Purification des protéines p53 ubiquitinées à partir de cellules de mammifères
Summary
Le protocole décrit une méthode étape par étape pour purifier les protéines ubiquitinées à partir de cellules de mammifères en utilisant la protéine suppresseur de tumeur p53 comme exemple. Les protéines p53 ubiquitinées ont été purifiées à partir de cellules dans des conditions strictes de non-dénaturation et de dénaturation.
Abstract
L’ubiquitination est un type de modification post-traductionnelle qui régule non seulement la stabilité, mais aussi la localisation et la fonction d’une protéine substrat. Le processus d’ubiquitination se produit intracellulaire chez les eucaryotes et régule presque tous les processus biologiques cellulaires de base. La purification des protéines ubiquitinées aide à étudier le rôle de l’ubiquitination dans le contrôle de la fonction des protéines substrat. Ici, une procédure étape par étape pour purifier les protéines ubiquitinées dans les cellules de mammifères est décrite avec la protéine suppresseur de tumeur p53 à titre d’exemple. Les protéines p53 ubiquitinées ont été purifiées dans des conditions strictes de non-dénaturation et de dénaturation. La protéine p53 totale marquée au drapeau cellulaire a été purifiée avec de l’agarose conjuguée à l’anticorps anti-drapeau dans des conditions non dénaturantes. Alternativement, la protéine ubiquitinée totale marquée His cellulaire a été purifiée à l’aide de résine chargée de nickel dans des conditions de dénaturation. Les protéines p53 ubiquitinées dans les éluats ont été détectées avec succès avec des anticorps spécifiques. En utilisant cette procédure, les formes ubiquitinées d’une protéine donnée peuvent être efficacement purifiées à partir de cellules de mammifères, facilitant ainsi les études sur les rôles de l’ubiquitination dans la régulation de la fonction protéique.
Introduction
L’ubiquitine est une protéine conservée au cours de l’évolution de 76 acides aminés 1,2,3. L’ubiquitine se lie de manière covalente aux résidus de lysine sur les protéines cibles par des cascades impliquant des enzymes activatrices (E1), conjuguées (E2) et ligases (E3). L’ubiquitine est d’abord activée par l’enzyme E1, puis transférée aux enzymes conjuguées E2. Par la suite, E3 ubiquitin ligases interagit à la fois avec les enzymes E2 chargées d’ubiquitine et les protéines de substrat et médie la formation d’une liaison isopeptidique entre le C-terminal de l’ubiquitine et un résidu de lysine dans le substrat 1,2,3,4,5. L’ubiquitination implique la fixation de fractions ubiquitine à des résidus de lysine sur des protéines substrats ou à elle-même, conduisant à une monoubiquitination ou une polyubiquitination des protéines. Ce processus d’ubiquitination se produit intracellulaire chez les eucaryotes et régule une grande variété de processus biologiques. L’ubiquitination entraîne la dégradation des protéines du substrat via le système ubiquitine-protéasome 1,2,3,4,5. De plus, l’ubiquitination module la localisation subcellulaire des protéines, la formation de complexes protéiques et le trafic de protéines dans les cellules 3,5. Les fractions ubiquitine ligaturées sur les protéines substrat peuvent être éliminées par des enzymes déubiquitinantes (DUB)6,7. Notamment, les différentes façons dont les chaînes ubiquitines sont assemblées fournissent une myriade de moyens pour réguler divers processus biologiques 1,5. Les rôles exacts de l’ubiquitination dans la régulation de la fonction des protéines du substrat restent incomplètement compris jusqu’à présent. La purification des protéines ubiquitinées contribue à l’élucidation des effets de l’ubiquitination des protéines sur une variété de processus cellulaires.
La protéine p53 est l’une des protéines suppressrices de tumeurs les plus importantes et présente des mutations génétiques ou une inactivation dans presque tous les cancers humains 8,9,10,11. La stabilité et l’activité de P53 sont délicatement régulées in vivo par des modifications post-traductionnelles, y compris l’ubiquitination, la phosphorylation, l’acétylation et la méthylation12,13. La protéine p53 a une demi-vie courte allant de 6 min à 40 min dans diverses cellules, ce qui résulte principalement de sa polyubiquitination et de sa dégradation protéasomale ultérieure10,12. La souris double minute 2 (Mdm2) est une ubiquitine ligase E3 de p53 qui se lie à l’extrémité N de p53 pour inhiber son activité transcriptionnelle12,14,15. Mdm2 favorise la polyubiquitination et la dégradation protéasomale de p53 pour contrôler sa stabilité et induit une monoubiquitination de p53 pour faciliter son exportation nucléaire12,14,15,16. Ici, l’ubiquitination p53 médiée par Mdm2 est utilisée comme exemple pour introduire une méthode de purification des protéines ubiquitinées à partir de cellules de mammifères en détail. Les régulateurs qui influencent le statut d’ubiquitination des protéines cibles peuvent être identifiés à l’aide de ce test d’ubiquitination in vivo lorsqu’ils sont surexprimés ou renversés / assommés dans des cellules de mammifères. En outre, les protéines ubiquitinées peuvent être utilisées comme substrats pour le test de déubiquitination in vitro. Un criblage à haut débit peut être effectué pour identifier des DUB spécifiques pour les protéines cibles en incubant des substrats ubiquitinés avec des DUB individuels. Les protéines ubiquitinées peuvent agir comme un échafaudage pour recruter des protéines de signalisation en aval dans les cellules. Un complexe protéique cible ubiquitiné peut être purifié par immunoprécipitation séquentielle dans des conditions de purification natives et identifié par spectrométrie de masse. Le protocole actuel peut être largement utilisé pour étudier les protéines cellulaires régulées par ubiquitination.
Plusieurs méthodes ont été établies pour purifier les protéines ubiquitinées, notamment l’utilisation d’ubiquitine marquée par affinité, d’anticorps ubiquitine, de protéines de liaison à l’ubiquitine et de domaines isolés de liaison à l’ubiquitine (UBD)17. Ici, nous fournissons un protocole utilisant l’ubiquitine marquée par affinité comme médiateur pour purifier les protéines ubiquitinées dans les cellules de mammifères. L’utilisation de l’ubiquitine poly-marquée offre des avantages par rapport aux autres méthodes. Les protéines ubiquitinées sont purifiées en présence de dénaturants puissants, ce qui réduit la liaison non spécifique à la résine chargée de nickel en linéarisant les protéines cellulaires et en perturbant les interactions protéine-protéine. En revanche, l’utilisation d’anticorps ubiquitine, de protéines de liaison à l’ubiquitine et d’UBD isolés comme médiateurs ne peut pas exclure efficacement les partenaires de liaison de la protéine cible, car la purification doit être effectuée dans des conditions moins strictes. De plus, la purification peut également conduire à une liaison accrue de protéines non apparentées à l’aide de ces médiateurs. De plus, il existe une propension à se lier à divers types de liaison ubiquitine ainsi qu’à la mono- et poly-ubiquitination par des protéines de liaison à l’ubiquitine ou des UBD isolés17. L’utilisation de l’ubiquitine poly-marquée contribue à abattre toutes les protéines cellulaires ubiquitinées. Alternativement, l’utilisation d’agarose conjuguée anti-Flag ou anti-HA disponible dans le commerce facilite l’immunoprécipitation de protéines cibles marquées Flag ou HA à grande échelle dans des conditions non dénaturantes. Une deuxième étape de purification, par exemple, par résine chargée de nickel ciblant l’ubiquitine marquée poly-His, peut être utilisée pour acquérir des protéines cibles ubiquitinées d’une grande pureté pour des expériences en aval. Notamment, une stratégie de purification du marquage des épitopes peut être adaptée lorsqu’un anticorps spécifique ne peut pas être acquis pour immunoprécipiter efficacement les protéines cibles. Enfin, la purification des protéines ubiquitinées dans les cellules de mammifères, en comparaison avec la purification in vitro, conserve le mode de liaison ubiquitine des protéines cibles dans des conditions plus physiologiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ubiquitination joue un rôle essentiel dans presque tous les processus cellulaires physiologiques et pathologiques2. Ces dernières années, de grands progrès ont été réalisés dans la compréhension du rôle moléculaire de l’ubiquitine dans les voies de signalisation et de la façon dont les changements dans le système ubiquitine conduisent à différentes maladies humaines2. La purification des protéines ubiquitinées contribue à fournir un aperçu des rôle…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81972624) à D.L.
Materials
| β-mercaptoethanol | Sangon Biotech | M6250 | |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE healthcare | NA931 | Secondary antibdoy |
| Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE healthcare | NA935 | Secondary antibdoy |
| Anti-Flag M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | FLAG/M2 beads |
| Anti-GFP monocolonal antibody | Santa cruz | sc-9996 | Primary antibody |
| Anti-HA High Affinity | Roche | 11867423001 | Primary antibody |
| Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) | Santa cruz | sc-965 | Primary antibody |
| Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) | Santa cruz | sc-126 | Primary antibody |
| EDTA | Sigma-Alddich | E5134 | solvent |
| Fetal Bovine Serum | VivaCell | C04001-500 | FBS |
| FLAG Peptide | Sigma-Alddich | F3290 | Prepare elution buffer |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | supplement |
| Guanidine-HCI | Sangon Biotech | A100287-0500 | solvent |
| H1299 | Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | ||
| Image Lab | Bio-rad | software | |
| Immidazole | Sangon Biotech | A500529-0100 | solvent |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Lipofectamine 2000 reagents | Invitrogen | 11668019 | Transfection reagent |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | solvent |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | solvent |
| NaF | Sigma-Alddich | 201154 | solvent |
| NaH2PO4 | Sangon Biotech | A501726-0500 | solvent |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30230 | nickel-charged resin |
| Nitrocellulose Blotting membrane | GE healthcare | 10600002 | 0.45 µm pore size |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Transfection medium |
| PBS | Corning | 21-040-cv | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sangon Biotech | E607011-0100 | antibiotic |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RPMI 1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | medium |
| Sarkosyl | Sigma-Alddich | L5777 | solvent |
| SDS Loading Buffer | Beyotime | P0015L | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | supplement |
| Tris-base | Sangon Biotech | A501492-0005 | solvent |
| Tris-HCI | Sangon Biotech | A610103-0250 | solvent |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A110694-0500 | reagent |
| Tween-20 | Sangon Biotech | A100777-0500 | supplement |
| Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System | Bio-rad | ChemiDoc XRS+ | |
| Urea | Sangon Biotech | A510907-0500 | solvent |
Riferimenti
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