Summary
細胞内ボルバキアの検出には4つの方法を用い、抗生物質を用いた天然型ボルバキア感染症を治したヒトスジシマカ由来Aa23とAa23-Tのボルバキア感染の検出精度を向上させ、互いに補完し合いました。
Abstract
母体に抱かれている内共生生物として、ウォルバキアは昆虫集団の大部分に感染しています。研究は最近、ボルバキアトランスフェクトされた蚊を用いたRNAウイルス感染の成功した調節を報告している。ウイルスを制御するための重要な戦略には、細胞質非適合性を介した宿主再生の操作、免疫プライミングおよび宿主由来資源の競合によるウイルス転写産物の阻害が含まれる。しかし、ウイルス感染に対するボルバキアトランスフェクト蚊の応答の根底にあるメカニズムはほとんど理解されていない。この論文は、Aedes albopictus(双翅目:Culicidae)Aa23細胞における核酸およびタンパク質レベルでのボルバキア感染のin vitro同定のためのプロトコルを提示し、Wolbachiaとその昆虫ベクターとの間の相互作用の理解を深める。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、定量PCR、ウェスタンブロット、および免疫学的分析方法の併用により、単一の方法の使用よりも正確なWolbachia感染細胞の検出のための標準的な形態学的プロトコルが記載されている。このアプローチは、他の昆虫分類群におけるボルバキア感染の検出にも適用され得る。
Introduction
アジアおよび世界の他の地域におけるデング熱ウイルス(DENV)の重要なベクターであるアジアのトラ蚊Aedes albopictus(Skuse)(双翅目:Culicidae)1は、生殖細胞系および体細胞組織全体に分布する2種類の細胞内細菌、Wolbachia(wAlbAおよびwAlbB)の天然宿主である2,3。A. albopictus胚に由来するAa23細胞株は、少なくとも2つの形態学的細胞型からなり、いずれも感染4を支持し、抗生物質(Aa23−T)を用いて天然のボルバキア感染を治癒させることができる。Aa23がwAlbBのみを保持することを考えると、宿主-内共生相互作用4,5,6の研究に有用なモデルである。
Wolbachiaは母体に伝染し、昆虫種の推定65%、8,9、蚊種の28%に感染します10。それは様々な組織に感染し、宿主と密接な共生関係を形成し、通常は宿主生殖器系を操作することによって細胞質不適合(CI)11および集団置換を誘導する12、13。これらの宿主応答は、ショウジョウバエのシミュラン14の自然集団および実験室ケージおよび野外試験15のA. aegyptiにおいて観察されている。Wolbachiaによって惹起される重要な非生殖操作は、DENV、チクングニアウイルス(CHIKV)、および西ナイルウイルス(WNV)16、17を含む様々な病原体に対する宿主耐性を誘導することであり、それは共生生物の改良された自然免疫系18、19、必須宿主資源のためのボルバキアとウイルスとの間の競合20、および宿主ウイルス防御経路21の操作によって媒介され得る.
このプロトコルは、ボルバキア誘導宿主抗ウイルス応答のこれらの根底にあるメカニズムを研究するために開発された。これは、Aa23細胞の細胞内ボルバキア感染の検出の4つの方法を使用する。これらの方法は、他の宿主種の細胞内ボルバキア感染の研究のための強力な理論的基礎を提供する。最初の方法であるPCR(従来のクローニング手順を使用せずにDNAの特定の領域を酵素的に増幅することを可能にする強力な技術)を使用して、ボルバキアDNAを検出し、ボルバキア感染の有無を決定しました22。第2の方法は、定量PCR(qPCR)を使用してボルバキアDNAコピー密度を測定し、PCR23前の鋳型の量に正比例する各PCRサイクル中に生成された産物の信頼性の高い検出および測定を行う。第3の方法は、電気泳動の高い分離力、抗体の特異性、発色酵素反応の感度を組み合わせることにより、複雑な混合物中の特定のタンパク質を検出するための最も強力なツールの1つであるウェスタンブロットを使用して、細胞内Wolbachiaタンパク質の存在を検出します。最後の方法は、免疫学、生化学、顕微鏡を組み合わせた免疫蛍光アッセイ(IFA)で、抗原抗体反応によってボルバキア表面タンパク質(wsp)を検出し、ウォルバキアの細胞取り込みを確認し、その細胞局在を決定します。
この論文では、細胞内のボルバキアの存在を検証するために上記の4つの方法を説明し、外因性のボルバキアが正常にトランスフェクトされ、細胞内のボルバキアがクリアされたかどうかを検出するために使用できます。Wolbachiaが細胞に存在するかどうかを決定した後、ゲノミクス、プロテオミクス、またはメタボロミクスを含む様々な異なる分析を行うことができる。このプロトコルは、Aa23細胞を介したボルバキアの検出を実証するが、他の細胞でも使用することができる。
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Protocol
1. 材料と試薬
- 細胞培養には発熱物質を含まない溶液および培地を使用してください( 材料表を参照)。
- 超純水を使用してすべての溶液を調製します。
- 細胞培養用のウシ胎児血清(FBS)を選択する際には、ロットチェックプロセスに従って注意してください。
注: FBS ロットは定期的に変更されるため、このプロトコルで関連するカタログとロット番号を明記することは不可能です。 - A.アルボピクタス卵由来のAa23細胞株を選択し、ボルバキアフリーAa23-Tに対応する。
2. 細胞培養
- 25 cm2 細胞培養フラスコを 4 mL のシュナイダー培地と 10% FBS で準備します。
- フラスコを5%CO2雰囲気下で28°Cで5〜7日間インキュベートする7,24。
- フラスコ内の染色されていないAa23およびAa23-T細胞を、倍率100倍の光学顕微鏡を用いて観察する(図1)。
3. DNA抽出
- フラスコあたり70〜80%コンフルエントになるまで細胞を5〜7日間培養する(ステップ2)。1mLの再懸濁培養液から手動ピペッティングで細胞を回収し、微量遠心分離機で100×gで5分間遠心分離した。
- 吸引により上清を除去し、得られた細胞ペレットを-20°Cで保存する。
- ペレットを0.40 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁し、溶液50 μLを微量遠心チューブに入れ、5 μLのプロテイナーゼK(20 mg/mL)を加え、55°Cで1時間インキュベートします。最後に、これらのチューブを99°Cで15分間加熱して粗DNAを取得し、-20°Cで保存します。
4. ボルバキア 核酸の検出
- PCR解析
- 8 μL の ddH 2O、10 μL の Taq ポリメラーゼ (材料表を参照)、1 μL の DNA テンプレート (ステップ 3 から)、0.5 μL のフォワードプライマーおよびリバースプライマー (10 μM) を含む20μL の全反応量で PCR を実行します: wsp81F (5' TGG TCC AAT AAG TGATGA AGAAAC 3') および WSP691R (5' AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA 3')25、 それぞれ。
- 以下のPCR条件を使用する:95°Cで5分間の初期変性、続いて94°Cでの変性の35サイクル、55°Cでのアニーリング、および72°Cでの伸長;その後、72°Cで7分間最終延長した。
- ゲルイメージャーを使用して、1% アガロースゲル (PBS 中の 1% w/v アガロース) 上の DNA を検出します。
- qPCR 解析
- wspプライマー183 F(5'AAGGAACCGAAGTTCATG 3')およびQBrev R(5'AGTTGAGAGTAAAGTCCC 3')22を用いて抽出DNAから3つの生物学的複製(n=6)についてWolbachiaゲノムコピーを分析し、リボソームタンパク質S6(RPS6)フォワードプライマーおよびリバースプライマー(5'GAAGTTGAACGTATCGTTTC 3'および5'GAGATGGTCAGCGGTGTTTT 3')3で正規化した。
- wAlbB および RPS6 の標準曲線を生成します。
- wspおよびrps6遺伝子断片を含む組換えプラスミド(PCR産物の効率的なクローニング(TAクローニング)のための特別なベクター)PMD-18T(TAクローニング)からDNAを抽出し、プラスミドDNA濃度を測定します(資料表参照)。
- Eq(1)を用いてプラスミドDNA濃度をコピー数濃度に変換する。
プラスミドコピー数=
(1) - プラスミドコピー数を101から108まで超純水で希釈し、濃度勾配ごとに3回の反復を設定した。
- TB GreenとリアルタイムPCRシステム( 材料表参照)を使用してqPCR増幅を行い、各反応の結果を記録します。Ct値を使用して標準曲線を作成します。7 μL の ddH2 O、10.4 μL の TB Green ( 材料表を参照)、1 μL の DNA テンプレート (ステップ 3 で提供)、および 0.8 μL のフォワードプライマーとリバースプライマー (10 μM) を含む 20 μL の総反応量で DNA を分析します。以下の反応条件を使用する:95°Cで5分間の初期変性、続いて95°Cで10秒間の変性の40サイクル、および60°Cで35秒間のアニーリングを行う。
- 確立された標準曲線に従って細胞内のWSPおよびRPS6遺伝子のコピー数を計算し、wsp/RPS6のコピー数によるボルバキア相対密度を計算する。独立サンプルの t 検定を使用してデータを分析します。
- ボルバキアタンパク質のウェスタンブロット解析
- タンパク質抽出
- 6ウェルプレート(工程2から)から2×107個の Aa23およびAa23-T細胞を微量遠心管に回収し、PBSで3回洗浄した後、100× g で4°Cで5分間遠心分離した。
- RIPA溶解緩衝液(50 mM Tris(pH 7.4)、150 mM NaCl、1%Triton X-100、1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム[SDS]、2 mM ピロリン酸ナトリウム、25 mM β-グリセロリン酸、1 mM EDTA、1 mMNa3VO4、0.5 μg/mL Leupeptin)およびPMSF(終濃度1 mM)を用いて1 mLの溶解物を調製した。
- 細胞ペレットに200μLの溶解バッファーを加え、氷上で30分間維持する。溶解液を12,000 × g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を除去する。
- ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキット( 材料表を参照)を用いて上清のwsp濃度を製造業者の指示に従ってアッセイする。
- 等量のタンパク質を15%SDS-PAGEゲルに負荷する[10%蒸留水;50%(30%アクリルビス(29:1)、38%1Mトリス、pH8.8;1%(10%SDS)、1%(10%過硫酸アンモニウム)、0.04%TEMED]。
- タンパク質をニトロセルロース膜に移し、室温で2時間26,27の間、5%の脱脂粉乳で膜を遮断し、次いでTBST(1LのTBS中のTween 20の1mL)で膜を3回洗浄する(材料表を参照)。
- 一次抗体を5%スキムミルク(1:12,000)で希釈することによって調製した100μLの抗wspポリクローナル抗体(社内で調製、 補足ファイルを参照)と共に膜を4°Cで一晩インキュベートする。
- 一次抗体をTBSTで3回洗浄する。
- 100 μLの西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体中の膜をシェーカー上で室温で1時間インキュベートする。
- TBSTで膜を3回洗浄し、化学発光検出キットにA液20 μL(HRP基質ルミノール試薬)20 μLとB液20 μL(HRP基質過酸化物試薬)を1:1の比率で混合します。同時に膜全体を発光溶液に浸漬し、多機能イメージングシステムを用いて信号を観察する。
- タンパク質抽出
- ボルバキアタンパク質の免疫蛍光局在化
- 5×105Aa23およびAa23-T細胞を、底部に厚さ0.17mmのレーザー共焦点シャーレ上で28°Cで、5%CO2雰囲気下で3〜4日間インキュベートする7,24。細胞が60%〜70%のコンフルエントになるまで待ち、PBSで細胞を3回洗浄します。
- 細胞を 4 °C で 20 分間、PBS 中の 4% (w/v) パラホルムアルデヒド 1 mL に固定します。
- PBST (PBS 中の 0.2% v/v Triton X-100) を使用して固定細胞を 5 分間洗浄し、PBS で細胞をもう一度 2 回洗浄します。
- スライドをPBS中の3%(w/v)ウシ血清アルブミン1mL中、37°Cで1時間インキュベートする。
- スライドを100 μLのマウス抗wspポリクローナル抗体(自社で調製)とマウス血清(PBSで1:1,000希釈)をウェットボックス(湿度を維持し、水分の蒸発を防ぐことができます)で4°Cで一晩インキュベートします。
- 濡れた箱からスライドを取り出し、室温に戻します。PBSで3回洗い流し、PBSを取り除きます。
メモ: 手順 4.4.7 以降では、すべての操作を光から保護する必要があります。 - スライドを100 μLのAlexa Fluor 488結合ヤギ抗マウス抗体(PBSで1:2,000希釈)とともに37°Cで30分間インキュベートします。
- サンプルスライドを50 μLの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(PBSで10 μg/mLに希釈したDAPI、DNAに強く結合する)と共に37°Cで5分間インキュベートし、PBSで3回洗浄します。
- 免疫染色を共焦点顕微鏡で観察する。
- 電源とレーザーをオンにします。
- 顕微鏡のノーマルランプと水銀ランプをオンにします。
- システムを起動し、操作ソフトウェアを実行します。サンプルスライドにスギ油を一滴置き、サンプルスライドを顕微鏡ステージの上に置き、ステージを適切な位置に動かします。
- ソフトウェアの水銀灯観察ボタンをクリックし、 水銀灯 シャッターを開き、倒立顕微鏡で試料を観察して焦点を合わせます。
- 手動コントロールパネルを使用して緑色と青色の蛍光を選択し、100倍の倍率で蛍光写真を撮影します。
- 水銀灯観測ボタンをオフにして、画像の取得を開始します。
- 良好な画質を確保するには、スキャンサイズ(512ピクセル x 512ピクセル)でプレススキャンします。スキャンサイズを調整して、鮮明な画像(1,024ピクセル x 1,024ピクセル)を取得します。
- バックグラウンドノイズが高すぎる場合は、ノイズリダクションを実行します。
- スキャンを停止し、画像を保存します。
- 水銀灯とレーザーをオフにします。
- 75%のアルコールで目標を拭き取り、目標を最低位置に下げます。
- シャッターと顕微鏡の電源を切ります。
- 楽器が冷えたら、ダストカバーで覆います。
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Representative Results
ボルバキアが検出される前に、Aa23およびAa23-T細胞を光学顕微鏡下で観察し、2つの細胞株間の形態学的差異を決定した。Aa23およびAa23-T細胞は、少なくとも2つの細胞形態を有するが、2つの細胞型の間に明らかな形態学的差異はない(図1)。ここで、Aa23細胞をモデル系として用い、4つの方法を用いてボルバキア感染を検出した。診断用プライマー81F/691Rを用いたWolbachiawsp遺伝子の陽性増幅は、Aa23細胞(レーン1および2)では可能であったが、Aa23-T細胞(レーン3および4)では不可能であった(図2A)。qPCRを用いた細胞株のボルバキア密度の分析では、Aa23細胞ではwsp/rps6比が2.4であったが、Aa23-T細胞ではボルバキアは示されなかった(図2B)。タンパク質抽出物のウェスタンブロット分析では、Aa23については強いwspシグナルが示され、Aa23-Tについてはシグナルが示されなかったが(図3A)、間接免疫蛍光アッセイではAa23細胞(緑色)ではwspタンパク質(図3B)が検出され、Aa23-T細胞ではDAPIで染色されたDNAのみ(青色)が検出されました。
図1:染色されていないAa23およびAa23-T細胞の光学顕微鏡。 不均一な形態は、矢印によって示されるように、両方の細胞株に複数の細胞型が存在することを示す。スケール バー = 20 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:核酸レベルでの細胞におけるボルバキア感染の検出。 (a)1%アガロースゲル上で分解されたAa23およびAa23-T細胞のPCR分析。診断用プライマー81F/691Rを用いたWolbachiawsp遺伝子の陽性PCR増幅は、Aa23細胞(レーン1および2)では観察されたが、Aa23-T細胞(レーン3および4)では観察されなかった。(b)Aa23およびAa23-T細胞のボルバキアwspコピー密度。密度はAa23細胞でより大きく、Aa23-T細胞では検出できなかった。コピー数は、ヒトスジシマカのアルボピクトゥスrps6を用いて正規化した。データはSEM±平均であり、n = 6である。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:タンパク質レベルでの細胞における ボルバキア 感染の検出。 (a)Aa23細胞におけるwsp抗体によるイムノブロッティング(レーン1)を、25kDa付近に明らかなバンドを有すること;Aa23−T(レーン2)を、テトラサイクリンで処理した。(b) ボルバキア の局在を示す細胞の免疫蛍光標識(緑色);細胞をポリクローナル抗wsp抗体(Wolbachia)でプローブし、続いてヤギ抗マウス(緑色)Alexa Fluor 488結合抗体、および核(青色)をDAPIで染色した。抗wsp抗体が精製されなかったため、マウス血清をネガティブコントロールとして使用し、ポリクローナル抗体はマウス由来であった。 ボルバキア に感染したAa23細胞(Aa23-抗wsp)を白矢印で示す。スケールバー = 10 μm。略語:DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;M = マーカー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル:プラスミド生成および抗wsp抗体調製。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
細胞内ボルバキア感染の検出は、ボルバキアと宿主の相互作用の研究および新規株による細胞のトランスフェクションの成功の確認に不可欠である。このプロトコールでは、核酸およびタンパク質レベルで細胞内Wolbachia感染を首尾よく検出するために4つの方法が使用された。これら4つの実験方法は、細胞のボルバキア感染の検出精度を裏付け、改善した。
PCRは、細胞のボルバキア感染の存在を核酸レベルで検出するために使用した。しかしながら、感染レベル28、29を定量化しないので、qPCRは、DNAコピー密度28、30を定量するために使用した。PCR法の精度は増幅効率の低さや偽陽性に左右される可能性があるため、特にqPCR検出では、変性を防ぐために試薬やテンプレートを氷上に置き、標準的な方法に従って操作を行う必要があるため、DNAの品質を確保することが重要です。低い増幅効率は、反応系における試薬分解、不十分なテンプレート量、および/または延長されたプライマー断片28の過剰な長さによって引き起こされる傾向がある。偽陽性は、通常、試薬およびテンプレートの汚染、高レベルのプライマー濃度、および/または二量体およびヘアピンプライマー構造によって引き起こされる。したがって、試薬が高品質であること、文献に基づいてプライマーが最適化されていること、およびプライマー設計に使用される適切なソフトウェアであることを確認することが重要です。
上記の2つの方法は、細胞内 ボルバキア 感染を核酸レベルで検出する;他の2つは、細胞内 ボルバキア 感染をタンパク質レベルで検出する。ウェスタンブロッティングを用いて、Aa23およびAa23-T細胞の細胞内 ボルバキア 感染をタンパク質レベルで決定した。この方法に関連する問題は、サンプル調製、抗体インキュベーション、および検出に関連する31。ウェスタンブロッティング検出プロセスにおける重要なステップには、新鮮で完全に溶解されたサンプルと正しい二次抗体の使用が含まれ、これらは1:12,000の希釈で指示に従って検証および希釈する必要があります。実験要件によれば、この方法は、他の免疫化方法と組み合わせることもできる。したがって、免疫蛍光は、 ボルバキア31 による細胞内感染を局在化するために使用されました 、これはPCR、qPCR、またはウェスタンブロット分析を使用して直接検出されないためです。免疫蛍光について注意すべき重要なステップがいくつかあります。まず、細胞サンプルの最適な品質を確保し、汚染を回避します。染色される可能性のある黒い接着剤のバグによる細胞の汚染は、結果の解釈に深刻な影響を与えるでしょう。第2に、レーザー共焦点ディッシュ中の細胞密度は〜60〜70%でなければならない。最後に、サンプルインキュベーション後にPBSで洗浄することは、明確な蛍光画像を得るために重要です。
核酸およびタンパク質レベルで細胞内 Wolbachia 感染を検出するために相対的および絶対的な定量的および視覚的方法を使用して、このプロトコルは、単一の方法の使用よりも包括的かつ正確である。さらに、二重標準曲線(wspおよびRPS6の場合)を構築すると、PCRシステムに対する要件の厳格さが低くなり、増幅効率と最終データ処理における実験エラーの部分的な排除がもたらされ、実験作業が大幅に削減されます。ただし、このプロトコルにはいくつかの制限がありました。第一に、抗wsp抗体は自社で調製されており、まだ商品化されていない。第二に、ウェスタンブロッティングにおいて未精製のポリクローナル抗wsp抗体のために余分なバンドは存在せず、抗体純度を示したが、マウス血清を用いた陰性対照群も緑色の蛍光バックグラウンドを有し、結果の解釈に役立たなかった。ウェスタンブロット法および免疫蛍光法の精度は、精製抗体または正確な蛍光プローブの使用を確実にすることによって改善され得るが、経験的データのさらなる研究および分析が必要である。要約すると、 Wolbachia の以前の研究で使用された4つの方法を使用して、Aa23細胞における Wolbachia感染の検出のためのより包括的かつ正確なプロトコルが報告されている。ここで説明するプロトコルは、他のタイプの細胞および組織における ボルバキア の検出に適用可能である。
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Disclosures
著者は、宣言する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
ミネソタ大学のXin-Ru Wang博士の洞察に満ちた提案と指導に感謝します。この研究は、中国国家自然科学財団(No.81760374)からの助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| inSituX platform | |||
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
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