabilir6,7. Özellikle, ubikitin zincirlerinin bir araya getirildiği farklı yollar, çeşitli biyolojik süreçleri düzenlemek için sayısız araç sağlar 1,5. Substrat protein fonksiyonunun düzenlenmesinde ubikitinasyonun kesin rolü şimdiye kadar tam olarak anlaşılamamıştır. Ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması, protein ubikitinasyonunun çeşitli hücresel süreçler üzerindeki etkilerinin aydınlatılmasına katkıda bulunur.
P53 proteini en önemli tümör baskılayıcı proteinlerden biridir ve hemen hemen tüm insan kanserlerinde genetik mutasyonlar veya inaktivasyon sergiler 8,9,10,11. p53 stabilitesi ve aktivitesi, ubikitinasyon, fosforilasyon, asetilasyon ve metilasyon12,13 dahil olmak üzere posttranslasyonel modifikasyonlarla in vivo olarak hassas bir şekilde düzenlenir. P53 proteini, çeşitli hücrelerde 6 dakika ila 40 dakika arasında değişen kısa bir yarı ömre sahiptir, bu da esas olarak poliubikitinasyonu ve ardından proteazomal bozunması 10,12’den kaynaklanır. Fare çift dakika 2 (Mdm2), transkripsiyonel aktivitesini inhibe etmek için p53’ün N-terminusuna bağlanan bir E3 ubikitin ligazıdır12,14,15. Mdm2, stabilitesini kontrol etmek için p53’ün poliubikitinasyonunu ve proteazomal bozunmasını teşvik eder ve nükleer ihracatını kolaylaştırmak için p53’ün monoubikitinasyonunu indükler12,14,15,16. Burada, Mdm2 aracılı p53 ubikitinasyonu, memeli hücrelerinden ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması için ayrıntılı olarak bir yöntem tanıtmak için örnek olarak kullanılmıştır. Hedef proteinlerin ubikitinasyon durumunu etkileyen düzenleyiciler, memeli hücrelerinde aşırı eksprese edildiklerinde veya yıkıldıklarında / nakavt edildiklerinde bu in vivo ubikitinasyon testi kullanılarak tanımlanabilir. Ek olarak, ubikitinlenmiş proteinler in vitro deubikitinasyon testi için substrat olarak kullanılabilir. Her yerde bulunan substratları bireysel DUB’lerle inkübe ederek hedef proteinler için spesifik DUB’leri tanımlamak için yüksek verimli bir tarama yapılabilir. Ubikitinlenmiş proteinler, hücrelerde aşağı akış sinyal proteinlerini işe almak için bir iskele görevi görebilir. Her yerde bulunan bir hedef protein kompleksi, doğal saflaştırma koşulları altında sıralı immünopresipitasyon ile saflaştırılabilir ve kütle spektrometrisi ile tanımlanabilir. Mevcut protokol, ubikitinasyon tarafından düzenlenen hücresel proteinleri araştırmak için yaygın olarak kullanılabilir.
Ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için, afinite etiketli ubikitin, ubikitin antikorları, ubikitin bağlayıcı proteinler ve izole ubikitin bağlayıcı alanların (UBD’ler) kullanımını içeren çeşitli yöntemler oluşturulmuştur17. Burada, memeli hücrelerinde ubikitinlenmiş proteinleri saflaştırmak için bir aracı olarak afinite etiketli ubikitini kullanan bir protokol sunuyoruz. Poli-His-etiketli ubikitin kullanımı diğer yöntemlere göre avantajlar sunar. Ubikitinlenmiş proteinler, hücresel proteinleri doğrusallaştırarak ve protein-protein etkileşimlerini bozarak nikel yüklü reçineye spesifik olmayan bağlanmayı azaltan güçlü denatürantların varlığında saflaştırılır. Buna karşılık, ubikitin antikorlarının, ubikitin bağlayıcı proteinlerin ve izole UBD’lerin aracılar olarak kullanılması, bağlanma ortaklarını hedef proteinden etkili bir şekilde dışlayamaz, çünkü saflaştırmanın daha az katı koşullar altında yapılması gerekir. Dahası, saflaştırma, bu aracıları kullanarak ilgisiz proteinlerin bağlanmasının artmasına da yol açabilir. Ek olarak, çeşitli ubikitin bağlantı tiplerinin yanı sıra ubikitin bağlayıcı proteinler veya izole UBD’ler tarafından mono- ve poli-ubikitinasyon için bağlanma eğilimi vardır17. Poli-His-etiketli ubikitin kullanımı, tüm hücresel ubikitinlenmiş proteinlerin aşağı çekilmesine katkıda bulunur. Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen anti-Flag veya anti-HA antikor konjuge agarozun kullanılması, büyük ölçekli Bayrak veya HA etiketli hedef proteinlerin denatüre olmayan koşullar altında immünopreçökeltiyi kolaylaştırır. Örneğin, poli-His-etiketli ubikitini hedefleyen nikel yüklü reçine ile ikinci bir saflaştırma adımı, aşağı akış deneyleri için yüksek saflıkta ubikitinlenmiş hedef proteinleri elde etmek için kullanılabilir. Özellikle, bir epitop etiketleme saflaştırma stratejisi, hedef proteinleri etkili bir şekilde immünopreçökite etmek için spesifik bir antikor elde edilemediğinde uyarlanabilir. Son olarak, memeli hücrelerinde ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması, in vitro saflaştırma ile karşılaştırıldığında, hedef proteinlerin ubikitin bağlantı modunu daha fizyolojik koşullar altında korur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ubikitinasyon hemen hemen tüm fizyolojik ve patolojik hücresel süreçlerde kritik bir rol oynar2. Son yıllarda, ubikitinin sinyal yolaklarındaki moleküler rolünü ve ubikitin sistemindeki değişikliklerin farklı insan hastalıklarına nasıl yol açtığını anlamada büyük ilerleme kaydedilmiştir2. Ubikitinlenmiş proteinlerin saflaştırılması, bu süreçlerde ubikitinasyonun kesin rolleri hakkında fikir vermeye katkıda bulunur. Ubikitin konjuge proteinler…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’ndan (81972624) D.L.’ye verilen bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| β-mercaptoethanol | Sangon Biotech | M6250 | |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE healthcare | NA931 | Secondary antibdoy |
| Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE healthcare | NA935 | Secondary antibdoy |
| Anti-Flag M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | FLAG/M2 beads |
| Anti-GFP monocolonal antibody | Santa cruz | sc-9996 | Primary antibody |
| Anti-HA High Affinity | Roche | 11867423001 | Primary antibody |
| Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) | Santa cruz | sc-965 | Primary antibody |
| Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) | Santa cruz | sc-126 | Primary antibody |
| EDTA | Sigma-Alddich | E5134 | solvent |
| Fetal Bovine Serum | VivaCell | C04001-500 | FBS |
| FLAG Peptide | Sigma-Alddich | F3290 | Prepare elution buffer |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | supplement |
| Guanidine-HCI | Sangon Biotech | A100287-0500 | solvent |
| H1299 | Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | ||
| Image Lab | Bio-rad | software | |
| Immidazole | Sangon Biotech | A500529-0100 | solvent |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Lipofectamine 2000 reagents | Invitrogen | 11668019 | Transfection reagent |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | solvent |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | solvent |
| NaF | Sigma-Alddich | 201154 | solvent |
| NaH2PO4 | Sangon Biotech | A501726-0500 | solvent |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30230 | nickel-charged resin |
| Nitrocellulose Blotting membrane | GE healthcare | 10600002 | 0.45 µm pore size |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Transfection medium |
| PBS | Corning | 21-040-cv | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sangon Biotech | E607011-0100 | antibiotic |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RPMI 1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | medium |
| Sarkosyl | Sigma-Alddich | L5777 | solvent |
| SDS Loading Buffer | Beyotime | P0015L | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | supplement |
| Tris-base | Sangon Biotech | A501492-0005 | solvent |
| Tris-HCI | Sangon Biotech | A610103-0250 | solvent |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A110694-0500 | reagent |
| Tween-20 | Sangon Biotech | A100777-0500 | supplement |
| Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System | Bio-rad | ChemiDoc XRS+ | |
| Urea | Sangon Biotech | A510907-0500 | solvent |
Riferimenti
- Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
- Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. Ubiquitin-binding domains – from structures to functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).
- Oh, E., Akopian, D., Rape, M. Principles of ubiquitin-dependent signaling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).
- Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).
- Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).
- Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. Surfing the p53 network. Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).
- Boutelle, A. M., Attardi, L. D. p53 and Tumor suppression: It takes a network. Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).
- Levine, A. J. p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the light: The growing complexity of p53. Cell. 137 (3), 413-431 (2009).
- Brooks, C. L., Gu, W. p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond. Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).
- Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian. Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).
- Dobbelstein, M., Levine, A. J. Mdm2: Open questions. Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).
- Kulikov, R., et al. Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).
- Li, M., et al. Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2. Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).
- Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. Methods for the purification of ubiquitinated proteins. Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).
- Green, M., Sambrook, J. . Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, 28 (2012).
