Rensing av allestedsnærværende p53-proteiner fra pattedyrceller
Summary
Protokollen beskriver en trinnvis metode for å rense ubiquitinerte proteiner fra pattedyrceller ved hjelp av p53 tumor suppressor protein som et eksempel. Ubiquitinated p53 proteiner ble renset fra celler under strenge nondenaturing og denaturing forhold.
Abstract
Ubiquitination er en type posttranslasjonell modifikasjon som regulerer ikke bare stabiliteten, men også lokaliseringen og funksjonen til et substratprotein. Ubiquitinasjonsprosessen skjer intracellulært i eukaryoter og regulerer nesten alle grunnleggende cellulære biologiske prosesser. Rensing av ubiquitinerte proteiner hjelper undersøkelsen av rollen som ubiquitination i å kontrollere funksjonen av substratproteiner. Her beskrives en trinnvis prosedyre for å rense ubiquitinerte proteiner i pattedyrceller med p53 tumor suppressor protein som et eksempel. Ubiquitinated p53 proteiner ble renset under strenge nondenaturing og denaturing forhold. Totalt cellulært Flag-merket p53-protein ble renset med anti-Flag antistoffkonjugert agarose under ikke-naturlige forhold. Alternativt ble totalt cellulært His-merket ubiquitinated protein renset ved hjelp av nikkelladet harpiks under denatureringsforhold. Ubiquitinated p53 proteiner i eluates ble vellykket oppdaget med spesifikke antistoffer. Ved hjelp av denne prosedyren kan de ubiquitinerte formene av et gitt protein effektivt renses fra pattedyrceller, noe som letter studier av rollene til ubiquitination i regulering av proteinfunksjon.
Introduction
Ubiquitin er et evolusjonært konservert protein av 76 aminosyrer 1,2,3. Ubiquitin binder kovalent lysinrester på målproteiner gjennom kaskader som involverer aktivering (E1), konjugerende (E2) og ligase (E3) enzymer. Ubiquitin aktiveres først av E1-enzymet og overføres deretter til E2-konjugerende enzymer. Deretter interagerer E3 ubiquitin-ligaser med både ubiquitinbelastede E2-enzymer og substratproteiner og formidler dannelsen av en isopeptidbinding mellom C-terminalen av ubiquitin og en lysinrest i substratet 1,2,3,4,5. Ubiquitination innebærer festing av ubiquitin deler til lysinrester på substratproteiner eller til seg selv, noe som fører til protein monoubiquitination eller polyubiquitination. Denne ubiquitinasjonsprosessen skjer intracellulært i eukaryoter og regulerer et stort utvalg av biologiske prosesser. Ubiquitination resulterer i nedbrytning av substratproteiner via ubiquitin-proteasomsystemet 1,2,3,4,5. I tillegg modulerer ubiquitination protein subcellulær lokalisering, proteinkompleksdannelse og proteinhandel i celler 3,5. Ubiquitindeler ligert til substratproteiner kan fjernes ved deubiquitinating enzymer (DUBs) 6,7. Spesielt gir de forskjellige måtene som ubiquitinkjeder er satt sammen et mylder av midler for å regulere ulike biologiske prosesser 1,5. De nøyaktige rollene til ubiquitination i regulering av substratproteinfunksjonen forblir ufullstendig forstått til nå. Rensingen av ubiquitinated proteiner bidrar til å belyse effekten av protein ubiquitination på en rekke cellulære prosesser.
P53-proteinet er et av de viktigste tumorsuppressorproteinene og utviser genetiske mutasjoner eller inaktivering i nesten alle humane kreftformer 8,9,10,11. P53 stabilitet og aktivitet reguleres delikat in vivo ved posttranslasjonelle modifikasjoner, inkludert ubiquitination, fosforylering, acetylering og metylering12,13. P53-proteinet har en kort halveringstid fra 6 minutter til 40 minutter i forskjellige celler, noe som hovedsakelig skyldes polyubiquitinering og påfølgende proteasomal nedbrytning10,12. Mus dobbelt minutt 2 (Mdm2) er en E3 ubiquitin ligase av p53 som binder seg til N-enden av p53 for å hemme dens transkripsjonsaktivitet12,14,15. Mdm2 fremmer polyubiquitination og proteasomal nedbrytning av p53 for å kontrollere stabiliteten og induserer monoubiquitination av p53 for å lette sin kjernefysiske eksport12,14,15,16. Her brukes Mdm2-mediert p53 ubiquitination som et eksempel for å introdusere en metode for rensing av ubiquitinerte proteiner fra pattedyrceller i detalj. Regulatorene som påvirker ubiquitinasjonsstatusen til målproteiner, kan identifiseres ved hjelp av denne in vivo ubiquitination-analysen når de overuttrykkes eller slås ned / slås ut i pattedyrceller. I tillegg kan ubiquitinerte proteiner brukes som substrater for in vitro deubiquitination assay. En høy gjennomstrømningsscreening kan utføres for å identifisere spesifikke DUBer for målproteiner ved å inkubere ubiquitinerte substrater med individuelle DUBs. Ubiquitinated proteiner kan fungere som et stillas for å rekruttere nedstrøms signalproteiner i celler. Et ubiquitinated målproteinkompleks kan renses ved sekvensiell immunprecipitation under innfødte renseforhold og identifiseres ved massespektrometri. Den nåværende protokollen kan i stor grad brukes til å undersøke de cellulære proteiner regulert av ubiquitination.
Flere metoder er etablert for å rense ubiquitinerte proteiner, som inkluderer bruk av affinitetsmerkede ubiquitin, ubiquitinantistoffer, ubiquitinbindende proteiner og isolerte ubiquitinbindende domener (UBDs)17. Her gir vi en protokoll som bruker affinitetsmerket ubiquitin som mediator for å rense ubiquitinerte proteiner i pattedyrceller. Bruken av poly-His-merket ubiquitin gir fordeler i forhold til de andre metodene. Ubiquitinerte proteiner renses i nærvær av sterke denaturanter, noe som reduserer ikke-spesifikk binding til nikkelladet harpiks ved å linearisere cellulære proteiner og forstyrre protein-protein-interaksjoner. I motsetning til dette kan bruk av ubiquitinantistoffer, ubiquitinbindende proteiner og isolerte UBDs som mediatorer ikke effektivt utelukke bindende partnere fra målprotein fordi rensing må utføres under mindre strenge forhold. Videre kan rensing også føre til økt binding av ikke-relaterte proteiner ved bruk av disse mediatorene. I tillegg er det en bindende tilbøyelighet for ulike ubiquitinkoblingstyper samt mono- og poly-ubiquitinering av ubiquitinbindende proteiner eller isolerte UBDs17. Bruken av poly-His-merket ubiquitin bidrar til å trekke ned alle cellulære ubiquitinerte proteiner. Alternativt kan bruk av kommersielt tilgjengelige anti-flagg eller anti-HA antistoffkonjugert agarose gjøre det lettere å immunsupplere storskala Flag- eller HA-merkede målproteiner under ikke-naturlige forhold. Et annet rensetrinn, for eksempel ved nikkelladet harpiks rettet mot poly-His-merket ubiquitin, kan brukes til å skaffe ubiquitinated målproteiner med høy renhet for nedstrøms eksperimenter. Spesielt kan en epitop merking rensing strategi tilpasses når et spesifikt antistoff ikke kan erverves for å immunoprecipitate målproteiner effektivt. Endelig beholder rensing av ubiquitinerte proteiner i pattedyrceller, sammenlignet med rensing in vitro, ubiquitin-koblingsmodusen for målproteiner under mer fysiologiske forhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ubiquitination spiller en kritisk rolle i nesten alle fysiologiske og patologiske cellulære prosesser2. I de senere år har det blitt gjort store fremskritt i å forstå den molekylære rollen til ubiquitin i signalveier og hvordan endringer i ubiquitin-systemet fører til forskjelligemenneskelige sykdommer. Rensingen av ubiquitinerte proteiner bidrar til å gi innsikt i de nøyaktige rollene til ubiquitination i disse prosessene. Blandingene av ubiquitin-konjugerte protei…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Natural Science Foundation of China (81972624) til D.L.
Materials
| β-mercaptoethanol | Sangon Biotech | M6250 | |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE healthcare | NA931 | Secondary antibdoy |
| Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE healthcare | NA935 | Secondary antibdoy |
| Anti-Flag M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | FLAG/M2 beads |
| Anti-GFP monocolonal antibody | Santa cruz | sc-9996 | Primary antibody |
| Anti-HA High Affinity | Roche | 11867423001 | Primary antibody |
| Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) | Santa cruz | sc-965 | Primary antibody |
| Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) | Santa cruz | sc-126 | Primary antibody |
| EDTA | Sigma-Alddich | E5134 | solvent |
| Fetal Bovine Serum | VivaCell | C04001-500 | FBS |
| FLAG Peptide | Sigma-Alddich | F3290 | Prepare elution buffer |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | supplement |
| Guanidine-HCI | Sangon Biotech | A100287-0500 | solvent |
| H1299 | Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | ||
| Image Lab | Bio-rad | software | |
| Immidazole | Sangon Biotech | A500529-0100 | solvent |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Lipofectamine 2000 reagents | Invitrogen | 11668019 | Transfection reagent |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | solvent |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | solvent |
| NaF | Sigma-Alddich | 201154 | solvent |
| NaH2PO4 | Sangon Biotech | A501726-0500 | solvent |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30230 | nickel-charged resin |
| Nitrocellulose Blotting membrane | GE healthcare | 10600002 | 0.45 µm pore size |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Transfection medium |
| PBS | Corning | 21-040-cv | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sangon Biotech | E607011-0100 | antibiotic |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RPMI 1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | medium |
| Sarkosyl | Sigma-Alddich | L5777 | solvent |
| SDS Loading Buffer | Beyotime | P0015L | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | supplement |
| Tris-base | Sangon Biotech | A501492-0005 | solvent |
| Tris-HCI | Sangon Biotech | A610103-0250 | solvent |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A110694-0500 | reagent |
| Tween-20 | Sangon Biotech | A100777-0500 | supplement |
| Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System | Bio-rad | ChemiDoc XRS+ | |
| Urea | Sangon Biotech | A510907-0500 | solvent |
Riferimenti
- Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
- Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. Ubiquitin-binding domains – from structures to functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).
- Oh, E., Akopian, D., Rape, M. Principles of ubiquitin-dependent signaling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).
- Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).
- Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).
- Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. Surfing the p53 network. Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).
- Boutelle, A. M., Attardi, L. D. p53 and Tumor suppression: It takes a network. Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).
- Levine, A. J. p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the light: The growing complexity of p53. Cell. 137 (3), 413-431 (2009).
- Brooks, C. L., Gu, W. p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond. Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).
- Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian. Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).
- Dobbelstein, M., Levine, A. J. Mdm2: Open questions. Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).
- Kulikov, R., et al. Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).
- Li, M., et al. Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2. Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).
- Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. Methods for the purification of ubiquitinated proteins. Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).
- Green, M., Sambrook, J. . Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, 28 (2012).
