Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Undersøgelse af Murine tyndtarmsmekanosensering af luminale partikler

Published: March 18, 2022 doi: 10.3791/63697
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 3, 1,4
1Enteric NeuroScience Program (ENSP), Division of Gastroenterology & Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic, 2Medical Scientist Training Program (MSTP), Mayo Clinic, 3Easy Learning Labs, 4Department of Physiology & Biomedical Engineering (PBME), Mayo Clinic
* These authors contributed equally

Summary

For at undersøge, hvordan tyndtarmen håndterer partikler af varierende størrelse, har vi ændret en etableret in vivo-metode til bestemmelse af tyndtarmstransit.

Abstract

Gastrointestinal (GI) motilitet er afgørende for normal fordøjelse og absorption. I tyndtarmen, som absorberer næringsstoffer, optimerer motilitet fordøjelsen og absorptionen. Af denne grund inkluderer nogle af bevægelighedsmønstrene i tyndtarmen segmentering til blanding af luminalt indhold og peristaltik for deres fremdrift. Fysiske egenskaber af luminalt indhold modulerer mønstrene af tyndtarmsmotilitet. Den mekaniske stimulering af GI mekanosensoriske kredsløb ved at passere luminalt indhold og underliggende tarmmotilitet initierer og modulerer komplekse GI-motormønstre. Alligevel forbliver de mekanosensoriske mekanismer, der driver denne proces, dårligt forstået. Dette skyldes primært mangel på værktøjer til at dissekere, hvordan tyndtarmen håndterer materialer med forskellige fysiske egenskaber. For at undersøge, hvordan tyndtarmen håndterer partikler af varierende størrelse, har vi ændret en etableret in vivo-metode til bestemmelse af tyndtarmstransit. Vi giver levende mus med fluorescerende væske eller små fluorescerende perler. Efter 30 minutter dissekerer vi tarmene for at afbilde fordelingen af fluorescerende indhold over hele mave-tarmkanalen. Ud over målinger i høj opløsning af det geometriske center bruger vi binning i variabel størrelse og spektralanalyse til at bestemme, hvordan forskellige materialer påvirker tyndtarmstransit. Vi har undersøgt, hvordan en nyligt opdaget "tarmberøring" -mekanisme påvirker tyndtarmsmotilitet ved hjælp af denne tilgang.

Introduction

Den humane gastrointestinale (GI) kanal er et flere fod langt organsystem, omtrent tilnærmet som et rør af varierende dimensioner og fysiske egenskaber1. Når indholdet bevæger sig gennem dets længde, er mave-tarmkanalens primære funktion at absorbere stoffer, der er kritiske for livet. Tyndtarmen er specifikt ansvarlig for næringsstofabsorption. Tyndtarmens transit er stramt reguleret for at matche fordøjelses- og absorptionsfunktionerne, hvilket resulterer i forskellige bevægelighedsmønstre. Bayliss og Starling beskrev "tarmens lov"2 i 1899 og viste det kontraktile fremdriftsprogram i tarmen, der i dag er kendt som den peristaltiske refleks; segmentet proximal til fødevarebolus trækker sig sammen for at drive det fremad, og det distale segment slapper af for at modtage det. I teorien kunne dette mønster alene være tilstrækkeligt til at transportere materiale aboralt, men over et århundredes forskning har malet et mere komplekst billede af kontraktil aktivitet i mave-tarmkanalen. Tre tyndtarmsmotilitetsperioder genkendes hos mennesker: det migrerende motorkompleks (MMC), fasteperioden og postprandialperioden3. De samme mønstre er rapporteret hos mus 4,5. MMC er et cyklisk motormønster, der er bevaret på tværs af de fleste pattedyr 6,7. MMC har et karakteristisk firefaset mønster, der fungerer som en nyttig klinisk markør i funktionelle GI-lidelser7. De fire faser er i rækkefølge efter forekomst (I) hvile, (II) uregelmæssige, lave amplitudesammentrækninger, (III) regelmæssige sammentrækninger med høj amplitude og (IV) rampeperiode med faldende aktivitet7. MMC markerer det vigtigste motormønster i fasteperioden3. MMC'er i fasteperioden rydder op i tyndtarmens indhold som forberedelse til det næste måltid.

De motoriske mønstre i postprandialperioden er optimeret til fordøjelses- og absorptionsfunktionerne3. Uanset kaloriesammensætning er den indledende transit hurtig langs tyndtarmen, indholdet spredes langs tarmens længde, og transit sænkes efterfølgende8. Absorption optimeres ved at øge kontaktfladen og bremse den for at øge opholdstiden. Når næringsstofferne er inde i lumen, består det dominerende mønster af tætte (<2 cm fra hinanden) ukoordinerede sammentrækninger (segmenteringssammentrækninger) med nogle få overlejrede store amplitudesammentrækninger, der spænder over hele tyndtarmens længde (peristaltiske sammentrækninger)9. Segmenteringssammentrækninger blander det intraluminale indhold på plads. De lejlighedsvise store peristaltiske sammentrækninger driver indholdet mod tyktarmen.

Tidspunktet for denne overgang tilbage til MMC'er afhænger af fødevarevolumen og kaloriesammensætning10. Således prøver tyndtarmen lysende signaler for at regulere, hvornår der skal skiftes mellem bevægelighedsperioder. Mekaniske signaler, såsom fysiske egenskaber af luminalt indhold11, luminalvolumen og vægspænding, engagerer mekanoreceptorceller i GI-væggen 12,13,14,15,16. Faktisk fører forøgelse af den faste bestanddel af et måltid til en stigning i tyndtarmstransit17. Vi spekulerer i, at fysiske egenskaber, såsom væsken eller fast tilstand af intraluminalt indhold, skal engagere forskellige mekanoreceptorer på grund af de forskellige kræfter, de genererer på GI-væggen18.

Guldstandarden til måling af in vivo GI-transit hos mennesker, som hos mus, er brugen af radioaktive sporstoffer målt ved scintigrafi, når de forlader maven eller transit langs tyktarmen19,20. Hos pattedyr sløjfer tyndtarmen på uforudsigelige måder, hvilket gør tyndtarmen vanskelig at forestille sig in vivo pålideligt, men der gøres fremskridt21. Desuden mangler der i øjeblikket værktøjer til at kvantificere, hvordan tyndtarmen håndterer partikler af varierende egenskaber og størrelser. Udgangspunktet her var en guldstandardteknik, der standardiserer studiet af tyndtarmstransit 22,23,24 og barrierefunktion 22. Den består af gavaging mus med et fluorescerende materiale, venter på GI-motilitet til at transportere materialet, excising af mave-tarmkanalen, segmentering i flere sektioner fra mave til tyktarm, sektionering og homogenisering af intraluminalt indhold til fluorescenskvantificering. Vi har foretaget to forbedringer. Først ændrede vi sammensætningen af indholdet til at omfatte fluorescerende mikroskopiske perler for at bestemme, hvordan tyndtarmen fordeler fysiske partikler. For det andet forbedrede vi den rumlige opløsning ved at billeddanne hele mave-tarmkanalen fra mave til tyktarm ex vivo og brugte binning af variabel størrelse til at standardisere vores analyse på tværs af dyr. Vi postulerer, at dette afslører ny indsigt i balancen mellem fremdrift versus segmentering af sammentrækninger i den postprandiale fase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder, der er beskrevet her, er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i Mayo Clinic.

1. Opsætning

  1. Hurtige 8- til 10 uger gamle mus i 4 timer. Giv mus adgang til vand.
    BEMÆRK: Vi bruger vildtypehanmus C57BL/6J til alle forsøg, der præsenteres her, men de kan udføres på mus af enhver stamme, køn og genotype.
  2. Afkøl 15 ml destilleret vand i et 50 ml konisk rør i et 4 °C køleskab.
  3. Yderligere 15 ml destilleret vand opvarmes i et bægerglas ved hjælp af en kogeplade med magnetisk rørestang til ca. 80-90 °C.
  4. Der måles 0,5 % methylcellulose for i alt 30 ml (0,15 g).
  5. Tilsæt forsigtigt methylcellulose til 15 ml varmt vand, så det ikke klumper. Methylcelluloseopløsningen vil være uklar under denne proces.
  6. Når bægerglasset er opløst, fjernes det fra kogepladen, og der tilsættes 15 ml kølet vand til det varme bægerglas.
  7. Anbring i et 4 °C køleskab, indtil opløsningen er klar, ca. 15-20 min.
  8. Når det er klart, vejes 3 mg rhodaminisothiocyanat (RITC)-dextran pr. 5 ml 0,5% methylcelluloseopløsning og blandes for at kombinere. Dette er den flydende tilstand i afsnittet Repræsentative resultater .
    1. Alternativt vejes 25 mg fluorescerende polyethylenmikrosfærer, og der blandes med 200 μL methylcelluloseopløsning, indtil den er godt inkorporeret. Grundig inkorporering af mikrosfærer sikres ved hvirvel inden sonde. Eksperimentatoren skal visualisere homogen fordeling af suspenderede mikrosfærer i blandingen.
    2. Da RITC-dextran-opløsningen er lysfølsom, afkøles opløsningen. Forbered RITC-dextran-opløsningen og microshpere-blandingen på forhånd og brug inden for 2 måneder. Suspender mikrosfæreblandingen før brug.
      BEMÆRK: Mikrosfærer af varierende størrelse bruges til at studere gastrointestinal håndtering af forskellige materialer. I afsnittet Repræsentative resultater viser vi resultaterne af at bruge små (diameter: 75-90 μm) og større (diameter: 180-212 μm) mikrosfærer.

2. Intraluminalt indhold gaver

  1. Forbered sonden ved at fastgøre et 18 Ga x 50 mm fodringsrør til en 1 ml sprøjte og trække 200 μL RITC-opløsning eller mikrosfæreopløsning.
  2. Hold det fastende dyr fast manuelt tilbage ved hjælp af enhåndsfastholdelsesteknikken25. Der henvises til institutionens oplysninger om korrekte murinefastholdelsesteknikker.
  3. Indsæt forsigtigt fodringsrøret gennem musens mund og spiserør, indtil det kommer ind i maven.
    BEMÆRK: Sugetrinnet er afgørende for et vellykket eksperiment. Det kræver erfarne hænder, der konsekvent kan indsætte røret nogenlunde samme afstand i hver mus. Dette trin skal standardiseres af eksperimenter, der udfører protokollen. Den samme eksperimentator skal give alle mus kohorter, der vil blive sammenlignet med hinanden.
  4. Udvis langsomt sprøjtens indhold i maven, og fjern forsigtigt røret fra musen.
  5. Efter sonden skal du returnere musen til buret.
  6. Bortskaf sonderøret.
  7. Gentag processen efter behov for det ønskede antal dyr.

3. Afføring

  1. Før du begynder dissektionerne, skal du tænde in vivo-billeddannelsesinstrumentet for at lade det komme til temperatur.
  2. Ofr musen 30 min efter gavlen. Brug kuldioxidindånding til at ofre musen, efterfulgt af cervikal dislokation for at sikre vellykket eutanasi.
  3. Efter at have bekræftet vellykket eutanasi, skal du placere musen i liggende stilling på et dissektionstrin og fastgøre sine fire vedhæng på scenen for at få adgang til maven. Våd overfladen af maven med 70% ethanol for at våde abdominale hår.
  4. Brug mikrodissektionstang til at trække huden og erhverve en skarp kirurgisk saks til at lave et tværgående snit 1 cm over anus. For at udsætte intraperitonealhulen skal du fortsætte snittet lodret op i maven indtil brystkassen.
  5. Flyt forsigtigt cecum til venstre med mikrodissektionstangen for at udsætte den distale tyktarm.
  6. Skær den distale tyktarm med mikrodissektionssaks lige proximal til endetarmen.
  7. Optrævl forsigtigt tyktarmen, cecum og tyndtarmen ved at trække langsomt i den modsatte retning.
    BEMÆRK: Vedligeholdelse af de dissekerede tarme i et kontinuerligt segment vil skabe mest lethed for efterforskeren. Rips og tårer langs segmentet vil medføre, at efterfølgende trin bliver vanskeligere.
  8. Brug mikrodissektionssaks til at skære proksimal til maven.
  9. Brug tang til at overføre de dissekerede tarme til målearket (figur 1). Placer maven på 0 mm og arranger tarmene langs linealen indtil 200 mm. Brug mikrodissektionssaks til at skære ved 200 mm. Gentag denne proces med at justere tarmene fra 0 mm til 200 mm langs linealerne, mens du forbliver sikker på, at tarmens orientering ikke bliver forvirret.
    1. Pas på at undgå at strække tarmene, mens du tilpasser dig herskerne.
  10. Når vævet er arrangeret på linealen, skal du arrangere cecum, så det er parallelt med vævet, men ikke i direkte kontakt med det (hvis der findes fluorescens inden for denne region, vil der være behov for en klar forskel mellem cecum og tarmene).
  11. Placer målearket med det dissekerede væv i et mørkt område, så fluorescensen kan bevares, indtil det er tid til at afbilde.

4. Ex vivo-billeddannelse

  1. Åbn in vivo-billedbehandlingssoftwaren , og log ind.
  2. Initialiser billeddannelsesinstrumentet, så det er klar til billedoptagelse.
  3. Indstil felterne 'Excitation' og 'Emission' til den tilsvarende farve, der bruges til perlen eller RITC-gavlen. Rød (væske): excitation 535 nm /emission 600 nm. Grøn (mikrosfærer): excitation 465 nm /emission 520 nm.
  4. Indstil eksponeringen til 'Auto'.
  5. Vælg synsfeltet.
  6. Før du placerer målearket i instrumentet, skal du sikre dig, at tarmene ikke har skiftet under transport.
  7. Placer målearket i instrumentet inden for synsfeltet.
  8. Luk døren til instrumentet sikkert, og vælg Snapshot for at fotografere synsfeltet.
  9. Gem indsamlede billeder på et flashdrev til analyse. Gem individuelle optagelser af fluorescerende og fotografiske billeder. En overlejring af fotografiet og fluorescensen angiver placeringen af fluorescerende materiale i mave-tarmkanalen (figur 1).
    BEMÆRK: Vi anbefaler, at du gemmer filerne i tagbilledfilen (.tif) format til downstream-behandling.

5. Bedømmelse

  1. Åbn fluorescerende og fotografiske billedfiler i en billedredigeringssoftware.
  2. Juster pixelstørrelsen på begge billeder, så de har nøjagtig de samme dimensioner (vores konvention var at indstille begge billeder til 1280 pixels med 850 pixels [højde x bredde]).
  3. Luk fotofilen. Følgende trin involverer kun det fluorescerende billede.
  4. Brug et viskelæderværktøj til at fjerne baggrunden og gøre den gennemsigtig. Et viskelæder kan være nødvendigt for at fjerne pletter af den resterende baggrund.
  5. Opret et nyt lag. Gør det til en helt sort baggrund for det fluorescerende signal. Dette kan opnås ved at vælge en sort fyldning til laget og trække laget til at ligge under laget med det fluorescerende billede.
  6. Gem det nye fluorescerende billede, der kun indeholder det fluorescerende signal på en sort baggrund, som en ny .tif fil.
  7. Åbn de nye fluorescerende og fotografiske billeder i ImageJ.
  8. Gør hvert billede til et 32-bit billede ved at vælge Billede > Type > 32-bit.
  9. Opret et flettet billede af begge ved at vælge Billede > Farve > Flet kanaler. I dialogboksen, der åbnes, skal du vælge fotografifilen for den grå kanal og den fluorescerende fil under alle farvede kanaler.
  10. Slå skalaen for det flettede billede fra ved at vælge Analysér > Indstil skala > Klik for at fjerne skala.
  11. Vælg værktøjet "Rektangel" i ImageJ.
  12. Tegn et rektangel omkring en del af tyndtarmen. Vær meget opmærksom på bredden af denne interesseregion (ROI), da den skal forblive konstant mellem alle ROI'er. Den nominelle værdi er ikke afgørende, bare at den holdes konsistent på tværs af alle ROI'er tegnet på dette billede [da tyndtarmen overtager flere rækker, vil individuelle ROI'er blive tegnet over hver sektion af tyndtarmen i en anden række (figur 1)]. Figur 2 viser placeringen af breddeværdien på værktøjslinjen ImageJ.
  13. Dupliker investeringsafkastet ved at vælge Billede > Dupliker. Vælg kun den kanal, der svarer til den farvede kanal.
  14. Brug rektangelværktøjet igen til at tegne et investeringsafkast over det helt nye billede.
  15. Hent en profil af fluorescensen ved at vælge Analysér > plotprofil. Den resulterende graf plotter på y-aksen den gennemsnitlige intensitet for hver pixel langs længden af ROI. Dette blev valgt i trin 5.12 for at være længden af den analyserede del af tyndtarmen
  16. Åbn listen over værdier, og kopier dem til en regnearkssoftware.
  17. Gentag trin 5.12-5.16 for hver sektion af tyndtarmen på en anden linealrække. Bliv ved med at indsætte værdierne i den samme regnearksfil med det samme under hvert tidligere sæt værdier, således at alle kontinuerlige rækker i den pågældende kolonne indeholder den gennemsnitlige intensitetsværdi for hele tyndtarmens længde.
  18. I regnearkssoftwaren skal du gange hver gennemsnitlig intensitetsværdi med den konstante bredde af ROI-rektanglet, der blev oprettet i trin 5.12. Dette vil give den reelle intensitetsværdi langs tyndtarmen på hvert punkt.
    BEMÆRK: Forskellige dyr vil have små variationer på tyndtarmslængden. For at forhindre, at længdeforskellene påvirker resultatet af downstream-dataanalysen, skal strengen af intensitetsværdier kasseres i et ensartet antal placeringer på tværs af alle eksperimentelle prøver (figur 3, figur 4 og figur 5 viser resultater for tre beholderstørrelser).
  19. Divider antallet af intensitetsværdier med antallet af ønskede placeringer. Den resulterende kvotient S bestemmer antallet af intensitetsværdier, der inkluderes i hver placering.
  20. Bestem den placering, hvor hver råintensitetsværdi skal hen, ved hjælp af en roundup-formel. Dette trin placerer hver rå intensitetsværdi i en placering. Hver råintensitetsværdi indekseres kronologisk med heltalet N. Kvotienten N/S bestemmer det placeringsnummer , der tildeles hver råværdi. Roundup-formlen skal afrunde denne kvotient til et helt tal uden decimaler.
  21. Generer værdien for hver beholder ved hjælp af en gennemsnitlig formel. Målet er at beregne gennemsnittet af de råværdier, der er tildelt en bestemt beholder i trin 5.20. Derfor skal argumenterne i formlen være: (1) tildelte placeringer genereret i trin 5.20, (2) bin-nummer, (3) rå intensitetsværdier.
    BEMÆRK: Den første analyse, vi kan udføre på de kasserede data, er en geometrisk centeranalyse, som kvantificerer, hvor langt vi observerer den højeste fluorescerende intensitet langs tyndtarmen (figur 4).
  22. Normaliser hver intensitetsværdi over den samlede fluorescerende intensitet. Med andre ord divider hver intensitetsværdi med summen af alle intensiteter.
  23. Multiplicer hver normaliseret værdi med bin-nummeret. Produktet afspejler den relative vægt af hver skraldespand, hvilket bidrager til den samlede fluorescerende intensitet.
  24. Tilføjelse af alle værdier, der genereres i trin 5.23, giver binnummeret i midten af det fluorescerende signal. Divider med antallet af skraldespande for at udtrykke det geometriske center som den brøkdel af tyndtarmen, der rejses af det fluorescerende center.
    BEMÆRK: For at afspejle signalets rumlige fordeling er det næste trin at generere effektspektret for det binned intensitetsdatasæt (figur 5).
  25. Åbn en FFT-guide (Fast Fourier Transform) i regnearkssoftwaren. Vælg inputtet som det datasæt, der ikke er i én, og outputtet som et tomt sæt med det samme antal rækker som placeringer.
  26. Uddrag den reelle værdikomponent i FFT.
  27. Hæv hver reel værdi af FFT til den anden magt. Dette giver et datasæt af effektspektre.
  28. Vælg den første halvdel af effektspektredatasættet, og flyt det, så det ligger under anden halvdel. Dette har den virkning, at effektspektrene centreres omkring centerfrekvensen, når den afbildes i næste trin.
  29. Afbild effektspektrene på y-aksen i en x-y-graf, hvor x-akseværdierne er området fra -1 x (antal placeringer/2) til (antal placeringer/2) -1. I tilfælde af 1000 skraldespande vil akseværdierne variere fra -500 til 499.
  30. Effektspektre for hvert dyr bør sammenlignes på grundlag af spredningen af ikke-nul toppe og højderne af disse ikke-nul toppe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi viser repræsentative resultater fra trin 3 og fremefter. Figur 1 viser de intakte udplantede tarme med fluorescerende målinger overlejret. Maven (lilla) lægges langs samme akse som tyndtarmen (orange), men vi foretrækker at flytte cecum (blå) til siden for at forhindre overlapning med tyktarmen (orange). Som det fremgår af venstre panel, er dette ikke altid muligt på grund af organstørrelse. Vi skærer tyndtarmen til ~ 200 mm for at maksimere dækningen af kontinuerlige segmenter, men dette er ikke altid muligt på grund af mesenteri, der begrænser evnen til at udfolde tarmene, og vores præference for ikke at skære gennem strukturer som fluorescerende pellets eller cecum. Den røde intensitet i venstre panel i figur 1 og de grønne intensiteter i det midterste og højre panel sorteres i beholdere i forskellige størrelser for at generere figur 3. Kun intensiteterne inden for de orange ROI'er (tyndtarm) ekstraheres til analyse. Den fulde længde af tyndtarmen (hver orange ROI i hvert panel) ekstraheres til analyse. Orange ROI'er har samme bredde som vist i ImageJ (figur 2). De sys sammen ved at placere alle intensiteter i rækkefølge inden binning. Figur 3 viser det gennemsnitlige fluorescerende spor ± SEM pr. kohorte; Se figurforklaring for detaljer.

De to sidste figurer viser resultaterne af analyserne: geometrisk center og effektspektrum. Det geometriske center måler den gennemsnitlige placering af de fluorescerende signaler i figur 3 og vejer gennemsnittet med signalstyrken for hver skraldespand. Derfor trækker højere toppe i sporet gennemsnittet tættere på placeringen af den top. Det geometriske center undlader fuldstændigt at karakterisere den rumlige fordeling af intraluminalt indhold. For eksempel kan det samme geometriske center opnås fra en bolus koncentreret på et enkelt punkt og et spredt signal centreret omkring det samme punkt. Denne begrænsning af den geometriske centermåling er tydelig i sammenligningen mellem væsker og større perler (figur 3 og figur 4). Størstedelen af det flydende fluorescerende spor er centreret omkring to tidlige toppe, mens de større perler viser flere toppe langs tyndtarmens fulde længde (figur 3, venstre og højre panel). Det fluorescerende spor af de større perler er mere fordelt, men det er gennemsnitligt til et lignende punkt som væskens, uanset binning granularitet, hvilket fremhæver begrænsningen ved udelukkende at fokusere på det geometriske centrum (figur 4). For at tage højde for den distribuerende karakter af tyndtarmskontraktioner har vi indarbejdet en effektspektralanalyse i protokollen. Effektspektrumanalysen fungerer ved at dekonstruere fluorescensfordelingen i rummet i flere sinusformede kurver af forskellige rumlige frekvenser. Hver rumlig frekvens afspejler afstanden mellem to tilfældigt udvalgte punkter i fluorescenssporet. Nogle af disse afstande forekommer hyppigere end andre, så hver tilskrives en styrke (magt). Effekten korrelerer med, hvor ofte to tilfældige punkter adskilles af denne afstand. Ved at plotte effektspektret (figur 5) kan vi demonstrere, hvor mange rumlige frekvenser der bidrager til det målte signal (spredning af spektret) og sammenligne den relative styrke af disse bidrag (spektrets højde). Dette giver os mulighed for kvantitativt at beskrive spredningen af fluorescens langs mave-tarmkanalen.

Figure 1
Figur 1. De dissekerede tarme udplantes og placeres på lamineret linealpapir inden fotografering og fluorescensmåling. Fluorescensintensitet er overlejret og pseudofarvet for at matche den oprindelige fluorescens af gavaged materiale. Til venstre: flydende rhodaminisothiocyanat (RITC) fluorescerer i det røde spektrum; Midten: lille (diameter: 75-90 μm) og højre: større (diameter: 180-212 μm) perler begge fluorescere i det grønne spektrum. Lilla, orange, blå og lyserøde kasser omgiver områder af interesse (ROI'er) i henholdsvis maven, tyndtarmen, cecum og tyktarm i hver prøve. Bredden af hvert investeringsafkast holdes konsistent på tværs af rækker for at undgå forvirring ved beregning af den rå fluorescensintensitet under downstream-analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2. Placering af interesseområdets bredde (i pixel) på værktøjslinjen ImageJ (gul understregning). For at gentage vises bredden kun i pixels, hvis skalaen er fjernet (trin 5.10). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3. Fluorescens spor langs længden af tyndtarmen. Linje angiver den gennemsnitlige fluorescens ved en given beholder. Det skraverede område angiver standardfejlen for middelværdien (SEM). Fordelingen af fluorescerende materiale varierer afhængigt af materialeegenskaberne af det intraluminale indhold (kolonner). Til venstre: væske (n = 7 mus) fordeling på nogle få tyndtarmssegmenter 30 min efter sonde. Mellem og højre: små (n = 6 mus) og større (n = 5 mus) perler fordeler sig mere bredt langs tyndtarmen 30 min efter sonde. Hvis du øger antallet af placeringer, der bruges til at sortere de samme rå datasæt, afsløres granulære sporingsfunktioner, der ikke kan løses med færre placeringer (rækker). Mindre skraldespande mindsker måleusikkerheden, øger den rumlige opløsning og afspejler bedre fordelingskomponenten i tyndtarmssammentrækninger. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4. Det geometriske centrum af fluorescensfordelingen i tyndtarm 30 min efter sonde med flydende RITC, små perler (75-90 μm) og større perler (180-212 μm) (gennemsnit ± SEM, n = 7, n = 6, n = 5, envejs ANOVA med Bonferroni-korrektion). Beholderstørrelse påvirker ikke transitfortolkningen af, at små perler transporteres mere distalt end væsker 30 min efter sondering, men de større perler fordeler sig så meget, at der ikke er signifikante forskelle i deres geometriske centrum sammenlignet med både væsker og små perler (*P < 0,05. ns = ikke statistisk signifikant). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5. Effektspektre er kategoriseret efter materialeegenskab (kolonner) og beholderstørrelse (rækker). Forbedringerne i rumlig opløsning og mindre binning er tydelige. Øverste række: få forskelle kan skelnes i de bredt binned spektre. Nederste række: Når beholderstørrelserne skrumper, kan vi sætte pris på betydelige dominerende frekvenser, der findes i de større perlers spektrum, men ikke i de små perler. Nogle, men ikke alle, af disse yderligere dominerende frekvenser er til stede i væskespektret. Ved hjælp af de nederste rækkespektre kan vi sammenligne med de fluorescerende spor i figur 3. I figur 3 viser det flydende fluorescerende spor to fremtrædende toppe, som korrelerer med nogle få dominerende toppe i effektspektret. De små perler spor i figur 3 viser en enkelt dominerende top, som korrelerer med en enkelt dominerende top i effektspektret. De større perler spor i figur 3 viser mere dominerende toppe. Følgelig viser effektspektret et større antal dominerende frekvenser. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

GI-kanalen, ligesom andre rørformede organer, såsom blodkar, kræver mekaniske sensorer og effektorer for at opretholde homeostase26,27,28. GI-kanalen er imidlertid unik, fordi de fysiske egenskaber af de materialer, der krydser den, ikke er konstante på tværs af måltider. Intraluminalt indhold af forskellige fysiske egenskaber (fast, flydende og gas) passerer tarmen og genererer forskellige mekaniske input til GI-mekanoreceptorerne. Faktisk er forskellige mekaniske stimuli i tyktarmen sanset og videresendt af forskellige veje29.

Denne protokol er teknisk tilgængelig for alle, der udfører rutinemæssigt musearbejde, men et par kritiske trin kræver nøje opmærksomhed. Vi finder, at fastende mus er vigtige, før vi starter undersøgelsen, da det fjerner bidraget fra tidligere måltider, der fortynder fluorescerende signal. Desuden udviser mus fodret med en standarddiæt intraluminal fluorescens fra diætkomponenter, specifikt klorofylkomponenten30. Ved at faste og fluorophore selektion forhindrer vi chow fluorescens i at forstyrre de kontrollerede betingelser for de eksperimenter, der er skitseret i denne protokol. Vi anbefaler, at forsøgspersoner uafhængigt bekræfter, at den valgte fasteperiode er tilstrækkelig til at eliminere ikke-specifik fluorescens i tyndtarmen, da dette kan variere efter stamme, alder eller køn. Eksperimentatoren skal visuelt vurdere den homogene fordeling af det gavaged indhold. Ellers vil der være usikkerhed i deres levering og undersøgelsesresultaterne. Gavages skal konsekvent udføres af den samme eksperimentator, helst en person, der har udviklet erfaring med teknikken. Eksperimentatoren bør sigte mod konsekvent levering af indhold til maven. At finde fluorescens i spiserøret eller udelukkende i maven er grund til at udelukke et dyr fra analysen, da det er usikkert, om tyndtarmen havde samme adgang til det gavnede indhold. Efter gavaging kan ventetiderne forkortes til 15 minutter eller forlænges til 90 minutter, afhængigt af om tidlige eller sene transitfaser er af interesse22. Den oprindelige protokol ved hjælp af flydende sonde viste, at størstedelen af materialet ligger i tyndtarmen efter 30 minutter. Selvom det er kritisk at arbejde hurtigt under dissektionstrinnet, skal man desuden passe på ikke at forstyrre placeringen af det intraluminale indhold og ikke sprænge mave-tarmkanalen.

Denne protokol udviklede sig fra tidligere offentliggjorte tilgange, der fysisk binned tyndtarmen ved at skære den i fem til 10 segmenter og homogeniseret intraluminalt indhold før fluorescens / radioaktivitetsmåling22,23,24. Den tidligere tilgang var vigtig, fordi den standardiserede målingen af tyndtarmstransit. Tyndtarmen løber notorisk i komplicerede og uforudsigelige mønstre inde i bughulen. Billeddannelsesbaserede transitstudier er udfordrende uanset art31,32. Mens vores protokol forbliver et terminalt eksperiment, der ikke kan udvides til mennesker, forbedrer vi den rumlige opløsning betydeligt og griber denne forbedring til at løse regionale transitter og oversætte dem til en upartisk måling af spredning inden for tyndtarmen (effektspektrum).

I denne protokol er rumlig opløsning begrænset af kameraets opløsning i billeddannelsessystemet. Da binning normaliserer tyndtarmslængden på tværs af dyr, kan vi direkte sammenligne den gennemsnitlige position af intraluminalindholdet. Figur 3 viser tydeligt den drastiske udjævning, øget usikkerhed og nedsat opløsning som følge af dimensionering af store skraldespande. Det geometriske center kvantificerer fluorescenscentret langs mave-tarmkanalen (figur 4). Som forventet påvirkes denne måling ikke væsentligt af beholderstørrelsen. Effektspektret er en upartisk og komplementær metode, der standardiserer analysen af toppe og spredninger i de fluorescerende spor i figur 3. Forbedring af opløsningen forbedrer de beregnede spektre, hvilket gør det muligt at påvise synlige forskelle mellem fluorescerende spor (figur 5). Ved lav opløsning (10 skraldespande) ville det være vanskeligt at skelne mellem væsker og større perler, enten ved hjælp af det geometriske centrum eller spektrumvurderinger, selvom det er klart ved at se på de fluorescerende spor, at de ikke fordeles på samme måde i rummet. Ved højere opløsning (1000 skraldespande) er de geometriske centre stadig ens (på grund af det faktum, at det geometriske center er en gennemsnitlig måling), men effektspektret kan pålideligt bruges til at skelne mellem begge kohorter. Det er værd at bemærke, at de fluorescerende spor er modtagelige for andre typer analyser, såsom førende målinger. Forventede ændringer i det geometriske center kan bruges under beregninger af stikprøvestørrelse, inden forsøgene påbegyndes. Da vi vidste, at væsker har et geometrisk center på ca. 0,4-0,518, brugte vi mindst fem mus i hver gruppe til statistisk at løse ændringer på op til 45%.

Vi udvidede omfanget og brugte denne protokol til at studere transit af faste stoffer i tyndtarmen. Som med væsker gav vi de faste mikrosfærer ind i maven. Den pyloriske lukkemuskel er placeret ved overgangen mellem mave og tyndtarm. Denne lukkemuskel fungerer som et størrelsesekskluderingsfilter. Hos mus er størrelsesafskæringen på ~ 300 μm, hvor partikler < 300 μm ikke støder på nogen modstand ved at komme ind i tyndtarmen33, men denne tilgang fungerer også med lidt større partikler, vi brugte i en nylig undersøgelse18. Vi valgte vores mikrosfærestørrelser her for at give en række størrelser, der supplerer den nylige undersøgelse. Vi brugte to kommercielle fluorescerende perlepræparater, der har diametre på 75-90 μm og 180-212 μm. Figur 1 viser lignende fluorescenstæthed og profiler i maven på tværs af kohorter, hvilket tyder på, at hverken væsker eller partikler tilbageholdes forskelligt af maven. De originale data, der præsenteres her, viser, hvordan tyndtarmen hos vildtypemus håndterer væsker og mikroskopiske faste stoffer forskelligt. Indtil videre har vi brugt perler i et størrelsesområde pr. Uafhængigt eksperiment. Fremtidige undersøgelser kan fokusere på, hvordan blandinger af partikler af forskellig størrelse håndteres, og blanding af fluorescerende væsker af forskellige fysiske egenskaber med fluorescerende perler for at bestemme, hvordan mere realistiske chymeblandinger håndteres af tyndtarmen.

De fordelingsforskelle, der er rapporteret her, tyder på en forskel i bevægelighedsmønstrene aktiveret af materialer med forskellige egenskaber. Vi postulerer, at balancen mellem segmentering versus fremdriftssammentrækninger bestemmer, hvor langt og hvor homogent materialer passerer tyndtarmen. Det geometriske center for små perler er længere langs tyndtarmen sammenlignet med væsker, hvilket tyder på, at små faste partikler engagerer fremdrivende sammentrækninger. På den anden side, mens det geometriske center for større perler ligner en væske, viser spektralanalyse betydelige forskelle i rumlig fordeling, hvilket kan være et resultat af flere segmenteringssammentrækninger i den større perleindstilling. Vi antager, at tyndtarmen bruger størrelsesdiskrimination, en type mekanosensorisk kredsløb, som et af de input, der føder til at bestemme balancen mellem sammentrækningstyper. For eksempel er Dogiel type II neuroner mekanosensoriske neuroner, der spekuleres i at spille en rolle i at styre skiftet fra fremdrivnings- til segmenteringssammentrækninger16,34. Disse spændende spekulationer kræver yderligere forskning for at bestemme de mekanismer, hvormed mave-tarmkanalen registrerer fysiske egenskaber og transducerer dem til fysiologiske output såsom sammentrækninger.

Vi mener, at denne protokol vil være nyttig som et ekstra værktøj til at bygge bro over kløften fra molekyler til celler til organfunktion. Vi erkendte, at GI-epitelmekanoreceptorer deler udviklingsmæssige og strukturelle ligheder med hudmekanoreceptorer35. Ved hjælp af protokollen skitseret ovenfor hjalp vi med at demonstrere den sensoriske rolle som "tarmberøring", hvor disse GI-epitelmekanoreceptorer fornemmer lette mekaniske stimuli og deltager i iboende taktil følsomhed18. Vi forventer, at denne protokol vil vise sig at være lige så nyttig til at studere, hvordan andre sensoriske kredsløb bidrager til tyndtarmstransit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Vi takker fru Lyndsay Busby for administrativ bistand og hr. Joel Pino for mediestøtte. NIH-tilskud støttede dette arbejde: DK123549, AT010875, DK052766, DK128913 og Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology (DK084567).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664 other mice can be used with this protocol
Dissection tools n/a n/a
Excel software Microsoft n/a used for spreadsheet analysis
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g Cospheric UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g "smaller beads" in the manuscript
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g Cospheric UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g "larger beads" in the manuscript
Gavage needles Instech FTP-18-50-50
ImageJ software n/a n/a used to extract fluorescence profile
Laminated ruler paper (prepared in-house) n/a n/a
Methyl cellulose (viscosity: 400 cP) Sigma M0262
Photoshop software Adobe n/a used for image processing
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran Sigma r8881-100mg "liquid" condition in the manuscript
Xenogen IVIS 200 Perkin Elmer 124262 In vivo imaging system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stevens, C. E., Hume, I. D. Comparative Physiology of the Vertebrate Digestive System. 2nd ed. , Cambridge University Press. (2004).
  2. Bayliss, W. M., Starling, E. H. The movements and innervation of the small intestine. The Journal of Physiology. 24 (2), 99-143 (1899).
  3. Husebye, E. The patterns of small bowel motility: physiology and implications in organic disease and functional disorders. Neurogastroenterology and Motility. (11), 141-161 (1999).
  4. Bush, T. G., et al. Effects of alosetron on spontaneous migrating motor complexes in murine small and large bowel in vitro. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 281 (4), 974-983 (2001).
  5. Der-Silaphet, T., et al. Interstitial cells of cajal direct normal propulsive contractile activity in the mouse small intestine. Gastroenterology. 114 (4), 724-736 (1998).
  6. Szurszewski, J. H. A migrating electric complex of the canine small intestine. American Journal of Physiology. 217 (6), 1757-1763 (1969).
  7. Deloose, E., et al. The migrating motor complex: control mechanisms and its role in health and disease. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 9 (5), 271-285 (2012).
  8. Johansoon, C., Ekelund, K. Relation between body weight and the gastric and intestinal handling of an oral caloric load. Gut. 17, 456-462 (1976).
  9. Sarna, S. K., et al. Spatial and temporal patterns of human jejunal contractions. American Journal of Physiology. 257 (1), 423-432 (1989).
  10. Hall, K. E., El-Sharkawy, T. Y., Diamant, N. E. Vagal control ofcanine postprandial upper gastrointestinal motility. American Journal of Physiology. 250, 501-510 (1986).
  11. Mayer, E. A. Gut feelings: the emerging biology of gut-brain communication. Nature Reviews Neuroscience. 12 (8), 453-466 (2011).
  12. Alcaino, C., et al. A population of gut epithelial enterochromaffin cells is mechanosensitive and requires Piezo2 to convert force into serotonin release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Sciences. 115 (32), 7632-7641 (2018).
  13. Kugler, E. M., et al. Mechanical stress activates neurites and somata of myenteric neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 342 (2015).
  14. Mazzuoli, G., Schemann, M. Mechanosensitive enteric neurons in the myenteric plexus of the mouse intestine. PloS One. 7 (7), 39887 (2012).
  15. Won, K. J., Sanders, K. M., Ward, S. M. Interstitial cells of Cajal mediate mechanosensitive responses in the stomach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (41), 14913-14918 (2005).
  16. Mao, Y., Wang, B., Kunze, W. Characterization of myenteric sensory neurons in the mouse small intestine. Journal of Neurophysiology. 96 (3), 998-1010 (2006).
  17. McIntyre, A., et al. Effect of bran, ispaghula, and inert plastic particles on gastric emptying and small bowel transit in humans: the role of physical factors. Gut. 40 (2), 223-227 (1997).
  18. Treichel, A. J., et al. Specialized mechanosensory epithelial cells in mouse gut intrinsic tactile sensitivity. Gastroenterology. 162 (2), 535-547 (2022).
  19. Bharucha, A. E., Anderson, B., Bouchoucha, M. More movement with evaluating colonic transit in humans. Neurogastroenterology and Motility. 31 (2), 13541 (2019).
  20. Camilleri, M., et al. Human gastric emptying and colonic filling of solids characterized by a new method. American Journal of Physiology. 257 (2), 284-290 (1989).
  21. Wang, D., et al. Trans-illumination intestine projection imaging of intestinal motility in mice. Nature Communications. 12 (1), 1682 (2021).
  22. Woting, A., Blaut, M. Small intestinal permeability and gut-transit time determined with low and high molecular weight fluorescein isothiocyanate-dextrans in C3H mice. Nutrients. 10 (6), 685 (2018).
  23. Miller, M. S., Galligan, J. J., Burks, T. F. Accurate measurement of intestinal transit in the rat. The Journal of Pharmacologial and Toxicological Methods. 6 (3), 211-217 (1981).
  24. Moore, B. A., et al. Inhaled carbon monoxide suppresses the development of postoperative ileus in the murine small intestine. Gastroenterology. 124 (2), 377-391 (2003).
  25. Machholz, E., et al. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  26. Baeyens, N., Schwartz, M. A. Biomechanics of vascular mechanosensation and remodeling. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 7-11 (2016).
  27. Ye, G. J., Nesmith, A. P., Parker, K. K. The role of mechanotransduction on vascular smooth muscle myocytes' cytoskeleton and contractile function. The Anatomical Record (Hoboken). 297 (9), 1758-1769 (2014).
  28. Mercado-Perez, A., Beyder, A. Gut feelings: mechanosensing in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. , 1-14 (2022).
  29. Brierley, S. M., et al. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
  30. Inoue, Y., et al. Diet and abdominal autofluorescence detected by in vivo fluorescence imaging of living mice. Molecular Imaging. 7 (1), 21-27 (2008).
  31. Szarka, L. A., Camilleri, M. Methods for the assessment of small-bowel and colonic transit. Seminars in Nuclear Medicine. 42 (2), 113-123 (2012).
  32. Padmanabhan, P., et al. Gastrointestinal transit measurements in mice with 99mTc-DTPA-labeled activated charcoal using NanoSPECT-CT. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 3 (1), 1-8 (2013).
  33. Jang, S. F., et al. Size discrimination in rat and mouse gastric emptying. Biopharmaceutics and Drug Disposition. 34 (2), 107-124 (2013).
  34. Zhu, Y. F., et al. Enteric sensory neurons communicate with interstitial cells of Cajal to affect pacemaker activity in the small intestine. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 446 (7), 1467-1475 (2014).
  35. Treichel, A. J., Farrugia, G., Beyder, A. The touchy business of gastrointestinal (GI) mechanosensitivity. Brain Research. 1693, 197-200 (2018).

Tags

Medicin udgave 181
Undersøgelse af Murine tyndtarmsmekanosensering af luminale partikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mercado-Perez, A., Wegner, A.,… More

Mercado-Perez, A., Wegner, A., Knutson, K., Zumchak, M., Beyder, A. Studying Murine Small Bowel Mechanosensing of Luminal Particulates. J. Vis. Exp. (181), e63697, doi:10.3791/63697 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter