Summary
यह अध्ययन करने के लिए कि छोटा आंत्र अलग-अलग आकार के कणों को कैसे संभालता है, हमने छोटे आंत्र पारगमन को निर्धारित करने के लिए विवो विधि में एक स्थापित को संशोधित किया है।
Abstract
गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) गतिशीलता सामान्य पाचन और अवशोषण के लिए महत्वपूर्ण है। छोटे आंत्र में, जो पोषक तत्वों को अवशोषित करता है, गतिशीलता पाचन और अवशोषण को अनुकूलित करती है। इस कारण से, छोटे आंत्र में कुछ गतिशीलता पैटर्न में ल्यूमिनल सामग्री के मिश्रण के लिए विभाजन और उनके प्रणोदन के लिए पेरिस्टलसिस शामिल हैं। ल्यूमिनल सामग्री के भौतिक गुण छोटे आंत्र गतिशीलता के पैटर्न को संशोधित करते हैं। ल्यूमिनल सामग्री और अंतर्निहित आंत गतिशीलता को पारगमन करके जीआई मेकेनोसेंसरी सर्किट की यांत्रिक उत्तेजना जटिल जीआई मोटर पैटर्न को शुरू और संशोधित करती है। फिर भी, इस प्रक्रिया को चलाने वाले मेकेनोसेंसरी तंत्र खराब समझ में आते हैं। यह मुख्य रूप से विच्छेदन करने के लिए उपकरणों की कमी के कारण है कि छोटा आंत्र विभिन्न भौतिक गुणों की सामग्री को कैसे संभालता है। यह अध्ययन करने के लिए कि छोटा आंत्र अलग-अलग आकार के कणों को कैसे संभालता है, हमने छोटे आंत्र पारगमन को निर्धारित करने के लिए विवो विधि में एक स्थापित को संशोधित किया है। हम फ्लोरोसेंट तरल या छोटे फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ जीवित चूहों को गैवेज करते हैं। 30 मिनट के बाद, हम जीआई पथ की संपूर्णता में फ्लोरोसेंट सामग्री के वितरण को चित्रित करने के लिए आंत्र को विच्छेदित करते हैं। ज्यामितीय केंद्र के उच्च-रिज़ॉल्यूशन माप के अलावा, हम यह निर्धारित करने के लिए चर आकार बिनिंग और वर्णक्रमीय विश्लेषण का उपयोग करते हैं कि विभिन्न सामग्रियां छोटे आंत्र पारगमन को कैसे प्रभावित करती हैं। हमने पता लगाया है कि हाल ही में खोजा गया "आंत स्पर्श" तंत्र इस दृष्टिकोण का उपयोग करके छोटी आंत्र गतिशीलता को कैसे प्रभावित करता है।
Introduction
मानव जठरांत्र (जीआई) पथ एक कई फुट लंबी अंग प्रणाली है, जो मोटे तौर पर अलग-अलग आयामों औरभौतिक गुणों की ट्यूब के रूप में अनुमानित है। जैसा कि सामग्री इसकी लंबाई के माध्यम से चलती है, जीआई पथ का प्राथमिक कार्य जीवन के लिए महत्वपूर्ण पदार्थों को अवशोषित करना है। छोटी आंत विशेष रूप से पोषक तत्व अवशोषण के लिए जिम्मेदार है। पाचन और अवशोषण कार्यों से मेल खाने के लिए छोटी आंत के पारगमन को कसकर विनियमित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न गतिशीलता पैटर्न होते हैं। बेलिस और स्टारलिंग ने 1899 में "आंत के नियम" 2 का वर्णन किया, जिसमें आंत में सिकुड़ा हुआ प्रणोदन कार्यक्रम दिखाया गया जिसे आज पेरिस्टालिक रिफ्लेक्स के रूप में जाना जाता है; फूड बोलस के समीपस्थ खंड इसे आगे बढ़ाने के लिए अनुबंध करता है, और डिस्टल सेगमेंट इसे प्राप्त करने के लिए आराम करता है। सिद्धांत रूप में, यह पैटर्न अकेले सामग्री को मौखिक रूप से परिवहन करने के लिए पर्याप्त हो सकता है, लेकिन एक सदी से अधिक के शोध ने जीआई पथ में सिकुड़ा हुआ गतिविधि की अधिक जटिल तस्वीर चित्रित की है। मनुष्यों में तीन छोटी आंत गतिशीलता अवधि को मान्यता दी जाती है: माइग्रेटिंग मोटर कॉम्प्लेक्स (एमएमसी), उपवास अवधि, और पोस्टप्रांडियल अवधि3। चूहों 4,5 में एक ही पैटर्न की सूचना दी गई है। एमएमसी एक चक्रीय मोटर पैटर्न है जो अधिकांश स्तनधारियों 6,7 में संरक्षित है। एमएमसी में एक विशिष्ट चार-चरण पैटर्न है जो कार्यात्मक जीआईविकारों में एक उपयोगी नैदानिक मार्कर के रूप में कार्य करता है। घटना के क्रम में चार चरण हैं( I) गतिशीलता, (II) अनियमित, कम आयाम संकुचन, (III) नियमित उच्च आयाम संकुचन, और (IV) घटती गतिविधि की रैंप-डाउन अवधि7. एमएमसी उपवास अवधि 3 के प्रमुख मोटर पैटर्न को चिह्नित करताहै। उपवास अवधि के एमएमसी अगले भोजन की तैयारी में छोटी आंत की सामग्री को साफ करते हैं।
पोस्टप्रांडियल अवधि के मोटर पैटर्न पाचन और अवशोषक कार्यों के लिए अनुकूलित हैं। कैलोरी संरचना के बावजूद, प्रारंभिक पारगमन छोटी आंत के साथ त्वरित होता है, सामग्री आंत्र की लंबाई के साथ फैलती है, और पारगमन बाद मेंधीमा हो जाता है। अवशोषण को संपर्क सतह क्षेत्र को बढ़ाकर और निवास समय बढ़ाने के लिए इसे धीमा करके अनुकूलित किया जाता है। एक बार जब पोषक तत्व लुमेन के अंदर होते हैं, तो प्रमुख पैटर्न में करीबी (<2 सेमी अलग) असमन्वित संकुचन (सेगमेंटिंग संकुचन) होते हैं, जिसमें कुछ सुपरइम्पोज्ड बड़े-आयाम संकुचन होते हैं जो छोटे आंत्र (पेरिस्टाल्टिक संकुचन) की पूरी लंबाई में फैले होते हैं। सेगमेंटिंग संकुचन जगह में इंट्राल्यूमिनल सामग्री को मिश्रित करते हैं। कभी-कभी बड़े पेरिस्टालिक संकुचन सामग्री को बृहदान्त्र की ओर बढ़ाते हैं।
एमएमसी में वापस इस संक्रमण का समय भोजन की मात्रा और कैलोरी संरचना10 पर निर्भर करता है। इस प्रकार, छोटे आंत्र नमूने गतिशीलता अवधि के बीच संक्रमण को विनियमित करने के लिए ल्यूमिनल संकेत देते हैं। यांत्रिक संकेत, जैसे कि ल्यूमिनल सामग्री11 के भौतिक गुण, ल्यूमिनल वॉल्यूम और दीवार तनाव, जीआई दीवार 12,13,14,15,16 में मेकेनोसेप्टर कोशिकाओं को संलग्न करते हैं। दरअसल, भोजन के ठोस घटक को बढ़ाने से छोटे आंत्र पारगमन में वृद्धि होतीहै। हम अनुमान लगाते हैं कि भौतिक गुण, जैसे कि इंट्राल्यूमिनल सामग्री की तरल या ठोस स्थिति, जीआई दीवार18 पर उत्पन्न विभिन्न बलों के कारण अलग-अलग मेकेनोसेप्टर्स को संलग्न करना चाहिए।
मनुष्यों में विवो जीआई पारगमन में मापने के लिए स्वर्ण मानक, चूहों की तरह, रेडियोधर्मी ट्रेसर का उपयोग है जिसे सिंटिग्राफी द्वारा मापा जाता है क्योंकि वे पेट से बाहर निकलते हैं या बृहदान्त्र19,20 के साथ पारगमन करते हैं। स्तनधारियों में, छोटे आंत्र लूप अप्रत्याशित तरीकों से छोटे आंत्र को विवो में विश्वसनीय रूप सेचित्रित करना मुश्किल बनाते हैं, लेकिन प्रगति की जा रही है। इसके अलावा, वर्तमान में यह निर्धारित करने के लिए उपकरणों की कमी है कि छोटा आंत्र विभिन्न गुणों और आकारों के कणों को कैसे संभालता है। यहां शुरुआती बिंदु एक स्वर्ण-मानक तकनीक थी जो छोटे आंत्र पारगमन22,23,24 और बाधा समारोह 22 के अध्ययन को मानकीकृत करतीहै। इसमें एक फ्लोरोसेंट सामग्री के साथ चूहों को गैविंग करना, सामग्री को परिवहन करने के लिए जीआई गतिशीलता की प्रतीक्षा करना, जीआई पथ को बाहर निकालना, इसे पेट से बृहदान्त्र तक कई वर्गों में विभाजित करना, सेक्शनिंग करना और प्रतिदीप्ति परिमाणीकरण के लिए इंट्राल्यूमिनल सामग्री को समरूप करना शामिल है। हमने दो सुधार किए हैं। सबसे पहले, हमने फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपिक मोतियों को शामिल करने के लिए गैवेज्ड सामग्री के मेकअप को बदल दिया ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि छोटा आंत्र भौतिक कणों को कैसे वितरित करता है। दूसरा, हमने पेट से बृहदान्त्र एक्स विवो तक पूरे जीआई पथ की इमेजिंग करके स्थानिक रिज़ॉल्यूशन में सुधार किया और जानवरों में हमारे विश्लेषण को मानकीकृत करने के लिए परिवर्तनीय आकार बिनिंग का उपयोग किया। हम मानते हैं कि यह पोस्टप्रांडियल चरण के दौरान प्रोपल्सिव बनाम सेगमेंटिंग संकुचन के संतुलन में नई अंतर्दृष्टि का खुलासा करता है।
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Protocol
यहां वर्णित सभी तरीकों को मेयो क्लिनिक के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है।
1. सेटअप
- 4 घंटे के लिए 8- से 10 सप्ताह के चूहों को तेज करें। चूहों को पानी तक पहुंच प्रदान करें।
नोट: हम यहां प्रस्तुत सभी प्रयोगों के लिए जंगली प्रकार के नर सी 57बीएल / 6 जे चूहों का उपयोग करते हैं, लेकिन उन्हें किसी भी तनाव, लिंग और जीनोटाइप के चूहों पर किया जा सकता है। - 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में आसुत जल के 15 एमएल को ठंडा करें।
- एक बीकर में लगभग 80-90 डिग्री सेल्सियस तक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ गर्म प्लेट का उपयोग करके एक और 15 मिलीलीटर आसुत जल गर्म करें।
- कुल 30 एमएल (0.15 ग्राम) के लिए 0.5% मेथिलसेल्यूलोज मापें।
- धीरे से 15 एमएल गर्म पानी में मेथिलसेल्यूलोज जोड़ें ताकि यह झुरमुट न हो। इस प्रक्रिया के दौरान मिथाइलसेल्यूलोज समाधान बादल होगा।
- एक बार घुलने के बाद, बीकर को गर्म प्लेट से निकालें और गर्म बीकर में 15 मिलीलीटर ठंडा पानी जोड़ें।
- 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में रखें जब तक कि समाधान स्पष्ट न हो, लगभग 15-20 मिनट।
- स्पष्ट होने पर, 0.5% मेथिलसेल्यूलोज समाधान के प्रति 5 एमएल रोडामाइन आइसोथियोसाइनेट (आरआईटीसी)-डेक्सट्रान के 3 मिलीग्राम वजन करें और मिश्रण करने के लिए मिलाएं। यह प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में तरल स्थिति है।
- वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोसेंट पॉलीथीन माइक्रोसेफर्स के 25 मिलीग्राम वजन करें और अच्छी तरह से शामिल होने तक मिथाइलसेल्यूलोज समाधान के 200 μL के साथ मिलाएं। गैवेज से पहले भंवर द्वारा माइक्रोसेफर्स का पूरी तरह से समावेश सुनिश्चित किया जाता है। प्रयोगकर्ता को मिश्रण में निलंबित माइक्रोसेफर्स के सजातीय वितरण की कल्पना करनी चाहिए ।
- चूंकि आरआईटीसी-डेक्सट्रान समाधान हल्का संवेदनशील है, इसलिए समाधान को ठंडा करें। आरआईटीसी-डेक्सट्रान समाधान और माइक्रोश्पेर मिश्रण को पहले से तैयार करें और 2 महीने के भीतर उपयोग करें। उपयोग से पहले माइक्रोसेफर्स मिश्रण को पुन: निलंबित करें।
नोट: विभिन्न आकारों के माइक्रोसेफर्स का उपयोग विभिन्न सामग्रियों के गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल हैंडलिंग का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में, हम छोटे (व्यास: 75-90 μm) और बड़े (व्यास: 180-212 μm) माइक्रोसेफर्स का उपयोग करने के परिणामों का प्रदर्शन करते हैं।
2. इंट्राल्यूमिनल सामग्री गैवेज
- 18 जीए एक्स 50 मिमी फीडिंग ट्यूब को 1 एमएल सिरिंज से जोड़कर और आरआईटीसी समाधान या माइक्रोसेफर्स समाधान के 200 μL खींचकर गैवेज तैयार करें।
- मैन्युअल रूप से एक हाथ संयम तकनीक25 का उपयोग करके उपवास किए गए जानवर को रोकें। उचित मुराइन संयम तकनीकों पर संस्थान की जानकारी देखें।
- धीरे से माउस के मुंह और अन्नप्रणाली के माध्यम से फीडिंग ट्यूब डालें जब तक कि यह पेट में प्रवेश न करे।
नोट: एक सफल प्रयोग के लिए गैवेज चरण महत्वपूर्ण है। इसके लिए अनुभवी हाथों की आवश्यकता होती है जो लगातार ट्यूब को प्रत्येक माउस में लगभग समान दूरी पर डाल सकते हैं। इस चरण को प्रोटोकॉल करने वाले प्रयोगकर्ताओं द्वारा मानकीकृत करने की आवश्यकता है। एक ही प्रयोगकर्ता को सभी चूहों के समूहों को गैविंग करना चाहिए जिनकी तुलना एक दूसरे से की जाएगी। - धीरे-धीरे सिरिंज सामग्री को पेट में बाहर निकालें और माउस से ट्यूब को सावधानीपूर्वक हटा दें।
- गैवेज के बाद, माउस को पिंजरे में वापस कर दें।
- गैवेज ट्यूब का निपटान करें।
- जानवरों की वांछित संख्या के लिए आवश्यकतानुसार प्रक्रिया को दोहराएं।
3. आंत्र विच्छेदन
- विच्छेदन शुरू करने से पहले, विवो इमेजिंग उपकरण को चालू करें ताकि इसे तापमान पर आने की अनुमति मिल सके।
- गैवेज के 30 मिनट बाद माउस का बलिदान करें। माउस का बलिदान करने के लिए कार्बन डाइऑक्साइड इनहेलेशन का उपयोग करें, इसके बाद सफल इच्छामृत्यु सुनिश्चित करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग करें।
- सफल इच्छामृत्यु की पुष्टि करने के बाद, माउस को विच्छेदन चरण पर लापरवाह स्थिति में रखें और पेट तक पहुंचने के लिए मंच पर अपने चार उपांगों को पिन करें। पेट के बालों को गीला करने के लिए पेट की सतह को 70% इथेनॉल से गीला करें।
- त्वचा को खींचने के लिए सूक्ष्म-विच्छेदन बल (# 5) का उपयोग करें और गुदा से 1 सेमी ऊपर अनुप्रस्थ चीरा बनाने के लिए तेज सर्जिकल कैंची प्राप्त करें। इंट्रापरिटोनियल गुहा को उजागर करने के लिए, रिब पिंजरे तक पेट के लंबवत चीरा जारी रखें।
- डिस्टल बृहदान्त्र को उजागर करने के लिए सूक्ष्म-विच्छेदन बल के साथ धीरे से सेकुम को बाईं ओर ले जाएं।
- सूक्ष्म विच्छेदन कैंची के साथ डिस्टल बृहदान्त्र को मलाशय के समीप ही काटें।
- धीरे-धीरे विपरीत दिशा में खींचकर बृहदान्त्र, सेकुम और छोटी आंत को उजागर करें।
नोट: एक निरंतर खंड में विच्छेदित आंत्र को बनाए रखने से अन्वेषक के लिए सबसे आसानी होगी। सेगमेंट के साथ रिप्स और आँसू बाद के कदमों को और अधिक कठिन बना देंगे। - पेट के समीपस्थ को काटने के लिए सूक्ष्म विच्छेदन कैंची का उपयोग करें।
- विच्छेदित आंत्र को माप शीट में स्थानांतरित करने के लिए बल का उपयोग करें (चित्रा 1)। पेट को 0 मिमी पर रखें और 200 मिमी तक शासक के साथ आंत्र की व्यवस्था करें। 200 मिमी पर काटने के लिए माइक्रो-विच्छेदन कैंची का उपयोग करें। शासकों के साथ 0 मिमी से 200 मिमी तक आंतों को संरेखित करने की इस प्रक्रिया को दोहराएं, जबकि आश्वस्त रहें कि आंत्र का अभिविन्यास भ्रमित नहीं होता है।
- शासकों के साथ गठबंधन करते समय आंत्र को खींचने से बचने के लिए सावधान रहें।
- एक बार जब ऊतक को शासक पर व्यवस्थित किया जाता है, तो सेकुम को व्यवस्थित करें ताकि यह ऊतक के साथ समानांतर हो लेकिन इसके साथ सीधे संपर्क में न हो (यदि उस क्षेत्र के भीतर कोई प्रतिदीप्ति पाई जाती है, तो सेकुम और आंतों के बीच एक स्पष्ट अंतर अंतर की आवश्यकता होगी)।
- एक अंधेरे क्षेत्र में विच्छेदित ऊतक के साथ माप शीट रखें ताकि प्रतिदीप्ति को तब तक संरक्षित किया जा सके जब तक कि छवि का समय न हो।
4. पूर्व विवो इमेजिंग
- इन विवो इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें और लॉग इन करें।
- इमेजिंग उपकरण को प्रारंभ करें ताकि यह छवि अधिग्रहण के लिए तैयार हो।
- मोती या आरआईटीसी गैवेज के लिए उपयोग किए जाने वाले संबंधित रंग में 'उत्तेजना' और 'उत्सर्जन' फ़ील्ड सेट करें। लाल (तरल): उत्तेजना 535 एनएम / उत्सर्जन 600 एनएम। ग्रीन (माइक्रोसेफर्स): उत्तेजना 465 एनएम / उत्सर्जन 520 एनएम।
- एक्सपोजर को 'ऑटो' पर सेट करें।
- दृश्य क्षेत्र का चयन करें.
- उपकरण में माप शीट रखने से पहले, सुनिश्चित करें कि परिवहन के दौरान आंतों को स्थानांतरित नहीं किया गया है।
- माप शीट को दृश्य के क्षेत्र के भीतर उपकरण में रखें।
- सुरक्षित रूप से उपकरण के लिए दरवाजा बंद करें और दृश्य के क्षेत्र को फोटोग्राफ करने के लिए स्नैपशॉट का चयन करें।
- एकत्रित चित्रों को विश्लेषण के लिए फ़्लैश ड्राइव पर सहेजें. फ्लोरोसेंट और फोटोग्राफ छवियों के व्यक्तिगत कैप्चर सहेजें। फोटोग्राफ और प्रतिदीप्ति का एक ओवरले जीआई पथ में फ्लोरोसेंट सामग्री के स्थान को इंगित करता है (चित्रा 1)।
नोट: हम डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के लिए फ़ाइलों को टैग छवि फ़ाइल (.tif) प्रारूप में सहेजने की सलाह देते हैं।
5. विश्लेषण
- चित्र संपादन सॉफ्टवेयर में फ्लोरोसेंट और फोटोग्राफ छवि फ़ाइलें खोलें।
- दोनों छवियों के पिक्सेल आकार को इस तरह समायोजित करें कि उनके पास बिल्कुल समान आयाम हैं (हमारा सम्मेलन दोनों छवियों को 850 पिक्सेल [ऊंचाई x चौड़ाई] द्वारा 1280 पिक्सेल पर सेट करना था)।
- फ़ोटोग्राफ़ फ़ाइल बंद करें. निम्नलिखित चरणों में केवल फ्लोरोसेंट छवि शामिल है।
- पृष्ठभूमि को हटाने और इसे पारदर्शी बनाने के लिए एक इरेज़र टूल का उपयोग करें। शेष पृष्ठभूमि के पैच को हटाने के लिए एक इरेज़र की आवश्यकता हो सकती है।
- एक नई परत बनाएँ। फ्लोरोसेंट सिग्नल के लिए इसे पूरी तरह से काली पृष्ठभूमि बनाएं। यह परत में एक काला भरण चुनकर और फ्लोरोसेंट छवि के साथ परत के नीचे लेटने के लिए परत को खींचकर प्राप्त किया जा सकता है।
- नई फ्लोरोसेंट छवि को सहेजें, जिसमें एक नई .tif फ़ाइल के रूप में, एक काली पृष्ठभूमि पर केवल फ्लोरोसेंट सिग्नल होता है।
- ImageJ में नए फ्लोरोसेंट और फोटोग्राफ छवियों को खोलें।
- छवि > टाइप 32-बिट चुनकर प्रत्येक छवि > 32-बिट छवि में बदलें।
- छवि > रंग > मर्ज चैनल चुनकर दोनों की एक मर्ज छवि बनाएं। खुलने वाले संवाद बॉक्स में, ग्रे चैनल के लिए फोटोग्राफ फ़ाइल और किसी भी रंगीन चैनल के तहत फ्लोरोसेंट फ़ाइल का चयन करें।
- स्केल का विश्लेषण > सेट स्केल का चयन करके मर्ज की गई छवि के स्केल को बंद करें > स्केल निकालने के लिए क्लिक करें.
- ImageJ में "आयत" उपकरण का चयन करें।
- छोटे आंत्र के एक खंड के चारों ओर एक आयत खींचें। ब्याज के इस क्षेत्र (आरओआई) की चौड़ाई पर पूरा ध्यान दें, क्योंकि यह सभी आरओआई के बीच स्थिर रहना चाहिए। नाममात्र मूल्य आवश्यक नहीं है, बस यह कि इसे इस छवि पर तैयार किए गए सभी आरओआई में सुसंगत रखा जाता है [चूंकि छोटी आंत कई पंक्तियों पर कब्जा कर लेती है, इसलिए अलग-अलग आरओआई को एक अलग पंक्ति में छोटे आंत्र के प्रत्येक खंड पर खींचा जाएगा (चित्रा 1)]। चित्र 2 ImageJ उपकरण पट्टी में चौड़ाई मान का स्थान दिखाता है।
- छवि > डुप्लिकेट का चयन करके ROI डुप्लिकेट करें। रंगीन चैनल के अनुरूप केवल चैनल का चयन करें.
- पूरी नई छवि पर ROI खींचने के लिए फिर से आयत उपकरण का उपयोग करें।
- प्लॉट प्रोफाइल का विश्लेषण करके प्रतिदीप्ति की प्रोफ़ाइल प्राप्त >। परिणामी ग्राफ वाई-अक्ष पर आरओआई की लंबाई के साथ प्रत्येक पिक्सेल के लिए औसत तीव्रता को दर्शाता है। इसे चरण 5.12 में छोटे आंत्र के विश्लेषण अनुभाग की लंबाई के रूप में चुना गया था
- मानों की सूची खोलें और उन्हें स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर में कॉपी करें।
- एक अलग शासक पंक्ति पर छोटे आंत्र के प्रत्येक खंड के लिए चरण 5.12-5.16 दोहराएं। मानों के प्रत्येक पिछले सेट के तहत तुरंत एक ही स्प्रेडशीट फ़ाइल पर मान चिपकाते रहें, जैसे कि उस कॉलम में सभी निरंतर पंक्तियों में छोटे आंत्र की पूरी लंबाई के लिए औसत तीव्रता मान होता है।
- स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में, चरण 5.12 में बनाए गए ROI आयताकार की निरंतर चौड़ाई से प्रत्येक औसत तीव्रता मान गुणा करें। यह प्रत्येक बिंदु पर छोटे आंत्र के साथ वास्तविक तीव्रता मूल्य उत्पन्न करेगा।
नोट: विभिन्न जानवरों में छोटी आंत्र लंबाई पर मामूली बदलाव होंगे। डाउनस्ट्रीम डेटा विश्लेषण के परिणाम को प्रभावित करने से लंबाई के अंतर को रोकने के लिए, तीव्रता मूल्यों की स्ट्रिंग को सभी प्रयोगात्मक नमूनों में डिब्बे की एक सुसंगत संख्या में बिन करने की आवश्यकता होती है (चित्रा 3, चित्रा 4, और चित्रा 5 तीन बिन आकारों के लिए परिणाम प्रदर्शित करते हैं)। - तीव्रता मानों की संख्या को वांछित डिब्बे की संख्या से विभाजित करें। परिणामी भागफल S प्रत्येक बिन में शामिल किए जा रहे तीव्रता मानों की संख्या निर्धारित करता है।
- उस बिन का निर्धारण करें जहां प्रत्येक कच्ची तीव्रता मान एक राउंडअप सूत्र का उपयोग करके जाएगा। यह चरण प्रत्येक कच्चे तीव्रता मूल्य को एक बिन में रखता है। प्रत्येक कच्ची तीव्रता मान को पूर्णांक एन के साथ कालानुक्रमिक रूप से अनुक्रमित किया जाता है। भागफल N/S प्रत्येक कच्चे मान को सौंपी गई बिन संख्या निर्धारित करता है। राउंडअप फॉर्मूला को इस भागफल को बिना दशमलव के साथ एक पूरी संख्या में गोल करना चाहिए।
- एक औसत सूत्र का उपयोग करके प्रत्येक बिन के लिए मान उत्पन्न करें। इसका उद्देश्य चरण 5.20 में एक विशिष्ट बिन को सौंपे गए कच्चे मूल्यों को औसत करना है। इसलिए, सूत्र में तर्क होना चाहिए: (1) चरण 5.20 में उत्पन्न असाइन किए गए डिब्बे, (2) बिन संख्या, (3) कच्चे तीव्रता मान।
नोट: पहला विश्लेषण जो हम बिन्ड डेटा पर कर सकते हैं वह एक ज्यामितीय केंद्र विश्लेषण है, जो यह निर्धारित करता है कि हम छोटी आंत के साथ उच्चतम फ्लोरोसेंट तीव्रता का कितना निरीक्षण करते हैं (चित्रा 4)। - कुल फ्लोरोसेंट तीव्रता पर प्रत्येक तीव्रता मूल्य को सामान्य करें। दूसरे शब्दों में, प्रत्येक तीव्रता मान को सभी तीव्रताओं के योग से विभाजित करें।
- प्रत्येक सामान्यीकृत मान को बिन संख्या से गुणा करें। उत्पाद प्रत्येक बिन के सापेक्ष वजन को दर्शाता है, कुल फ्लोरोसेंट तीव्रता में योगदान देता है।
- चरण 5.23 में उत्पन्न सभी मानों को जोड़ने से फ्लोरोसेंट सिग्नल के केंद्र में बिन नंबर प्राप्त होता है। फ्लोरोसेंट सेंटर द्वारा यात्रा किए गए छोटे आंत्र के अंश के रूप में ज्यामितीय केंद्र को व्यक्त करने के लिए डिब्बे की संख्या से विभाजित करें।
नोट: सिग्नल के स्थानिक वितरण को प्रतिबिंबित करने के लिए, अगला कदम बिन्ड तीव्रता डेटा सेट (चित्रा 5) के पावर स्पेक्ट्रम को उत्पन्न करना है। - स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर में एक तेज़ फूरियर ट्रांसफॉर्म (FFT) विज़ार्ड खोलें। इनपुट को बिन किए गए डेटा सेट के रूप में और आउटपुट को डिब्बे के समान पंक्तियों के खाली सेट के रूप में चुनें।
- एफएफटी के वास्तविक मूल्य घटक को निकालें।
- एफएफटी के प्रत्येक वास्तविक मूल्य को दूसरी शक्ति तक बढ़ाएं। यह पावर स्पेक्ट्रा का एक डेटा सेट उत्पन्न करता है।
- पावर स्पेक्ट्रा डेटा सेट के पहले आधे हिस्से का चयन करें और इसे स्थानांतरित करें ताकि यह दूसरी छमाही से नीचे हो। यह केंद्र आवृत्ति के चारों ओर पावर स्पेक्ट्रा को केंद्रित करने का प्रभाव है जब इसे अगले चरण में प्लॉट किया जाता है।
- एक x-y ग्राफ के y-अक्ष पर पावर स्पेक्ट्रा को प्लॉट करें जहां x-अक्ष मान -1 x (डिब्बे/2 की संख्या) से (डिब्बे/2 की संख्या) -1 तक की सीमा है। 1000 डिब्बे के मामले में, अक्ष मान -500 से 499 तक होंगे।
- प्रत्येक जानवर के लिए पावर स्पेक्ट्रा की तुलना गैर-शून्य चोटियों के प्रसार और इन गैर-शून्य चोटियों की ऊंचाइयों के आधार पर की जानी चाहिए।
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Representative Results
हम चरण 3 से प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं। चित्रा 1 फ्लोरोसेंट माप के साथ बरकरार खोजे गए आंत्र को दर्शाता है। पेट (बैंगनी) को छोटी आंत (नारंगी) के समान धुरी के साथ रखा जाता है, लेकिन हम बड़ी आंत (नारंगी) के साथ ओवरलैप को रोकने के लिए सेकुम (नीले) को साइड में ले जाना पसंद करते हैं। जैसा कि बाएं पैनल में स्पष्ट है, अंग के आकार के कारण यह हमेशा संभव नहीं होता है। हमने निरंतर खंडों के कवरेज को अधिकतम करने के लिए ~ 200 मिमी पर छोटे आंत्र को काट दिया, लेकिन आंतों को फैलाने की क्षमता को सीमित करने वाले मेसेंटरी के कारण यह हमेशा संभव नहीं होता है, और फ्लोरोसेंट छर्रों या सीकुम जैसी संरचनाओं के माध्यम से कटौती नहीं करने की हमारी प्राथमिकता होती है। चित्रा 1 के बाएं पैनल में लाल तीव्रता और मध्य और दाएं पैनलों की हरी तीव्रता को चित्रा 3 उत्पन्न करने के लिए विभिन्न आकार के डिब्बे में क्रमबद्ध किया जाता है। विश्लेषण के लिए केवल नारंगी आरओआई (छोटे आंत्र) के भीतर तीव्रता निकाली जाती है। विश्लेषण के लिए छोटे आंत्र (प्रत्येक पैनल में प्रत्येक नारंगी आरओआई) की पूरी लंबाई निकाली जाती है। ऑरेंज आरओआई समान चौड़ाई हैं, जैसा कि इमेजजे (चित्रा 2) में प्रदर्शित किया गया है। उन्हें बिनिंग से पहले अनुक्रम में सभी तीव्रताओं को रखकर एक साथ सिला जाता है। चित्रा 3 प्रति कॉहोर्ट एसईएम ± औसत फ्लोरोसेंट ट्रेस दिखाता है; बारीकियों के लिए आकृति किंवदंती देखें।
अंतिम दो आंकड़े विश्लेषण के परिणामों को प्रदर्शित करते हैं: ज्यामितीय केंद्र और शक्ति स्पेक्ट्रम। ज्यामितीय केंद्र चित्रा 3 में फ्लोरोसेंट संकेतों के औसत स्थान को मापता है, प्रत्येक बिन की सिग्नल ताकत से औसत का वजन करता है। इसलिए, ट्रेस में उच्च चोटियां औसत को उस चोटी की स्थिति के करीब खींचती हैं। ज्यामितीय केंद्र इंट्राल्यूमिनल सामग्री के स्थानिक वितरण को पूरी तरह से चिह्नित करने में विफल रहता है। उदाहरण के लिए, एक ही ज्यामितीय केंद्र को एक बिंदु पर केंद्रित बोलस और एक ही बिंदु के आसपास केंद्रित एक स्प्रेड-आउट सिग्नल से प्राप्त किया जा सकता है। ज्यामितीय केंद्र माप की यह सीमा तरल पदार्थ और बड़े मोतियों (चित्रा 3 और चित्रा 4) के बीच तुलना में स्पष्ट है। तरल फ्लोरोसेंट ट्रेस का अधिकांश हिस्सा दो शुरुआती चोटियों के आसपास केंद्रित है, जबकि बड़े मोती छोटे आंत्र की पूरी लंबाई के साथ कई चोटियों को दिखाते हैं (चित्रा 3, बाएं और दाएं पैनल)। बड़े मोतियों का फ्लोरोसेंट ट्रेस अधिक वितरित किया जाता है, लेकिन यह तरल के समान बिंदु तक औसत होता है, भले ही बिनिंग ग्रैन्यूलैरिटी की परवाह किए बिना, जो केवल ज्यामितीय केंद्र पर ध्यान केंद्रित करने की सीमा पर प्रकाश डालता है (चित्रा 4)। छोटे आंत्र संकुचन की वितरण प्रकृति के लिए, हमने प्रोटोकॉल में एक शक्ति वर्णक्रमीय विश्लेषण शामिल किया है। पावर स्पेक्ट्रम विश्लेषण अंतरिक्ष में प्रतिदीप्ति वितरण को विभिन्न स्थानिक आवृत्तियों के कई साइनसोइड वक्रों में विघटित करके काम करता है। प्रत्येक स्थानिक आवृत्ति प्रतिदीप्ति ट्रेस में दो यादृच्छिक रूप से चयनित बिंदुओं के बीच की दूरी को दर्शाती है। इनमें से कुछ दूरियां दूसरों की तुलना में अधिक बार होती हैं, इसलिए प्रत्येक को एक ताकत (शक्ति) के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। शक्ति इस बात से संबंधित है कि उस दूरी से दो यादृच्छिक बिंदु कितनी बार अलग होते हैं। पावर स्पेक्ट्रम (चित्रा 5) को प्लॉट करके, हम यह प्रदर्शित कर सकते हैं कि कितनी स्थानिक आवृत्तियों मापा संकेत (स्पेक्ट्रम के प्रसार) में योगदान करती हैं और उन योगदानों (स्पेक्ट्रम की ऊंचाई) की सापेक्ष शक्ति की तुलना करती हैं। यह हमें मात्रात्मक रूप से जीआई पथ के साथ प्रतिदीप्ति के प्रसार का वर्णन करने की अनुमति देता है।
चित्र 1. विच्छेदित आंत्र को फोटोग्राफी और प्रतिदीप्ति माप से पहले लैमिनेटेड रूलर पेपर पर खोजा और रखा जाता है। प्रतिदीप्ति की तीव्रता को गैवेज्ड सामग्री के मूल प्रतिदीप्ति से मेल खाने के लिए ओवरलेयर और स्यूडोकलर किया जाता है। बाएं: लाल स्पेक्ट्रम में तरल रोडामाइन आइसोथियोसाइनेट (आरआईटीसी) फ्लोरेस; मध्य: छोटा (व्यास: 75-90 μm), और दाएं: बड़ा (व्यास: 180-212 μm) मोती हरे स्पेक्ट्रम में दोनों फ्लोरेस हैं। बैंगनी, नारंगी, नीले और गुलाबी बक्से क्रमशः प्रत्येक नमूने में पेट, छोटी आंत, सेकम और बृहदान्त्र में रुचि के क्षेत्रों (आरओआई) को घेरते हैं। डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के दौरान कच्चे फ्लोरेसेंस तीव्रता की गणना करते समय भ्रम से बचने के लिए प्रत्येक आरओआई की चौड़ाई को पंक्तियों में सुसंगत रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2. ImageJ टूलबार (पीला रेखांकन) में रुचि चौड़ाई (पिक्सेल में) के क्षेत्र का स्थान. दोहराने के लिए, चौड़ाई पिक्सेल में केवल तभी प्रदर्शित होती है जब स्केल हटा दिया गया हो (चरण 5.10)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3. छोटे आंत्र की लंबाई के साथ प्रतिदीप्ति निशान। रेखा किसी दिए गए बिन पर औसत प्रतिदीप्ति को दर्शाती है। छायांकित क्षेत्र माध्य (एसईएम) की मानक त्रुटि को दर्शाता है। फ्लोरोसेंट सामग्री का वितरण इंट्राल्यूमिनल सामग्री (कॉलम) के भौतिक गुणों के अनुसार भिन्न होता है। बाएं: गैवेज के 30 मिनट बाद कुछ छोटे आंत्र खंडों में तरल (एन = 7 चूहे) वितरण। मध्य और दाएं: छोटे (एन = 6 चूहे) और बड़े (एन = 5 चूहे) मोती गैवेज के 30 मिनट बाद छोटे आंत्र के साथ अधिक व्यापक रूप से वितरित होते हैं। एक ही कच्चे डेटा सेट को क्रमबद्ध करने के लिए उपयोग किए जाने वाले डिब्बे की संख्या बढ़ाने से दानेदार ट्रेस विशेषताओं का पता चलता है जो कम डिब्बे (पंक्तियों) के साथ अपरिवर्तनीय हैं। छोटे डिब्बे माप अनिश्चितता को कम करते हैं, स्थानिक रिज़ॉल्यूशन बढ़ाते हैं और छोटे आंत्र संकुचन के वितरण घटक को बेहतर ढंग से दर्शाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4. तरल आरआईटीसी, छोटे मोती (75-90 μm) और बड़े मोती (180-212 μm) (एसईएम, एन = 7, एन = 6, एन = 5, बोनफेरोनी सुधार ± के साथ एक तरफा एनोवा) के साथ गैवेज के 30 मिनट बाद छोटे आंत्र में प्रतिदीप्ति वितरण का ज्यामितीय केंद्र। बिन आकार पारगमन व्याख्या को प्रभावित नहीं करता है कि छोटे मोतियों को गैवेज के 30 मिनट बाद तरल पदार्थ की तुलना में अधिक दूर ले जाया जाता है, लेकिन बड़े मोती इतने व्यापक रूप से वितरित होते हैं कि तरल पदार्थ और छोटे मोतियों दोनों की तुलना में उनके ज्यामितीय केंद्र में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं होता है (* पी < 0.05. एनएस = सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 5. पावर स्पेक्ट्रा को भौतिक संपत्ति (कॉलम) और बिन आकार (पंक्तियों) द्वारा वर्गीकृत किया जाता है। स्थानिक रिज़ॉल्यूशन और छोटे बिनिंग में सुधार स्पष्ट हैं। शीर्ष पंक्ति: व्यापक रूप से बिन किए गए स्पेक्ट्रा में कुछ अंतरों को अलग किया जा सकता है। नीचे पंक्ति: जैसे-जैसे बिन आकार सिकुड़ता है, हम बड़े मोतियों के स्पेक्ट्रम में मौजूद महत्वपूर्ण प्रमुख आवृत्तियों की सराहना कर सकते हैं लेकिन छोटे मोतियों में नहीं। उन अतिरिक्त प्रमुख आवृत्तियों में से कुछ, लेकिन सभी नहीं, तरल स्पेक्ट्रम में मौजूद हैं। नीचे पंक्ति स्पेक्ट्रा का उपयोग करके, हम चित्रा 3 में फ्लोरोसेंट निशान की तुलना कर सकते हैं। चित्रा 3 में, तरल फ्लोरोसेंट ट्रेस दो प्रमुख चोटियों को प्रदर्शित करता है, जो बिजली स्पेक्ट्रम में कुछ प्रमुख चोटियों के साथ संबंधित है। चित्रा 3 में छोटे मोती ट्रेस एक एकल प्रमुख शिखर प्रदर्शित करते हैं, जो बिजली स्पेक्ट्रम में एकल प्रमुख शिखर के साथ संबंधित है। चित्रा 3 में बड़े मोती ट्रेस अधिक प्रमुख चोटियों को प्रदर्शित करते हैं। तदनुसार, पावर स्पेक्ट्रम प्रमुख आवृत्तियों की अधिक संख्या दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
जीआई पथ, अन्य ट्यूबलर अंगों की तरह, जैसे रक्त वाहिकाओं, होमियोस्टेसिस26,27,28 को बनाए रखने के लिए यांत्रिक सेंसर और प्रभावकों की आवश्यकता होती है। हालांकि, जीआई पथ इस मायने में अद्वितीय है कि इसे पार करने वाली सामग्रियों के भौतिक गुण भोजन में स्थिर नहीं हैं। विभिन्न भौतिक गुणों (ठोस, तरल और गैस) की इंट्राल्यूमिनल सामग्री आंत को स्थानांतरित करती है, जिससे जीआई मेकेनोसेप्टर्स को विभिन्न यांत्रिक इनपुट उत्पन्न होते हैं। दरअसल, बृहदान्त्र में विभिन्न यांत्रिक उत्तेजनाओं को अलग-अलग मार्गों द्वारा महसूस और रिले किया जाताहै।
यह प्रोटोकॉल तकनीकी रूप से नियमित माउस कार्य करने वाले किसी भी व्यक्ति के लिए सुलभ है, लेकिन कुछ महत्वपूर्ण चरणों को निकट ध्यान देने की आवश्यकता होती है। हम पाते हैं कि अध्ययन शुरू करने से पहले उपवास चूहों महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह फ्लोरोसेंट सिग्नल को पतला करने वाले पूर्व भोजन से योगदान को हटा देता है। इसके अलावा, एक मानक आहार खिलाए गए चूहों ने आहार घटकों से इंट्राल्यूमिनल फ्लोरेसेंस का प्रदर्शन किया, विशेष रूप से क्लोरोफिल घटक30। उपवास और फ्लोरोफोरे चयन से, हम चाउ फ्लोरेसेंस को इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रयोगों की नियंत्रित स्थितियों में हस्तक्षेप करने से रोकते हैं। हम प्रयोगकर्ताओं को स्वतंत्र रूप से पुष्टि करने की सलाह देते हैं कि चयनित उपवास अवधि छोटे आंत्र में गैर-विशिष्ट प्रतिदीप्ति को खत्म करने के लिए पर्याप्त है, क्योंकि यह तनाव, आयु या लिंग से भिन्न हो सकता है। प्रयोगकर्ता को गेज सामग्री के सजातीय वितरण का नेत्रहीन आकलन करना चाहिए। अन्यथा, उनके वितरण और अध्ययन के परिणामों में अनिश्चितता होगी। गैवेज को लगातार एक ही प्रयोगकर्ता द्वारा किया जाना चाहिए, अधिमानतः कोई ऐसा व्यक्ति जिसने तकनीक के साथ अनुभव विकसित किया है। प्रयोगकर्ता को पेट में सामग्री के लगातार वितरण का लक्ष्य रखना चाहिए। अन्नप्रणाली में या विशेष रूप से पेट में प्रतिदीप्ति खोजना विश्लेषण से एक जानवर को बाहर करने का आधार है, क्योंकि यह अनिश्चित है कि छोटी आंत की गैवेज्ड सामग्री तक समान पहुंच थी या नहीं। गैविंग के बाद, प्रतीक्षा समय को 15 मिनट तक छोटा किया जा सकता है या 90 मिनट तक बढ़ाया जा सकता है, यह इस बात पर निर्भर करता है कि प्रारंभिक या देर से पारगमन चरण रुचिरखते हैं या नहीं। तरल गैवेज का उपयोग करने वाले मूल प्रोटोकॉल ने प्रदर्शित किया कि अधिकांश सामग्री 30 मिनट के बाद छोटे आंत्र में रहती है। इसके अलावा, जबकि विच्छेदन चरण के दौरान जल्दबाजी के साथ काम करना महत्वपूर्ण है, इस बात का ध्यान रखा जाना चाहिए कि इंट्राल्यूमिनल सामग्री के स्थान को परेशान न करें और जीआई पथ को न तोड़ें।
यह प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित दृष्टिकोणों से विकसित हुआ, जिसने छोटी आंत को पांच से 10 खंडों में काटकर शारीरिक रूप से बांध दिया और फ्लोरेसेंस / रेडियोधर्मिता माप22,23,24 से पहले इंट्राल्यूमिनल सामग्री को समरूप किया। पिछला दृष्टिकोण महत्वपूर्ण था क्योंकि इसने छोटे आंत्र पारगमन के माप को मानकीकृत किया था। पेट की गुहा के अंदर जटिल और अप्रत्याशित पैटर्न में छोटी आंत कुख्यात रूप से लूप करती है। इमेजिंग-आधारित पारगमन अध्ययन प्रजातियों31,32 की परवाह किए बिना चुनौतीपूर्ण हैं। जबकि हमारा प्रोटोकॉल एक टर्मिनल प्रयोग बना हुआ है जिसे मनुष्यों में विस्तारित नहीं किया जा सकता है, हम स्थानिक संकल्प में काफी सुधार करते हैं, और क्षेत्रीय पारगमन को हल करने के लिए उस सुधार को पकड़ते हैं और उन्हें छोटे आंत्र (पावर स्पेक्ट्रम) के भीतर प्रसार के निष्पक्ष माप में अनुवाद करते हैं।
इस प्रोटोकॉल में, स्थानिक रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग सिस्टम में कैमरे के रिज़ॉल्यूशन द्वारा सीमित है। चूंकि बिनिंग जानवरों में छोटी आंत्र लंबाई को सामान्य करता है, इसलिए हम सीधे इंट्राल्यूमिनल सामग्री की औसत स्थिति की तुलना कर सकते हैं। चित्रा 3 स्पष्ट रूप से बड़े बिन आकार के परिणामस्वरूप कठोर चिकनाई, अनिश्चितता में वृद्धि और कम रिज़ॉल्यूशन को दर्शाता है। ज्यामितीय केंद्र जीआई पथ के साथ प्रतिदीप्ति केंद्र को निर्धारित करता है (चित्रा 4)। जैसा कि अपेक्षित था, यह माप बिन आकार से महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं है। पावर स्पेक्ट्रम एक निष्पक्ष और पूरक विधि है जो चित्र 3 के फ्लोरोसेंट निशान में चोटियों और फैलाव के विश्लेषण को मानकीकृत करती है। रिज़ॉल्यूशन में सुधार से गणना किए गए स्पेक्ट्रा में सुधार होता है, जिससे फ्लोरोसेंट निशान (चित्रा 5) के बीच दृश्यमान अंतर प्रदर्शित करना संभव हो जाता है। कम रिज़ॉल्यूशन (10 डिब्बे) पर, तरल पदार्थ और बड़े मोतियों के बीच अंतर करना मुश्किल होगा, या तो ज्यामितीय केंद्र या स्पेक्ट्रम आकलन द्वारा, भले ही फ्लोरोसेंट निशान को देखने से यह स्पष्ट हो कि वे अंतरिक्ष में समान रूप से वितरित नहीं किए जाते हैं। उच्च रिज़ॉल्यूशन (1000 डिब्बे) पर, ज्यामितीय केंद्र अभी भी समान हैं (इस तथ्य के कारण कि ज्यामितीय केंद्र एक औसत माप है), लेकिन दोनों समूहों के बीच अंतर करने के लिए पावर स्पेक्ट्रम का मज़बूती से उपयोग किया जा सकता है। यह ध्यान देने योग्य है कि फ्लोरोसेंट निशान अन्य प्रकार के विश्लेषणों के लिए उत्तरदायी हैं, जैसे कि अग्रणी-किनारे माप। ज्यामितीय केंद्र में प्रत्याशित परिवर्तनों का उपयोग प्रयोगों को शुरू करने से पहले नमूना आकार गणना के दौरान किया जा सकता है। यह जानते हुए कि तरल पदार्थों का ज्यामितीय केंद्र लगभग 0.4-0.518 है, हमने 45% तक के परिवर्तनों को सांख्यिकीय रूप से हल करने के लिए प्रत्येक समूह में कम से कम पांच चूहों का उपयोग किया।
हमने दायरे का विस्तार किया और छोटे आंत्र के भीतर ठोस पदार्थों के पारगमन का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया। तरल पदार्थों के साथ, हमने ठोस माइक्रोसेफर्स को पेट में डाल दिया। पाइलोरिक स्फिंक्टर पेट-छोटे आंत्र संक्रमण पर स्थित है। यह स्फिंक्टर एक आकार बहिष्करण फ़िल्टर के रूप में काम करता है। चूहों में, आकार कटऑफ ~ 300 μm पर है, जिसमें कण <300 μm छोटे आंत्र33 में प्रवेश करने में कोई प्रतिरोध का सामना नहीं करते हैं, लेकिन यह दृष्टिकोण थोड़ा बड़े कणों के साथ भी काम करता है जो हमने हाल के अध्ययन18 में उपयोग किया था। हमने हाल के अध्ययन के पूरक आकारों की एक श्रृंखला प्रदान करने के लिए यहां अपने माइक्रोसेफर्स आकारों को चुना। हमने दो वाणिज्यिक फ्लोरोसेंट बीड तैयारी का उपयोग किया, जिनका व्यास 75-90 μm और 180-212 μm है। चित्र 1 समूहों में पेट में समान प्रतिदीप्ति घनत्व और प्रोफाइल दिखाता है, यह सुझाव देता है कि न तो तरल पदार्थ और न ही कण पेट द्वारा अलग-अलग बनाए रखे जाते हैं। यहां प्रस्तुत मूल डेटा दर्शाता है कि जंगली प्रकार के चूहों का छोटा आंत्र तरल पदार्थ और सूक्ष्म ठोस पदार्थों को अलग तरह से कैसे संभालता है। अब तक, हमने प्रति स्वतंत्र प्रयोग एक आकार की सीमा के मोतियों का उपयोग किया है। भविष्य के अध्ययन इस बात पर ध्यान केंद्रित कर सकते हैं कि विभिन्न आकार के कणों के मिश्रण को कैसे संभाला जाता है, और फ्लोरोसेंट मोतियों के साथ विभिन्न भौतिक गुणों के फ्लोरोसेंट तरल पदार्थों को मिलाकर यह निर्धारित किया जा सके कि छोटे आंत्र द्वारा अधिक यथार्थवादी चाइम मिश्रण कैसे संभाला जाता है।
यहां रिपोर्ट किए गए वितरण अंतर विभिन्न गुणों की सामग्रियों द्वारा सक्रिय गतिशीलता पैटर्न में अंतर का सुझाव देते हैं। हम मानते हैं कि सेगमेंटिंग बनाम प्रोपल्सिव संकुचन का संतुलन यह निर्धारित करता है कि छोटे आंत्र को कितनी दूर और कितनी सजातीय रूप से सामग्री पारगमन करती है। छोटे मोतियों के लिए ज्यामितीय केंद्र तरल पदार्थों की तुलना में छोटे आंत्र के साथ दूर है, यह सुझाव देते हुए कि छोटे ठोस कण प्रोपल्सिव संकुचन को संलग्न करते हैं। दूसरी ओर, जबकि बड़े मोतियों के लिए ज्यामितीय केंद्र एक तरल के समान है, वर्णक्रमीय विश्लेषण स्थानिक वितरण में महत्वपूर्ण अंतर दिखाता है, जो बड़े मोती सेटिंग में अधिक विभाजन संकुचन का परिणाम हो सकता है। हम अनुमान लगाते हैं कि छोटा आंत्र आकार भेदभाव, एक प्रकार का मेकेनोसेंसरी सर्किट का उपयोग करता है, जो संकुचन प्रकारों के बीच संतुलन तय करने में फ़ीड करने वाले इनपुट में से एक के रूप में होता है। उदाहरण के लिए, डोगियल टाइप II न्यूरॉन्स मेकेनोसेंसरी न्यूरॉन्स हैं जो प्रोपल्सिव से सेगमेंटिंग संकुचन16,34 में स्विच को निर्देशित करने में भूमिका निभाने के लिए अनुमान लगाया जाता है। इन पेचीदा अटकलों को उन तंत्रों को निर्धारित करने के लिए और शोध की आवश्यकता होती है जिनके द्वारा जीआई पथ भौतिक गुणों को महसूस करता है और उन्हें संकुचन जैसे शारीरिक आउटपुट में स्थानांतरित करता है।
हमारा मानना है कि यह प्रोटोकॉल अणुओं से कोशिकाओं से अंग समारोह तक की खाई को पाटने के लिए एक अतिरिक्त उपकरण के रूप में सहायक होगा। हमने मान्यता दी कि जीआई उपकला मेकेनोसेप्टर्स त्वचा मेकेनोसेप्टर्स35 के साथ विकासात्मक और संरचनात्मक समानताएं साझा करते हैं। ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने "आंत स्पर्श" की संवेदी भूमिका को प्रदर्शित करने में मदद की, जहां ये जीआई उपकला मेकेनोसेप्टर्स प्रकाश यांत्रिक उत्तेजनाओं को महसूस करते हैं और आंतरिक स्पर्श संवेदनशीलता18 में भाग लेते हैं। हम उम्मीद करते हैं कि यह प्रोटोकॉल यह अध्ययन करने के लिए समान रूप से सहायक साबित होगा कि अन्य संवेदी सर्किट छोटे आंत्र पारगमन में कैसे योगदान करते हैं।
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Disclosures
कोई नहीं।
Acknowledgments
हम प्रशासनिक सहायता के लिए श्रीमती लिंडसे बुस्बी और मीडिया समर्थन के लिए श्री जोएल पिनो को धन्यवाद देते हैं। एनआईएच अनुदान ने इस काम का समर्थन किया: डीके 123549, एटी010875, डीके052766, डीके128913, और गैस्ट्रोएंटरोलॉजी में सेल सिग्नलिंग के लिए मेयो क्लिनिक सेंटर (डीके084567)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | other mice can be used with this protocol |
| Dissection tools | n/a | n/a | |
| Excel software | Microsoft | n/a | used for spreadsheet analysis |
| Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g | Cospheric | UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g | "smaller beads" in the manuscript |
| Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g | Cospheric | UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g | "larger beads" in the manuscript |
| Gavage needles | Instech | FTP-18-50-50 | |
| ImageJ software | n/a | n/a | used to extract fluorescence profile |
| Laminated ruler paper (prepared in-house) | n/a | n/a | |
| Methyl cellulose (viscosity: 400 cP) | Sigma | M0262 | |
| Photoshop software | Adobe | n/a | used for image processing |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma | r8881-100mg | "liquid" condition in the manuscript |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
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