Summary
لدراسة كيفية تعامل الأمعاء الدقيقة مع الجسيمات ذات الأحجام المختلفة ، قمنا بتعديل طريقة راسخة في الجسم الحي لتحديد عبور الأمعاء الدقيقة.
Abstract
حركة الجهاز الهضمي (GI) أمر بالغ الأهمية لعملية الهضم والامتصاص الطبيعية. في الأمعاء الصغيرة ، التي تمتص العناصر الغذائية ، تعمل الحركة على تحسين الهضم والامتصاص. لهذا السبب ، تشمل بعض أنماط الحركة في الأمعاء الدقيقة التجزئة لخلط المحتويات المضيئة والتمعج لدفعها. الخصائص الفيزيائية للمحتويات المضيئة تعدل أنماط حركة الأمعاء الدقيقة. التحفيز الميكانيكي للدوائر الحسية الميكانيكية GI عن طريق عبور محتويات اللمعان وحركية الأمعاء الكامنة تبدأ وتعدل أنماط محركات GI المعقدة. ومع ذلك ، فإن الآليات الحسية الميكانيكية التي تقود هذه العملية لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. ويرجع ذلك في المقام الأول إلى نقص الأدوات اللازمة لتشريح كيفية تعامل الأمعاء الدقيقة مع المواد ذات الخصائص الفيزيائية المختلفة. لدراسة كيفية تعامل الأمعاء الدقيقة مع الجسيمات ذات الأحجام المختلفة ، قمنا بتعديل طريقة راسخة في الجسم الحي لتحديد عبور الأمعاء الدقيقة. نحن غافارد الفئران الحية مع السائل الفلورسنت أو حبات الفلورسنت الصغيرة. بعد 30 دقيقة ، نقوم بتشريح الأمعاء لتصوير توزيع محتويات الفلورسنت عبر كامل الجهاز الهضمي. بالإضافة إلى القياسات عالية الدقة للمركز الهندسي ، نستخدم التجليد متغير الحجم والتحليل الطيفي لتحديد كيفية تأثير المواد المختلفة على عبور الأمعاء الدقيقة. لقد استكشفنا كيف تؤثر آلية "لمس الأمعاء" المكتشفة مؤخرا على حركة الأمعاء الدقيقة باستخدام هذا النهج.
Introduction
الجهاز الهضمي البشري (GI) هو نظام عضو طوله عدة أقدام ، يتم تقريبه تقريبا كأنبوب بأبعاد وخصائص فيزيائية مختلفة1. مع تحرك المحتويات عبر طولها ، تتمثل الوظيفة الأساسية للجهاز الهضمي في امتصاص المواد المهمة للحياة. الأمعاء الدقيقة مسؤولة بشكل خاص عن امتصاص المغذيات. يتم تنظيم عبور الأمعاء الدقيقة بإحكام لتتناسب مع وظائف الهضم والامتصاص ، مما يؤدي إلى أنماط حركية مختلفة. وصف بايليس وستارلينغ "قانون الأمعاء"2 في عام 1899 ، مما يدل على برنامج الدفع الانقباضي في الأمعاء المعروف اليوم باسم المنعكس التمعجي. الجزء القريب من عقود البلعة الغذائية لدفعها إلى الأمام ، والجزء البعيد يرتاح لاستلامها. من الناحية النظرية، يمكن أن يكون هذا النمط وحده كافيا لنقل المواد عن طريق الإجهاض، ولكن أكثر من قرن من الأبحاث رسمت صورة أكثر تعقيدا للنشاط الانقباضي في الجهاز الهضمي. يتم التعرف على ثلاث فترات حركية الأمعاء الدقيقة في البشر: المجمع الحركي المهاجر (MMC) ، وفترة الصيام ، وفترة ما بعد الأكل3. تم الإبلاغ عن نفس الأنماط في الفئران 4,5. MMC هو نمط محرك دوري محفوظ عبر معظم الثدييات 6,7. يحتوي MMC على نمط مميز من أربع مراحل يعمل كعلامة سريرية مفيدة في اضطرابات الجهاز الهضمي الوظيفية7. والمراحل الأربع، حسب ترتيب حدوثها، هي: (أولا) السكون، و (ثانيا) الانقباضات غير المنتظمة ذات السعة المنخفضة، و (ثالثا) الانقباضات المنتظمة ذات السعة العالية، و (رابعا) فترة الانخفاض في النشاط7. يمثل MMC النمط الحركي الرئيسي لفترة الصيام3. MMCs من فترة الصيام مسح محتويات الأمعاء الدقيقة استعدادا للوجبة التالية.
يتم تحسين الأنماط الحركية لفترة ما بعد الأكل للوظائف الهضمية والاستيعابية3. بغض النظر عن تكوين السعرات الحرارية ، يكون العبور الأولي سريعا على طول الأمعاء الدقيقة ، وتنتشر المحتويات على طول الأمعاء ، ثم يتباطأ العبور لاحقا8. يتم تحسين الامتصاص عن طريق زيادة مساحة سطح التلامس وإبطائه لزيادة وقت الإقامة. بمجرد أن تكون العناصر الغذائية داخل التجويف ، يتكون النمط السائد من تقلصات غير منسقة قريبة (<2 سم) (تقلصات مجزأة) ، مع عدد قليل من الانقباضات ذات السعة الكبيرة المتراكبة التي تمتد على طول الأمعاء الدقيقة بالكامل (الانقباضات التمعجية)9. تخلط تقلصات التجزئة المحتويات داخل اللمعان في مكانها. تدفع الانقباضات التمعجية الكبيرة العرضية المحتويات نحو القولون.
يعتمد توقيت هذا الانتقال مرة أخرى إلى MMCs على حجم الطعام وتكوين السعرات الحرارية10. وبالتالي ، فإن عينات الأمعاء الدقيقة إشارات مضيئة لتنظيم وقت الانتقال بين فترات الحركة. الإشارات الميكانيكية ، مثل الخواص الفيزيائية للمحتويات المضيئة11 ، وحجم اللمعان ، وتوتر الجدار ، تشرك خلايا المستقبلات الميكانيكية في جدار GI12،13،14،15،16. في الواقع ، تؤدي زيادة المكون الصلب للوجبة إلى زيادة في عبور الأمعاء الدقيقة17. نحن نتوقع أن الخصائص الفيزيائية ، مثل الحالة السائلة أو الصلبة للمحتويات داخل اللمعان ، يجب أن تتفاعل مع مستقبلات ميكانيكية مختلفة بسبب القوى المختلفة التي تولدها على جدار GI18.
المعيار الذهبي لقياس عبور GI في الجسم الحي في البشر ، كما هو الحال في الفئران ، هو استخدام المقتفيات المشعة التي تقاس بالتصوير الومضاني عند خروجها من المعدة أو عبورها على طول القولون19,20. في الثدييات ، حلقات الأمعاء الدقيقة بطرق لا يمكن التنبؤ بها مما يجعل من الصعب تصوير الأمعاء الدقيقة في الجسم الحي بشكل موثوق ، ولكن يتم إحراز تقدم21. علاوة على ذلك ، هناك حاليا نقص في الأدوات اللازمة لتحديد كيفية تعامل الأمعاء الدقيقة مع الجسيمات ذات الخصائص والأحجام المختلفة. كانت نقطة البداية هنا تقنية قياسية ذهبية توحد دراسة عبور الأمعاء الدقيقة 22،23،24 ووظيفة الحاجز22. وهو يتألف من الفئران التي تحتوي على مادة فلورسنت ، في انتظار حركية الجهاز الهضمي لنقل المادة ، واستئصال الجهاز الهضمي ، وتقسيمه إلى عدة أقسام من المعدة إلى القولون ، والتقسيم ، وتجانس المحتويات داخل اللمعان لتحديد كمية التألق. لقد أجرينا تحسينين. أولا ، قمنا بتغيير تركيبة محتويات gavaged لتشمل الخرز المجهري الفلورسنت لتحديد كيفية توزيع الأمعاء الدقيقة للجسيمات الفيزيائية. ثانيا، قمنا بتحسين الدقة المكانية عن طريق تصوير الجهاز الهضمي بأكمله من المعدة إلى القولون خارج الجسم الحي واستخدمنا الربط متغير الحجم لتوحيد تحليلنا عبر الحيوانات. نفترض أن هذا يكشف عن رؤى جديدة في توازن الانقباضات الدافعة مقابل الانقباضات المجزأة خلال مرحلة ما بعد الأكل
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في Mayo Clinic.
1. الإعداد
- فئران سريعة تتراوح أعمارها بين 8 و 10 أسابيع لمدة 4 ساعات. تزويد الفئران بإمكانية الوصول إلى الماء.
ملاحظة: نحن نستخدم الفئران الذكور من النوع البري C57BL/6J لجميع التجارب المعروضة هنا، ولكن يمكن إجراؤها على الفئران من أي سلالة وجنس ونمط وراثي. - قم بتبريد 15 مل من الماء المقطر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل في ثلاجة 4 درجات مئوية.
- سخني 15 مل أخرى من الماء المقطر في كوب باستخدام صفيحة ساخنة مع قضيب تحريك مغناطيسي إلى حوالي 80-90 درجة مئوية.
- قياس 0.5٪ ميثيل سليلوز لمجموع 30 مل (0.15 غرام).
- أضف ميثيل السليلوز بلطف إلى 15 مل من الماء الساخن حتى لا يتكتل. سيكون محلول ميثيل سليلوز غائما خلال هذه العملية.
- بمجرد إذابته ، قم بإزالة الكأس من الصفيحة الساخنة وأضف 15 مل من الماء المبرد إلى الكأس الساخن.
- ضعه في ثلاجة 4 درجات مئوية حتى يصبح المحلول صافيا ، حوالي 15-20 دقيقة.
- عندما تكون واضحة ، تزن 3 ملغ من الرودامين إيزوثيوسيانات (RITC) - ديكستران لكل 5 مل من محلول ميثيل سليلوز 0.5 ٪ وتخلط للمزج. هذه هي الحالة السائلة في قسم النتائج التمثيلية .
- بدلا من ذلك ، تزن 25 ملغ من الميكروسفير البولي إيثيلين الفلورسنت وتخلط مع 200 ميكرولتر من محلول ميثيل سليلوز حتى يتم دمجها جيدا. يتم ضمان الدمج الشامل للميكروسفير بواسطة دوامة قبل gavage. يجب على المجرب تصور التوزيع المتجانس للميكروسفير المعلق في الخليط.
- نظرا لأن محلول RITC-dextran حساس للضوء ، قم بتبريد المحلول. تحضير محلول RITC-dextran وخليط microshpere مقدما واستخدامها في غضون 2 أشهر. أعد تعليق خليط المجهر قبل الاستخدام.
ملاحظة: تستخدم الميكروسفير ذات الأحجام المختلفة لدراسة التعامل المعدي المعوي مع المواد المختلفة. في قسم النتائج التمثيلية ، نوضح نتائج استخدام الميكروسفير الصغير (القطر: 75-90 ميكرومتر) والأكبر (القطر: 180-212 ميكرومتر).
2. غافاج المحتوى داخل اللمعان
- قم بإعداد الجافاج عن طريق توصيل أنبوب تغذية 18 Ga × 50 مم بحقنة 1 مل ورسم 200 ميكرولتر من محلول RITC أو محلول ميكروسفير.
- كبح جماح الحيوان الصائم يدويا باستخدام تقنية ضبط النفس بيد واحدة25. ارجع إلى معلومات المؤسسة حول تقنيات تقييد الفئران المناسبة.
- أدخل أنبوب التغذية بلطف عبر الفم والمريء للفأر حتى يدخل المعدة.
ملاحظة: تعد خطوة gavage أمرا بالغ الأهمية لنجاح التجربة. يتطلب الأمر أيدي ذات خبرة يمكنها إدخال الأنبوب باستمرار بنفس المسافة تقريبا في كل ماوس. يجب توحيد هذه الخطوة من قبل المجربين الذين ينفذون البروتوكول. يجب على نفس المجرب أن يمسح جميع مجموعات الفئران التي ستتم مقارنتها ببعضها البعض. - طرد محتويات المحقنة ببطء إلى المعدة وإزالة الأنبوب بعناية من الماوس.
- بعد gavage ، أعد الماوس إلى القفص.
- تخلص من أنبوب غافاج.
- كرر العملية حسب الحاجة للعدد المطلوب من الحيوانات.
3. تشريح الأمعاء
- قبل البدء في التشريح ، قم بتشغيل أداة التصوير في الجسم الحي للسماح لها بالوصول إلى درجة الحرارة.
- التضحية بالماوس بعد 30 دقيقة من الغافاج. استخدم استنشاق ثاني أكسيد الكربون للتضحية بالفأر ، يليه خلع عنق الرحم لضمان القتل الرحيم الناجح.
- بعد التأكد من القتل الرحيم الناجح ، ضع الفأر في وضع ضعيف على مرحلة تشريح وقم بتثبيت زوائده الأربعة على المسرح للوصول إلى البطن. بلل سطح البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول لترطيب شعر البطن.
- استخدم ملقط التشريح الدقيق لسحب الجلد والحصول على مقص جراحي حاد لإجراء شق عرضي 1 سم فوق فتحة الشرج. لفضح التجويف داخل الصفاق ، استمر في الشق عموديا حتى البطن حتى القفص الصدري.
- حرك الأعور بلطف إلى اليسار باستخدام ملقط التشريح الدقيق لفضح القولون البعيد.
- قطع القولون البعيد مع مقص تشريح دقيق فقط بالقرب من المستقيم.
- قم بفك القولون والأعور والأمعاء الدقيقة بلطف عن طريق السحب ببطء في الاتجاه المعاكس.
ملاحظة: الحفاظ على الأمعاء المشوهة في جزء واحد مستمر سيخلق أكبر قدر من السهولة للباحث. سوف تتسبب التمزقات والدموع على طول الجزء في أن تكون الخطوات اللاحقة أكثر صعوبة. - استخدم مقص التشريح الدقيق لقطع القرب من المعدة.
- استخدم الملقط لنقل الأمعاء المشوهة إلى ورقة القياس (الشكل 1). ضع المعدة عند 0 مم ورتب الأمعاء على طول المسطرة حتى 200 مم. استخدم مقص التشريح الدقيق للقطع عند 200 مم. كرر هذه العملية لمحاذاة الأمعاء من 0 مم إلى 200 مم على طول المساطر مع البقاء واثقا من أن اتجاه الأمعاء لا يتم الخلط بينه.
- كن حذرا لتجنب تمدد الأمعاء أثناء المحاذاة للمساطر.
- بمجرد ترتيب الأنسجة على المسطرة ، قم بترتيب الأعور بحيث يكون موازيا للنسيج ولكن ليس على اتصال مباشر به (إذا تم العثور على أي تألق داخل تلك المنطقة ، فستكون هناك حاجة إلى تمييز واضح بين الأعور والأمعاء).
- ضع ورقة القياس مع الأنسجة المشوهة في منطقة مظلمة حتى يمكن الحفاظ على التألق حتى يحين وقت التصوير.
4. التصوير خارج الجسم الحي
- افتح برنامج التصوير في الجسم الحي وقم بتسجيل الدخول.
- قم بتهيئة أداة التصوير بحيث تكون جاهزة للحصول على الصورة.
- اضبط حقلي "الإثارة" و "الانبعاثات" على اللون المقابل المستخدم في الخرزة أو RITC gavage. أحمر (سائل): الإثارة 535 نانومتر / انبعاث 600 نانومتر. الأخضر (الميكروسفيرات): الإثارة 465 نانومتر / الانبعاثات 520 نانومتر.
- اضبط التعريض الضوئي على "تلقائي".
- حدد مجال الرؤية.
- قبل وضع ورقة القياس في الأداة ، تأكد من عدم تحول الأمعاء أثناء النقل.
- ضع ورقة القياس في الأداة داخل مجال الرؤية.
- أغلق باب الجهاز بإحكام وحدد لقطة لتصوير مجال الرؤية.
- احفظ الصور التي تم جمعها على محرك أقراص محمول لتحليلها. احفظ اللقطات الفردية للصور الفلورية والصور الفوتوغرافية. يشير تراكب الصورة الفوتوغرافية والتألق إلى موقع المواد الفلورية في الجهاز الهضمي (الشكل 1).
ملاحظة: نوصي بحفظ الملفات بتنسيق ملف صورة العلامة (.tif) للمعالجة النهائية.
5. التحليل
- افتح ملفات الصور الفلورية والصور الفوتوغرافية في برنامج تحرير الصور.
- اضبط حجم البكسل لكلتا الصورتين بحيث يكون لهما نفس الأبعاد بالضبط (كانت عادتنا هي ضبط كلتا الصورتين على 1280 بكسل بمقدار 850 بكسل [الارتفاع × العرض]).
- أغلق ملف الصورة. تتضمن الخطوات التالية صورة الفلورسنت فقط.
- استخدم أداة ممحاة لإزالة الخلفية وجعلها شفافة. قد تكون هناك حاجة إلى ممحاة لإزالة بقع الخلفية المتبقية.
- إنشاء طبقة جديدة. اجعلها خلفية سوداء بالكامل لإشارة الفلورسنت. يمكن تحقيق ذلك عن طريق اختيار تعبئة سوداء للطبقة وسحب الطبقة للاستلقاء أسفل الطبقة مع صورة الفلورسنت.
- احفظ صورة الفلورسنت الجديدة ، التي تحتوي فقط على إشارة الفلورسنت على خلفية سوداء ، كملف .tif جديد.
- افتح صور الفلورسنت والصور الفوتوغرافية الجديدة في ImageJ.
- حول كل صورة إلى صورة 32 بت عن طريق اختيار نوع الصورة > > 32 بت.
- قم بإنشاء صورة مدمجة لكليهما عن طريق اختيار > لون الصورة > دمج القنوات. في مربع الحوار الذي يفتح، حدد ملف الصورة الفوتوغرافية للقناة الرمادية وملف الفلورسنت تحت أي قنوات ملونة.
- قم بإيقاف تشغيل مقياس الصورة المدمجة عن طريق تحديد تحليل > تعيين مقياس > انقر لإزالة المقياس.
- حدد أداة "المستطيل" في ImageJ.
- ارسم مستطيلا حول جزء من الأمعاء الصغيرة. انتبه جيدا لعرض منطقة الاهتمام هذه (ROI) ، حيث يجب أن تظل ثابتة بين جميع عائد الاستثمار. القيمة الاسمية ليست ضرورية ، فقط لأنها تبقى متسقة عبر جميع عائد الاستثمار المرسوم على هذه الصورة [نظرا لأن الأمعاء الدقيقة تستحوذ على عدة صفوف ، رسم عائد استثمار فردي فوق كل قسم من الأمعاء الدقيقة في صف مختلف (الشكل 1)]. يوضح الشكل 2 موقع قيمة العرض في شريط أدوات ImageJ.
- قم بتكرار عائد الاستثمار عن طريق تحديد صورة > تكرار. حدد القناة المقابلة للقناة الملونة فقط.
- استخدم أداة المستطيل مرة أخرى لرسم عائد استثمار على الصورة الجديدة بالكامل.
- استرداد ملف تعريف التألق عن طريق تحديد تحليل > ملف تعريف المؤامرة. يرسم الرسم البياني الناتج على المحور y متوسط الكثافة لكل بكسل على طول عائد الاستثمار. تم اختيار هذا في الخطوة 5.12 ليكون طول القسم الذي تم تحليله من الأمعاء الدقيقة
- افتح قائمة القيم وانسخها إلى برنامج جدول بيانات.
- كرر الخطوات 5.12-5.16 لكل قسم من الأمعاء الدقيقة على صف مسطرة مختلف. استمر في لصق القيم على نفس ملف جدول البيانات مباشرة أسفل كل مجموعة سابقة من القيم، بحيث تحتوي جميع الصفوف المستمرة في هذا العمود على متوسط قيمة الكثافة لكامل طول الأمعاء الصغيرة.
- في برنامج جداول البيانات، اضرب كل قيمة كثافة متوسطة في العرض الثابت لمستطيل عائد الاستثمار الذي تم إنشاؤه في الخطوة 5.12. هذا سوف يؤدي إلى قيمة الكثافة الحقيقية على طول الأمعاء الدقيقة في كل نقطة.
ملاحظة: الحيوانات المختلفة سيكون لها اختلافات طفيفة في طول الأمعاء الدقيقة. لمنع الاختلافات في الطول من التأثير على نتائج تحليل البيانات النهائية ، يجب ربط سلسلة قيم الكثافة في عدد ثابت من الصناديق عبر جميع العينات التجريبية (الشكل 3 ، الشكل 4 ، والشكل 5 عرض النتائج لثلاثة أحجام من الصندوق). - اقسم عدد قيم الكثافة على عدد الصناديق المطلوبة. يحدد الحاصل الناتج S عدد قيم الكثافة المضمنة في كل صندوق.
- حدد سلة المهملات التي ستذهب إليها كل قيمة كثافة خام باستخدام صيغة تقرير إخباري. تضع هذه الخطوة كل قيمة كثافة خام في سلة المهملات. تتم فهرسة كل قيمة كثافة خام زمنيا باستخدام العدد الصحيح N. يحدد حاصل القسمة N/S رقم الحاوية المعين لكل قيمة خام. يجب أن تقوم صيغة التقرير الإخباري بتقريب هذا الحاصل إلى عدد صحيح بدون أرقام عشرية.
- قم بإنشاء القيمة لكل حاوية باستخدام صيغة averageif. الهدف هو متوسط القيم الخام المعينة لحاوية معينة في الخطوة 5.20. وبالتالي ، يجب أن تكون الوسيطات الموجودة في الصيغة: (1) الصناديق المعينة التي تم إنشاؤها في الخطوة 5.20 ، (2) رقم الحاوية ، (3) قيم الكثافة الخام.
ملاحظة: التحليل الأول الذي يمكننا إجراؤه على البيانات المثبتة هو تحليل مركزي هندسي ، والذي يحدد كميا إلى أي مدى نلاحظ أعلى كثافة فلورسنت على طول الأمعاء الدقيقة (الشكل 4). - تطبيع كل قيمة كثافة على إجمالي كثافة الفلورسنت. بمعنى آخر ، اقسم كل قيمة كثافة على مجموع جميع الكثافات.
- اضرب كل قيمة تمت تسويتها في رقم المهملات. يعكس المنتج الوزن النسبي لكل صندوق ، مما يساهم في إجمالي كثافة الفلورسنت.
- تؤدي إضافة جميع القيم التي تم إنشاؤها في الخطوة 5.23 إلى إنتاج رقم الحاوية في مركز إشارة الفلورسنت. قسمة على عدد الصناديق للتعبير عن المركز الهندسي كجزء من الأمعاء الدقيقة التي يسافرها مركز الفلورسنت.
ملاحظة: لعكس التوزيع المكاني للإشارة، تتمثل الخطوة التالية في توليد طيف القدرة لمجموعة بيانات الكثافة المثبتة (الشكل 5). - افتح معالج تحويل فورييه السريع (FFT) في برنامج جداول البيانات. حدد الإدخال كمجموعة بيانات مثبتة والإخراج كمجموعة فارغة من نفس عدد الصفوف مثل المهملات.
- استخراج مكون القيمة الحقيقية من FFT.
- ارفع كل قيمة حقيقية ل FFT إلى الطاقة الثانية. ينتج عن ذلك مجموعة بيانات من أطياف الطاقة.
- حدد النصف الأول من مجموعة بيانات أطياف الطاقة وحركها بحيث تقع أسفل النصف الثاني. هذا له تأثير على توسيط أطياف الطاقة حول تردد المركز عندما يتم رسمه في الخطوة التالية.
- ارسم أطياف القدرة على المحور y لرسم بياني x-y حيث تكون قيم المحور x هي النطاق من -1 x (عدد الصناديق / 2) إلى (عدد الصناديق / 2) -1. في حالة 1000 صندوق ، ستتراوح قيم المحور من -500 إلى 499.
- يجب مقارنة أطياف الطاقة لكل على أساس انتشار القمم غير الصفرية وارتفاعات هذه القمم غير الصفرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نعرض نتائج تمثيلية من الخطوة 3 فصاعدا. ويبين الشكل 1 الأمعاء المسحوقة السليمة، مع وضع قياسات الفلورسنت فوقها. يتم وضع المعدة (الأرجواني) على طول نفس محور الأمعاء الدقيقة (البرتقالي) ، لكننا نفضل تحريك الأعور (الأزرق) إلى الجانب لمنع التداخل مع الأمعاء الغليظة (البرتقالية). كما يتضح من اللوحة اليسرى ، هذا ليس ممكنا دائما بسبب حجم العضو. نحن نقطع الأمعاء الدقيقة عند ~ 200 مم لزيادة تغطية الأجزاء المستمرة إلى أقصى حد ، ولكن هذا ليس ممكنا دائما بسبب المساريق الذي يحد من القدرة على كشف الأمعاء ، وتفضيلنا عدم قطع الهياكل مثل كريات الفلورسنت أو الأعور. يتم فرز الكثافة الحمراء في اللوحة اليسرى من الشكل 1 والكثافة الخضراء للألواح الوسطى واليمنى في صناديق مختلفة الحجم لتوليد الشكل 3. يتم استخراج فقط الكثافة داخل عائد الاستثمار البرتقالي (الأمعاء الصغيرة) للتحليل. يتم استخراج الطول الكامل للأمعاء الدقيقة (كل عائد استثمار برتقالي في كل لوحة) للتحليل. عائد الاستثمار البرتقالي هو نفس العرض، كما هو معروض في ImageJ (الشكل 2). يتم خياطتها معا عن طريق وضع جميع الكثافات في تسلسل قبل الضرب. ويبين الشكل 3 متوسط أثر الفلورسنت ± SEM لكل مجموعة؛ راجع وسيلة إيضاح الشكل للحصول على التفاصيل.
يوضح الشكلان الأخيران نتائج التحليلات: المركز الهندسي وطيف القدرة. يقيس المركز الهندسي متوسط موقع إشارات الفلورسنت في الشكل 3 ، ويزن المتوسط بقوة الإشارة لكل صندوق. وبالتالي ، فإن القمم الأعلى في التتبع تسحب المتوسط أقرب إلى موضع تلك الذروة. يفشل المركز الهندسي في توصيف التوزيع المكاني للمحتويات داخل اللمعان بشكل كامل. على سبيل المثال ، يمكن الحصول على نفس المركز الهندسي من بلعة مركزة في نقطة واحدة وإشارة انتشار تتمحور حول نفس النقطة. ويتجلى هذا القيد في قياس المركز الهندسي في المقارنة بين السوائل والخرز الأكبر (الشكل 3 والشكل 4). تتركز غالبية أثر الفلورسنت السائل حول قمتين مبكرتين ، في حين تظهر الخرز الأكبر قمم متعددة على طول الأمعاء الدقيقة بالكامل (الشكل 3 ، الألواح اليسرى واليمنى). إن أثر الفلورسنت للحبات الأكبر حجما أكثر توزيعا ، لكنه يصل في المتوسط إلى نقطة مماثلة لتلك الموجودة في السائل ، بغض النظر عن حبيبات الربط ، مما يسلط الضوء على قيود التركيز فقط على المركز الهندسي (الشكل 4). لتفسير الطبيعة التوزيعية لانقباضات الأمعاء الدقيقة ، قمنا بدمج تحليل طيفي للطاقة في البروتوكول. يعمل تحليل طيف الطاقة عن طريق تفكيك توزيع التألق في الفضاء إلى منحنيات جيبية متعددة ذات ترددات مكانية مختلفة. يعكس كل تردد مكاني المسافة بين نقطتين تم اختيارهما عشوائيا في تتبع التألق. تحدث بعض هذه المسافات بشكل متكرر أكثر من غيرها ، لذلك تنسب كل منها قوة (قوة). ترتبط القوة بعدد المرات التي يتم فيها فصل نقطتين عشوائيتين بهذه المسافة. من خلال رسم طيف القدرة (الشكل 5) ، يمكننا توضيح عدد الترددات المكانية التي تساهم في الإشارة المقاسة (انتشار الطيف) ومقارنة القوة النسبية لتلك المساهمات (ارتفاع الطيف). هذا يسمح لنا بوصف كمية انتشار التألق على طول الجهاز الهضمي.
الشكل 1. يتم زرع الأمعاء المشوهة ووضعها على ورق مسطرة مغلفة قبل التصوير الفوتوغرافي وقياس التألق. يتم تراكب كثافة التألق واللون الزائف لتتناسب مع التألق الأصلي للمواد المحشوة. على اليسار: فلوريسات إيزوثيوسيانات الرودامين السائل (RITC) في الطيف الأحمر. الوسط: صغير (قطر: 75-90 ميكرومتر) ، وعلى اليمين: أكبر (قطر: 180-212 ميكرومتر) يخرز كلاهما يتألق في الطيف الأخضر. تحيط الصناديق الأرجوانية والبرتقالية والزرقاء والوردية بالمناطق ذات الأهمية (ROIs) في المعدة والأمعاء الدقيقة والأعور والقولون في كل عينة ، على التوالي. يتم الحفاظ على عرض كل عائد استثمار متسقا عبر الصفوف لتجنب الارتباك عند حساب كثافة التألق الخام أثناء التحليل النهائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. موقع منطقة عرض الاهتمام (بالبكسل) في شريط أدوات ImageJ (تسطير أصفر). للتكرار، يتم عرض العرض بالبكسل فقط إذا تمت إزالة المقياس (الخطوة 5.10). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. آثار التألق على طول الأمعاء الصغيرة. يشير الخط إلى متوسط التألق في صندوق معين. تشير المنطقة المظللة إلى الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). يختلف توزيع المواد الفلورية وفقا لخصائص المواد للمحتويات الداخلية (الأعمدة). على اليسار: توزيع السائل (n = 7 فئران) عبر عدد قليل من شرائح الأمعاء الدقيقة بعد 30 دقيقة من الحفر. الوسط واليمين: توزع الخرز الصغيرة (n = 6 فئران) والكبيرة (n = 5 الفئران) على نطاق أوسع على طول الأمعاء الدقيقة بعد 30 دقيقة من الحفر. تكشف زيادة عدد الصناديق المستخدمة لفرز نفس مجموعات البيانات الخام عن ميزات تتبع حبيبية غير قابلة للحل مع عدد أقل من الصناديق (الصفوف). تقلل الصناديق الأصغر من عدم اليقين في القياس ، وتزيد من الدقة المكانية وتعكس بشكل أفضل المكون التوزيعي لانقباضات الأمعاء الدقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. المركز الهندسي لتوزيع التألق في الأمعاء الدقيقة بعد 30 دقيقة من ال gavage مع RITC السائل ، والخرز الصغير (75-90 ميكرومتر) والخرز الأكبر (180-212 ميكرومتر) (متوسط ± SEM ، n = 7 ، n = 6 ، n = 5 ، ANOVA أحادي الاتجاه مع تصحيح Bonferroni). لا يؤثر حجم الحاوية على تفسير العبور بأن الخرز الصغير يتم نقله بشكل أبعد من السوائل بعد 30 دقيقة من ال gavage ، ولكن الخرز الأكبر ينتشر على نطاق واسع بحيث لا توجد اختلافات كبيرة في مركزه الهندسي مقارنة بكل من السوائل والخرز الصغير (* P < 0.05. ns = غير ذي دلالة إحصائية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. يتم تصنيف أطياف الطاقة حسب خاصية المادة (الأعمدة) وحجم الحاوية (الصفوف). التحسينات في الدقة المكانية والتجليد الأصغر واضحة. الصف العلوي: يمكن تمييز بعض الاختلافات في الأطياف المثبتة على نطاق واسع. الصف السفلي: مع تقلص أحجام الحاويات ، يمكننا تقدير الترددات المهيمنة الكبيرة الموجودة في طيف الخرز الأكبر ولكن ليس في طيف الخرز الصغير. بعض ، ولكن ليس كل ، من تلك الترددات المهيمنة الإضافية ، موجودة في الطيف السائل. باستخدام أطياف الصف السفلي ، يمكننا مقارنتها بآثار الفلورسنت في الشكل 3. في الشكل 3 ، يعرض أثر الفلورسنت السائل قمتين بارزتين ، والتي ترتبط ببعض القمم المهيمنة في طيف الطاقة. يعرض تتبع الخرز الصغير في الشكل 3 قمة مهيمنة واحدة ، والتي ترتبط بقمة واحدة مهيمنة في طيف الطاقة. يعرض تتبع الخرز الأكبر في الشكل 3 قمم أكثر هيمنة. وبناء على ذلك، يظهر طيف القدرة عددا أكبر من الترددات السائدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتطلب الجهاز الهضمي ، مثل الأعضاء الأنبوبية الأخرى ، مثل الأوعية الدموية ، أجهزة استشعار ميكانيكية ومؤثرات للحفاظ على التوازن26،27،28. ومع ذلك ، فإن الجهاز الهضمي فريد من نوعه من حيث أن الخصائص الفيزيائية للمواد التي تجتازه ليست ثابتة عبر الوجبات. تعبر المحتويات الداخلية للخصائص الفيزيائية المختلفة (الصلبة والسائلة والغازية) الأمعاء ، مما يولد مدخلات ميكانيكية مختلفة إلى مستقبلات ميكانيكية GI. في الواقع ، يتم استشعار المحفزات الميكانيكية المختلفة في القولون ونقلها بواسطة مسارات متميزة29.
هذا البروتوكول متاح تقنيا لأي شخص يقوم بعمل الماوس الروتيني ، ولكن بعض الخطوات الحاسمة تتطلب اهتماما وثيقا. نجد أن الفئران الصائمة مهمة قبل البدء في الدراسة ، لأنها تزيل المساهمة من الوجبات السابقة التي تخفف من إشارة الفلورسنت. علاوة على ذلك ، فإن الفئران التي تتغذى على نظام غذائي قياسي تظهر تألقا داخل اللمعان من مكونات النظام الغذائي ، وتحديدا مكون الكلوروفيل30. من خلال الصيام واختيار الفلوروفور ، نمنع تألق تشاو من التدخل في الظروف الخاضعة للرقابة للتجارب الموضحة في هذا البروتوكول. نوصي المجربين بالتأكد بشكل مستقل من أن فترة الصيام المختارة كافية للقضاء على التألق غير المحدد في الأمعاء الصغيرة ، لأن هذا قد يختلف حسب الإجهاد أو العمر أو الجنس. يجب على المجرب أن يقيم بصريا التوزيع المتجانس للمحتويات المجوفة. خلاف ذلك ، سيكون هناك عدم يقين في تقديمها ونتائج الدراسة. يجب أن يتم تنفيذ Gavages باستمرار من قبل نفس المجرب ، ويفضل أن يكون شخصا طور خبرة في هذه التقنية. يجب أن يهدف المجرب إلى التسليم المستمر للمحتويات إلى المعدة. إن العثور على التألق في المريء أو حصريا في المعدة هو سبب لاستبعاد من التحليل ، لأنه من غير المؤكد ما إذا كانت الأمعاء الدقيقة لديها نفس الوصول إلى محتويات gavage. بعد الترحيل ، يمكن تقصير أوقات الانتظار إلى 15 دقيقة أو تمديدها إلى 90 دقيقة ، اعتمادا على ما إذا كانت مراحل العبور المبكرة أو المتأخرة ذات أهمية22. أظهر البروتوكول الأصلي باستخدام gavage السائل أن غالبية المادة موجودة في الأمعاء الدقيقة بعد 30 دقيقة. علاوة على ذلك ، في حين أنه من الأهمية بمكان العمل على عجل أثناء خطوة التشريح ، يجب توخي الحذر لعدم إزعاج موقع المحتويات داخل اللمعان وعدم تمزيق الجهاز الهضمي.
تطور هذا البروتوكول من مناهج منشورة سابقا تربط الأمعاء الدقيقة فيزيائيا عن طريق تقطيعها إلى خمسة إلى 10 أجزاء ومحتويات متجانسة داخل اللمعان قبل قياس التألق / النشاط الإشعاعي22،23،24. كان النهج السابق مهما لأنه وحد قياس عبور الأمعاء الدقيقة. من المعروف أن الأمعاء الدقيقة تدور في أنماط معقدة وغير متوقعة داخل تجويف البطن. تمثل دراسات العبور القائمة على التصوير تحديا بغض النظر عن الأنواع31,32. في حين أن بروتوكولنا لا يزال تجربة نهائية لا يمكن توسيعها لتشمل البشر ، فإننا نحسن بشكل كبير الدقة المكانية ، ونغتنم هذا التحسن لحل عمليات العبور الإقليمية وترجمتها إلى قياس غير متحيز للانتشار داخل الأمعاء الدقيقة (طيف الطاقة).
في هذا البروتوكول ، تكون الدقة المكانية محدودة بدقة الكاميرا في نظام التصوير. نظرا لأن binning يعمل على تطبيع طول الأمعاء الدقيقة عبر الحيوانات ، يمكننا مقارنة متوسط موضع المحتويات داخل اللمعان مباشرة. يوضح الشكل 3 بوضوح التنعيم الجذري ، وزيادة عدم اليقين ، وانخفاض الدقة الناتجة عن حجم سلة المهملات الكبيرة. يحدد المركز الهندسي مركز التألق على طول الجهاز الهضمي (الشكل 4). كما هو متوقع ، لا يتأثر هذا القياس بشكل كبير بحجم الصندوق. طيف الطاقة هو طريقة غير متحيزة وتكميلية توحد تحليل القمم وينتشر في آثار الفلورسنت في الشكل 3. تحسين الدقة يحسن الأطياف المحسوبة ، مما يجعل من الممكن إظهار الاختلافات المرئية بين آثار الفلورسنت (الشكل 5). في الدقة المنخفضة (10 سلال) ، سيكون من الصعب التمييز بين السوائل والخرز الأكبر ، إما عن طريق المركز الهندسي أو تقييمات الطيف ، على الرغم من أنه من الواضح من النظر إلى آثار الفلورسنت أنها لا توزع بالمثل في الفضاء. عند الدقة العالية (1000 صندوق) ، لا تزال المراكز الهندسية متشابهة (نظرا لحقيقة أن المركز الهندسي هو متوسط القياس) ، ولكن يمكن استخدام طيف الطاقة بشكل موثوق للتمييز بين كلا الفئتين. تجدر الإشارة إلى أن آثار الفلورسنت قابلة لأنواع أخرى من التحليلات ، مثل القياسات الرائدة. يمكن استخدام التغييرات المتوقعة في المركز الهندسي أثناء حسابات حجم العينة قبل الشروع في التجارب. مع العلم أن السوائل لها مركز هندسي يبلغ حوالي 0.4-0.518 ، استخدمنا ما لا يقل عن خمسة فئران في كل مجموعة لحل التغيرات الإحصائية التي تصل إلى 45٪.
قمنا بتوسيع النطاق واستخدمنا هذا البروتوكول لدراسة عبور المواد الصلبة داخل الأمعاء الصغيرة. كما هو الحال مع السوائل ، قمنا بنقل الميكروسفير الصلب إلى المعدة. تقع العضلة العاصرة البوابية في انتقال المعدة والأمعاء الدقيقة. تعمل هذه العضلة العاصرة كمرشح استبعاد الحجم. في الفئران ، يبلغ حجم القطع حوالي 300 ميكرومتر ، مع جسيمات <300 ميكرومتر لا تواجه أي مقاومة في دخول الأمعاء الدقيقة33 ، ولكن هذا النهج يعمل أيضا مع جسيمات أكبر قليلا استخدمناها في دراسة حديثة18. لقد اخترنا أحجام المجهرية لدينا هنا لتوفير مجموعة من الأحجام التي تكمل الدراسة الأخيرة. استخدمنا اثنين من مستحضرات الخرز الفلوري التجارية التي يبلغ قطرها 75-90 ميكرومتر و 180-212 ميكرومتر. يوضح الشكل 1 كثافة التألق المماثلة والملامح في المعدة عبر الأتراب ، مما يشير إلى أنه لا يتم الاحتفاظ بالسوائل أو الجسيمات بشكل تفاضلي من قبل المعدة. توضح البيانات الأصلية المعروضة هنا كيف تتعامل الأمعاء الدقيقة للفئران من النوع البري مع السوائل والمواد الصلبة المجهرية بشكل مختلف. حتى الآن ، استخدمنا حبات ذات نطاق حجم واحد لكل تجربة مستقلة. يمكن أن تركز الدراسات المستقبلية على كيفية التعامل مع مخاليط الجسيمات ذات الأحجام المختلفة ، وخلط سوائل الفلورسنت ذات الخصائص الفيزيائية المختلفة مع حبات الفلورسنت لتحديد كيفية التعامل مع مخاليط الكيموس الأكثر واقعية بواسطة الأمعاء الصغيرة.
تشير اختلافات التوزيع المبلغ عنها هنا إلى اختلاف في أنماط الحركة التي تنشطها المواد ذات الخصائص المختلفة. نحن نفترض أن توازن التجزئة مقابل الانقباضات الدافعة يحدد إلى أي مدى وكيف تعبر المواد المتجانسة الأمعاء الصغيرة. المركز الهندسي للخرز الصغير أبعد على طول الأمعاء الدقيقة مقارنة بالسوائل ، مما يشير إلى أن الجسيمات الصلبة الصغيرة تشارك في تقلصات دافعة. من ناحية أخرى ، في حين أن المركز الهندسي للخرز الأكبر يشبه السائل ، فإن التحليل الطيفي يظهر اختلافات كبيرة في التوزيع المكاني ، والتي يمكن أن تكون نتيجة لمزيد من الانقباضات المجزأة في إعداد الخرزة الأكبر. نحن نفترض أن الأمعاء الدقيقة تستخدم التمييز في الحجم ، وهو نوع من الدوائر الحسية الميكانيكية ، كأحد المدخلات التي تغذي تحديد التوازن بين أنواع الانقباض. على سبيل المثال ، الخلايا العصبية من النوع الثاني من Dogiel هي خلايا عصبية حسية ميكانيكية يتوقع أنها تلعب دورا في توجيه التحول من الانقباضات الدافعة إلى الانقباضات المجزأة16,34. تتطلب هذه التكهنات المثيرة للاهتمام مزيدا من البحث لتحديد الآليات التي يستشعر بها الجهاز الهضمي الخصائص الفيزيائية ويحولها إلى مخرجات فسيولوجية مثل الانقباضات.
نعتقد أن هذا البروتوكول سيكون مفيدا كأداة إضافية لسد الفجوة من الجزيئات إلى الخلايا إلى وظيفة الأعضاء. لقد أدركنا أن المستقبلات الميكانيكية الظهارية GI تشترك في أوجه التشابه التنموية والهيكلية مع مستقبلات ميكانيكية الجلد35. باستخدام البروتوكول الموضح أعلاه ، ساعدنا في إظهار الدور الحسي ل "لمس الأمعاء" حيث تستشعر هذه المستقبلات الميكانيكية الظهارية GI المحفزات الميكانيكية الخفيفة وتشارك في الحساسية اللمسية الجوهرية18. نتوقع أن يثبت هذا البروتوكول أنه مفيد بالمثل لدراسة كيفية مساهمة الدوائر الحسية الأخرى في عبور الأمعاء الدقيقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
ونشكر السيدة ليندسي باسبي على المساعدة الإدارية والسيد جويل بينو على الدعم الإعلامي. دعمت منح المعاهد الوطنية للصحة هذا العمل: DK123549 وAT010875 وDK052766 وDK128913 ومركز Mayo Clinic لإشارات الخلايا في أمراض الجهاز الهضمي (DK084567).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | other mice can be used with this protocol |
| Dissection tools | n/a | n/a | |
| Excel software | Microsoft | n/a | used for spreadsheet analysis |
| Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g | Cospheric | UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g | "smaller beads" in the manuscript |
| Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g | Cospheric | UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g | "larger beads" in the manuscript |
| Gavage needles | Instech | FTP-18-50-50 | |
| ImageJ software | n/a | n/a | used to extract fluorescence profile |
| Laminated ruler paper (prepared in-house) | n/a | n/a | |
| Methyl cellulose (viscosity: 400 cP) | Sigma | M0262 | |
| Photoshop software | Adobe | n/a | used for image processing |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma | r8881-100mg | "liquid" condition in the manuscript |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
References
- Stevens, C. E., Hume, I. D. Comparative Physiology of the Vertebrate Digestive System. 2nd ed. , Cambridge University Press. (2004).
- Bayliss, W. M., Starling, E. H. The movements and innervation of the small intestine. The Journal of Physiology. 24 (2), 99-143 (1899).
- Husebye, E. The patterns of small bowel motility: physiology and implications in organic disease and functional disorders. Neurogastroenterology and Motility. (11), 141-161 (1999).
- Bush, T. G., et al. Effects of alosetron on spontaneous migrating motor complexes in murine small and large bowel in vitro. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 281 (4), 974-983 (2001).
- Der-Silaphet, T., et al. Interstitial cells of cajal direct normal propulsive contractile activity in the mouse small intestine. Gastroenterology. 114 (4), 724-736 (1998).
- Szurszewski, J. H. A migrating electric complex of the canine small intestine. American Journal of Physiology. 217 (6), 1757-1763 (1969).
- Deloose, E., et al. The migrating motor complex: control mechanisms and its role in health and disease. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 9 (5), 271-285 (2012).
- Johansoon, C., Ekelund, K. Relation between body weight and the gastric and intestinal handling of an oral caloric load. Gut. 17, 456-462 (1976).
- Sarna, S. K., et al. Spatial and temporal patterns of human jejunal contractions. American Journal of Physiology. 257 (1), 423-432 (1989).
- Hall, K. E., El-Sharkawy, T. Y., Diamant, N. E. Vagal control ofcanine postprandial upper gastrointestinal motility. American Journal of Physiology. 250, 501-510 (1986).
- Mayer, E. A. Gut feelings: the emerging biology of gut-brain communication. Nature Reviews Neuroscience. 12 (8), 453-466 (2011).
- Alcaino, C., et al. A population of gut epithelial enterochromaffin cells is mechanosensitive and requires Piezo2 to convert force into serotonin release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Sciences. 115 (32), 7632-7641 (2018).
- Kugler, E. M., et al. Mechanical stress activates neurites and somata of myenteric neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 342 (2015).
- Mazzuoli, G., Schemann, M. Mechanosensitive enteric neurons in the myenteric plexus of the mouse intestine. PloS One. 7 (7), 39887 (2012).
- Won, K. J., Sanders, K. M., Ward, S. M. Interstitial cells of Cajal mediate mechanosensitive responses in the stomach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (41), 14913-14918 (2005).
- Mao, Y., Wang, B., Kunze, W. Characterization of myenteric sensory neurons in the mouse small intestine. Journal of Neurophysiology. 96 (3), 998-1010 (2006).
- McIntyre, A., et al. Effect of bran, ispaghula, and inert plastic particles on gastric emptying and small bowel transit in humans: the role of physical factors. Gut. 40 (2), 223-227 (1997).
- Treichel, A. J., et al. Specialized mechanosensory epithelial cells in mouse gut intrinsic tactile sensitivity. Gastroenterology. 162 (2), 535-547 (2022).
- Bharucha, A. E., Anderson, B., Bouchoucha, M. More movement with evaluating colonic transit in humans. Neurogastroenterology and Motility. 31 (2), 13541 (2019).
- Camilleri, M., et al. Human gastric emptying and colonic filling of solids characterized by a new method. American Journal of Physiology. 257 (2), 284-290 (1989).
- Wang, D., et al. Trans-illumination intestine projection imaging of intestinal motility in mice. Nature Communications. 12 (1), 1682 (2021).
- Woting, A., Blaut, M. Small intestinal permeability and gut-transit time determined with low and high molecular weight fluorescein isothiocyanate-dextrans in C3H mice. Nutrients. 10 (6), 685 (2018).
- Miller, M. S., Galligan, J. J., Burks, T. F. Accurate measurement of intestinal transit in the rat. The Journal of Pharmacologial and Toxicological Methods. 6 (3), 211-217 (1981).
- Moore, B. A., et al. Inhaled carbon monoxide suppresses the development of postoperative ileus in the murine small intestine. Gastroenterology. 124 (2), 377-391 (2003).
- Machholz, E., et al. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
- Baeyens, N., Schwartz, M. A. Biomechanics of vascular mechanosensation and remodeling. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 7-11 (2016).
- Ye, G. J., Nesmith, A. P., Parker, K. K. The role of mechanotransduction on vascular smooth muscle myocytes' cytoskeleton and contractile function. The Anatomical Record (Hoboken). 297 (9), 1758-1769 (2014).
- Mercado-Perez, A., Beyder, A. Gut feelings: mechanosensing in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. , 1-14 (2022).
- Brierley, S. M., et al. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- Inoue, Y., et al. Diet and abdominal autofluorescence detected by in vivo fluorescence imaging of living mice. Molecular Imaging. 7 (1), 21-27 (2008).
- Szarka, L. A., Camilleri, M. Methods for the assessment of small-bowel and colonic transit. Seminars in Nuclear Medicine. 42 (2), 113-123 (2012).
- Padmanabhan, P., et al. Gastrointestinal transit measurements in mice with 99mTc-DTPA-labeled activated charcoal using NanoSPECT-CT. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 3 (1), 1-8 (2013).
- Jang, S. F., et al. Size discrimination in rat and mouse gastric emptying. Biopharmaceutics and Drug Disposition. 34 (2), 107-124 (2013).
- Zhu, Y. F., et al. Enteric sensory neurons communicate with interstitial cells of Cajal to affect pacemaker activity in the small intestine. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 446 (7), 1467-1475 (2014).
- Treichel, A. J., Farrugia, G., Beyder, A. The touchy business of gastrointestinal (GI) mechanosensitivity. Brain Research. 1693, 197-200 (2018).
