Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

חקר מורין מעיים קטנים מכנוסנס של חלקיקים לומינליים

Published: March 18, 2022 doi: 10.3791/63697
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 3, 1,4
1Enteric NeuroScience Program (ENSP), Division of Gastroenterology & Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic, 2Medical Scientist Training Program (MSTP), Mayo Clinic, 3Easy Learning Labs, 4Department of Physiology & Biomedical Engineering (PBME), Mayo Clinic
* These authors contributed equally

Summary

כדי לחקור כיצד המעי הדק מטפל בחלקיקים בגדלים שונים, שינינו שיטת in vivo מבוססת כדי לקבוע את המעבר במעי הדק.

Abstract

תנועתיות במערכת העיכול (GI) חיונית לעיכול ולספיגה תקינים. במעי הדק, אשר סופג חומרים מזינים, תנועתיות מייעלת את העיכול והספיגה. מסיבה זו, חלק מדפוסי התנועתיות במעי הדק כוללים סגמנטציה לערבוב של תוכן לומינלי ופריסטלטיקה להנעתם. תכונות פיזיקליות של תוכן לומינלי מווסתות את דפוסי תנועתיות המעי הדק. הגירוי המכני של מעגלים מכנו-חושיים במערכת העיכול על ידי מעבר תוכן לומינלי ותנועתיות מעיים בסיסית יוזמים ומווסתים תבניות מוטוריות מורכבות של GI. עם זאת, המנגנונים המכנו-חושיים המניעים את התהליך הזה עדיין אינם מובנים כהלכה. זה נובע בעיקר ממחסור בכלים לנתח כיצד המעי הדק מטפל בחומרים בעלי תכונות פיזיקליות שונות. כדי לחקור כיצד המעי הדק מטפל בחלקיקים בגדלים שונים, שינינו שיטת in vivo מבוססת כדי לקבוע את המעבר במעי הדק. אנו מגדלים עכברים חיים עם נוזל פלואורסצנטי או חרוזים פלואורסצנטיים זעירים. לאחר 30 דקות, אנו מנתחים את המעיים כדי לדמות את התפלגות התוכן הפלואורסצנטי על פני כל מערכת העיכול. בנוסף למדידות ברזולוציה גבוהה של המרכז הגיאומטרי, אנו משתמשים במדידות בגדלים משתנים ובאנליזה ספקטרלית כדי לקבוע כיצד חומרים שונים משפיעים על מעבר המעי הדק. בחנו כיצד מנגנון "מגע במעיים" שהתגלה לאחרונה משפיע על תנועתיות המעי הדק בגישה זו.

Introduction

מערכת העיכול האנושית (GI) היא מערכת איברים באורך של מספר מטרים, בערך כמו צינור בעל ממדים שונים ותכונות פיזיות1. כאשר התכולה נעה לאורכה, תפקידה העיקרי של מערכת העיכול הוא לספוג חומרים חיוניים לחיים. המעי הדק אחראי באופן ספציפי לספיגת חומרים מזינים. המעבר במעי הדק מווסת באופן הדוק כדי להתאים לתפקודי העיכול והספיגה, וכתוצאה מכך נוצרים דפוסי תנועתיות שונים. בייליס וסטארלינג תיארו את "חוק המעי"2 בשנת 1899, והראו את תוכנית ההנעה ההתכווצותית במעי הידועה כיום כרפלקס פריסטלטי; הקטע הפרוקסימלי לבולוס המזון מתכווץ כדי להניע אותו קדימה, והקטע הדיסטלי נרגע לקבל אותו. בתיאוריה, תבנית זו לבדה יכולה להספיק כדי להעביר חומר באופן תמוה, אך למעלה ממאה שנים של מחקר ציירו תמונה מורכבת יותר של פעילות התכווצות במערכת העיכול. שלוש תקופות תנועתיות של המעי הדק מוכרות בבני אדם: קומפלקס המנועים הנודדים (MMC), תקופת הצום והתקופה שלאחר הלידה3. אותם דפוסים דווחו בעכברים 4,5. ה-MMC הוא תבנית מוטורית מחזורית הנשמרת ברוב היונקים 6,7. ל- MMC דפוס אופייני בן ארבעה שלבים המשמש סמן קליני שימושי בהפרעות GI תפקודיות7. ארבעת השלבים, לפי סדר ההתרחשות, הם (I) התכווצויות, (II) התכווצויות לא סדירות, משרעת נמוכה, (III) התכווצויות משרעת גבוהה רגילות, ו-(IV) תקופתירידה בפעילות 7. ה- MMC מסמן את התבנית המוטורית העיקרית של תקופת הצום3. MMCs של תקופת הצום לנקות את התוכן של המעי הדק לקראת הארוחה הבאה.

הדפוסים המוטוריים של התקופה שלאחר הלידה מותאמים לתפקודי העיכול והספיגה3. ללא קשר להרכב הקלורי, המעבר הראשוני מהיר לאורך המעי הדק, התוכן מתפשט לאורך המעי, והמעבר מאט לאחר מכן8. הספיגה ממוטבת על ידי הגדלת שטח הפנים במגע והאטתו כדי להאריך את זמן המגורים. ברגע שהחומרים המזינים נמצאים בתוך הלומן, התבנית הדומיננטית מורכבת מהתכווצויות קרובות (<2 ס"מ זו מזו) לא מתואמות (התכווצויות פילוח), עם כמה התכווצויות על גבי משרעת גדולה המשתרעות לכל אורך המעי הדק (התכווצויות פריסטלטיות)9. התכווצויות פילוח מערבבות את התכולה התוך-לומינלית במקום. התכווצויות פריסטלטיות גדולות מדי פעם מניעות את התוכן לכיוון המעי הגס.

עיתוי המעבר חזרה ל-MMCs תלוי בנפח המזון ובהרכב הקלורי10. לפיכך, המעי הדק דוגם רמזים לומינליים כדי לווסת מתי לעבור בין תקופות תנועתיות. רמזים מכניים, כגון תכונות פיזיקליות של תכולה לומינלית11, נפח לומינלי ומתח דופן, מעסיקים תאים מכנורצפטורים בקיר מערכת העיכול 12,13,14,15,16. ואכן, הגדלת המרכיב המוצק בארוחה מובילה לעלייה במעבר המעי הדק17. אנו משערים כי תכונות פיזיקליות, כגון המצב הנוזלי או המוצק של תוכן תוך-לומינלי, חייבות להעסיק מכנורצפטורים שונים בשל הכוחות השונים שהם מייצרים על קיר מערכת העיכול18.

תקן הזהב למדידת מעבר in vivo GI בבני אדם, כמו בעכברים, הוא השימוש בעוקבים רדיואקטיביים הנמדדים על ידי scintigraphy כשהם יוצאים מהקיבה או עוברים לאורך המעי הגס 19,20. ביונקים, לולאות המעי הדק בדרכים בלתי צפויות מה שמקשה על הדמיית in vivo באופן אמין, אך ההתקדמות נעשית21. יתר על כן, כיום חסרים כלים לכימות האופן שבו המעי הדק מטפל בחלקיקים בעלי תכונות וגדלים שונים. נקודת המוצא כאן הייתה טכניקה של תקן זהב שמתקננת את המחקר של מעבר מעי דק 22,23,24 ותפקוד מחסום 22. הוא מורכב מגידול עכברים עם חומר פלואורסצנטי, המתנה לתנועתיות של מערכת העיכול כדי להעביר את החומר, כריתת מערכת העיכול, פילוחו למספר חלקים מהקיבה ועד המעי הגס, חתך, והומוגניות של תוכן תוך-לומינלי לכימות פלואורסצנטי. עשינו שני שיפורים. ראשית, שינינו את ההרכב של תכולת ה-gavaged כך שיכלול חרוזים מיקרוסקופיים פלואורסצנטיים כדי לקבוע כיצד המעי הדק מפיץ חלקיקים פיזיים. שנית, שיפרנו את הרזולוציה המרחבית על ידי הדמיה של כל מערכת העיכול מהקיבה ועד המעי הגס, והשתמשנו בבינוי בגודל משתנה כדי לתקנן את הניתוח שלנו בין בעלי חיים. אנו מניחים כי זה חושף תובנות חדשות על האיזון של התכווצויות הנעה לעומת פילוח בשלב שלאחר הלידה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של מאיו קליניק.

1. התקנה

  1. צמו עכברים בני 8 עד 10 שבועות למשך 4 שעות. ספק לעכברים גישה למים.
    הערה: אנו משתמשים בעכברי C57BL/6J זכרים מסוג בר עבור כל הניסויים המוצגים כאן, אך ניתן לבצע אותם על עכברים מכל זן, מין וגנוטיפ.
  2. מצננים 15 מ"ל מים מזוקקים בצינור חרוטי של 50 מ"ל במקרר 4°C.
  3. מחממים עוד 15 מ"ל של מים מזוקקים בכוס באמצעות צלחת חמה עם מוט ערבוב מגנטי לכ-80-90 מעלות צלזיוס.
  4. מדוד 0.5% מתילצלולוז עבור סך של 30 מ"ל (0.15 גרם).
  5. הוסיפו בעדינות מתילצלולוז ל-15 מ"ל מים חמים כדי שלא יתגבשו. תמיסת המתיל צלולוז תהיה מעוננת במהלך תהליך זה.
  6. לאחר ההמסה, הסר את הכוס מהצלחת החמה והוסף את 15 מ"ל המים הצוננים לכוס החמה.
  7. מכניסים למקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שהתמיסה צלולה, כ-15-20 דקות.
  8. כאשר זה ברור, לשקול 3 מ"ג של רודמין איזותיוציאנט (RITC)-דקסטרן לכל 5 מ"ל של 0.5% מתילצלולוז פתרון ולערבב כדי לשלב. זהו מצב הנוזל במקטע תוצאות מייצגות .
    1. לחלופין, שקלו 25 מ"ג של מיקרוספרות פוליאתילן פלואורסצנטיות וערבבו עם 200 מיקרוליטר של תמיסת מתילצלולוז עד לשילוב טוב. שילוב יסודי של מיקרוספרות מובטח על ידי מערבולת לפני גבאג'. על הנסיין לדמיין התפלגות הומוגנית של מיקרוספרות תלויות בתערובת.
    2. מכיוון שתמיסת RITC-dextran רגישה לאור, יש לקרר את התמיסה. הכינו מראש את תמיסת RITC-dextran ואת תערובת המיקרו-שפרה והשתמשו תוך חודשיים. יש להשעות את תערובת המיקרוספרה לפני השימוש.
      הערה: מיקרוספרות בגדלים שונים משמשות לחקר טיפול במערכת העיכול בחומרים שונים. בסעיף תוצאות מייצגות , אנו מדגימים את תוצאות השימוש במיקרוספרות קטנות (קוטר: 75-90 מיקרומטר) וגדולות יותר (קוטר: 180-212 מיקרומטר).

2. מעטפת תוכן אינטרלומינלית

  1. הכן את המעטפת על ידי חיבור צינור הזנה של 18 Ga x 50 מ"מ למזרק של 1 מ"ל וציור 200 μL של תמיסת RITC או תמיסת מיקרוספרה.
  2. לרסן ידנית את החיה הצום באמצעות טכניקת הריסון ביד אחת25. עיין במידע של המוסד על טכניקות ריסון מורין נכונות.
  3. הכנס בעדינות את צינור ההזנה דרך הפה והוושט של העכבר עד שהוא נכנס לקיבה.
    הערה: שלב ה-gavage הוא קריטי לניסוי מוצלח. זה דורש ידיים מנוסות שיכולות להכניס את הצינור באופן עקבי בערך באותו מרחק בכל עכבר. שלב זה צריך להיות סטנדרטי על ידי נסיינים המבצעים את הפרוטוקול. אותו נסיינית צריך לגנות את כל קבוצות העכברים שיושוו זו לזו.
  4. לאט לאט לגרש את תוכן המזרק לתוך הבטן בזהירות להסיר את הצינור מן העכבר.
  5. לאחר הגבאג', החזירו את העכבר לכלוב.
  6. יש להשליך את צינור הגבאג'.
  7. חזרו על התהליך לפי הצורך עבור מספר בעלי החיים הרצוי.

3. דיסקציה של המעי

  1. לפני תחילת הנתיחות, הפעל את מכשיר ההדמיה in vivo כדי לאפשר לו להגיע לטמפרטורה.
  2. להקריב את העכבר 30 דקות לאחר gavage. השתמש בשאיפת פחמן דו חמצני כדי להקריב את העכבר, ואחריו פריקת צוואר הרחם כדי להבטיח המתת חסד מוצלחת.
  3. לאחר אישור המתת חסד מוצלחת, הניחו את העכבר במצב שכיבה על במת דיסקציה והצמידו את ארבעת הנספחים שלו על הבמה כדי לקבל גישה לבטן. הרטיבו את פני הבטן ב-70% אתנול כדי להרטיב את שערות הבטן.
  4. השתמש מלקחיים מיקרו דיסקציה כדי למשוך את העור לרכוש מספריים כירורגיים חדים לעשות חתך רוחבי 1 ס"מ מעל פי הטבעת. כדי לחשוף את החלל intraperitoneal, להמשיך את החתך אנכית במעלה הבטן עד כלוב הצלעות.
  5. הזיזו בעדינות את הצקום שמאלה עם מלקחיים מיקרו-דיסקציה כדי לחשוף את המעי הגס הדיסטלי.
  6. חותכים את המעי הגס הדיסטלי עם מספריים מיקרו-דיסקציה רק פרוקסימליים לפי הטבעת.
  7. יש לפרום בעדינות את המעי הגס, הצקום והמעי הדק על ידי משיכה איטית בכיוון ההפוך.
    הערה: שמירה על המעיים המנותקים במקטע רציף אחד תיצור את הקלות הרבה ביותר עבור החוקר. קרעים וקרעים לאורך הקטע יגרמו לשלבים הבאים להיות קשים יותר.
  8. השתמש מספריים מיקרו-דיסקציה כדי לחתוך פרוקסימלי לקיבה.
  9. השתמשו במלקחיים כדי להעביר את המעיים המנותקים לגיליון המדידה (איור 1). מניחים את הבטן על 0 מ"מ ומסדרים את המעיים לאורך הסרגל עד 200 מ"מ. השתמש מספריים מיקרו-דיסקציה כדי לחתוך ב 200 מ"מ. חזור על תהליך זה של יישור המעיים מ 0 מ"מ ל 200 מ"מ לאורך הסרגלים תוך שמירה על ביטחון כי הכיוון של המעיים לא להתבלבל.
    1. היזהרו להימנע ממתיחת המעיים תוך יישור הסרגלים.
  10. לאחר שהרקמה מסודרת על הסרגל, סדרו את הצקום כך שיהיה מקביל לרקמה אך לא במגע ישיר איתה (אם נמצא פלואורסצנטי כלשהו באזור זה, אזי יהיה צורך בהבדל ברור בין הצקום למעיים).
  11. הניחו את גיליון המדידה עם הרקמה המנותקת באזור חשוך, כך שניתן יהיה לשמר את הפלואורסצנטיות עד שיגיע הזמן לתמונה.

4. הדמיית אקס-ויוו

  1. פתח את תוכנת ההדמיה in vivo והיכנס.
  2. אתחל את מכשיר ההדמיה כך שיהיה מוכן לרכישת תמונה.
  3. הגדר את השדות 'עירור' ו'פליטה' לצבע המתאים המשמש לחרוז או ל- RITC gavage. אדום (נוזלי): עירור 535 ננומטר / פליטה 600 ננומטר. ירוק (מיקרוספרות): עירור 465 ננומטר / פליטה 520 ננומטר.
  4. הגדירו את החשיפה ל'אוטומטי'.
  5. בחר את שדה הראייה.
  6. לפני הכנסת גיליון המדידה למכשיר, ודא שהמעיים לא זזו במהלך ההובלה.
  7. מקם את גיליון המדידה במכשיר בתוך שדה הראייה.
  8. סגור היטב את דלת המכשיר ובחר Snapshot כדי לצלם את שדה הראייה.
  9. שמור את התמונות שנאספו בכונן הבזק לניתוח. שמור צילומים בודדים של תמונות הפלואורסצנט והצילום. שכבת-על של התצלום והפלואורסצנציה מציינת את מיקומו של חומר פלואורסצנטי במערכת העיכול (איור 1).
    הערה: אנו ממליצים לשמור את הקבצים בתבנית Tag Image File (.tif) לעיבוד במורד הזרם.

5. ניתוח

  1. פתח את קבצי התמונות הפלואורסצנטיים והתצלומים בתוכנה לעריכת תמונות.
  2. התאם את גודל הפיקסלים של שתי התמונות כך שיהיו להן מידות זהות בדיוק (המוסכמה שלנו הייתה להגדיר את שתי התמונות ל- 1280 פיקסלים על 850 פיקסלים [גובה x רוחב]).
  3. סגור את קובץ התצלומים. השלבים הבאים כוללים רק את התמונה הפלואורסצנטית.
  4. השתמשו בכלי מחק כדי להסיר את הרקע ולהפוך אותו לשקוף. ייתכן שיהיה צורך במחק כדי להסיר טלאים של הרקע הנותר.
  5. צרו שכבה חדשה. הפוך אותו לרקע שחור לחלוטין לאות הפלואורסצנטי. ניתן להשיג זאת על ידי בחירת מילוי שחור לשכבה וגרירת השכבה כך שתשכב מתחת לשכבה עם התמונה הפלואורסצנטית.
  6. שמור את התמונה הפלואורסצנטית החדשה, המכילה רק את האות הפלואורסצנטי על רקע שחור, כקובץ .tif חדש.
  7. פתח את תמונות הפלורסנט החדשות וצלם תמונות ב- ImageJ.
  8. הפוך כל תמונה לתמונה של 32 סיביות על-ידי בחירה באפשרות 'תמונה' > Type >- 32 סיביות.
  9. צרו תמונה ממוזגת של שניהם באמצעות בחירה באפשרות 'תמונה' > ' צבע' >'מיזוג ערוצים'. בתיבת הדו-שיח שנפתחת, בחרו בקובץ התצלום של הערוץ האפור ובקובץ הפלואורסצנט שמתחת לערוצים הצבעוניים.
  10. בטל את קנה המידה של התמונה הממוזגת על-ידי בחירה באפשרות נתח > קבע קנה מידה > לחץ כדי להסיר קנה מידה.
  11. בחרו בכלי "מלבן" ב-ImageJ.
  12. ציירו מלבן סביב קטע של המעי הדק. שים לב לרוחב של אזור עניין זה (ROI), כפי שהוא צריך להישאר קבוע בין כל ROIs. הערך הנומינלי אינו חיוני, רק שהוא נשמר עקבי בכל ה-ROIs המצוירים בתמונה זו [מאחר שהמעי הדק משתלט על פני מספר שורות, ROIs בודדים יימשכו מעל כל מקטע של המעי הדק בשורה אחרת (איור 1)]. איור 2 מציג את המיקום של ערך הרוחב בסרגל הכלים ImageJ.
  13. שכפל את החזר ההשקעה על-ידי בחירה באפשרות תמונה > שכפל. בחרו רק את הערוץ המתאים לערוץ הצבעוני.
  14. השתמשו שוב בכלי מלבן כדי לצייר החזר השקעה על התמונה החדשה.
  15. אחזר פרופיל של הפלואורסצנציה על-ידי בחירה באפשרות נתח > פרופיל העלילה. הגרף המתקבל מתווה על ציר y את העוצמה הממוצעת עבור כל פיקסל לאורך ההחזר על ההשקעה. זה נבחר בשלב 5.12 להיות אורך החלק המנותח של המעי הדק
  16. פתח את רשימת הערכים והעתק אותם לתוכנת גיליון אלקטרוני.
  17. חזור על שלבים 5.12-5.16 עבור כל מקטע של המעי הדק בשורה אחרת בסרגל. המשך להדביק את הערכים באותו קובץ גיליון אלקטרוני באופן מיידי תחת כל קבוצת ערכים קודמת, כך שכל השורות הרציפות בעמודה זו יכילו את ערך העוצמה הממוצע לכל אורך המעי הדק.
  18. בתוכנת הגיליון האלקטרוני, הכפל כל ערך עוצמה ממוצעת ברוחב הקבוע של מלבן ההחזר על ההשקעה שנוצר בשלב 5.12. זה יניב את ערך העוצמה האמיתי לאורך המעי הדק בכל נקודה.
    הערה: לבעלי חיים שונים יהיו שינויים קלים באורך המעי הדק. כדי למנוע מהבדלי האורך להשפיע על התוצאות של ניתוח נתונים במורד הזרם, יש לאגד את מחרוזת ערכי העוצמה למספר עקבי של פחים בכל דגימות הניסוי (איור 3, איור 4 ואיור 5 מציגים תוצאות עבור שלושה גדלי סלים).
  19. חלק את מספר ערכי העוצמה במספר הפחים הרצויים. המנה המתקבלת S קובעת את מספר ערכי העוצמה הכלולים בכל סל.
  20. קבע את הסל שאליו יעבור כל ערך עוצמה גולמית באמצעות נוסחת עיגול. שלב זה ממקם כל ערך עוצמה גולמית בפח. כל ערך עוצמה גולמי מאונדקס באופן כרונולוגי עם המספר השלם N. המנה N/S קובעת את מספר הסל המוקצה לכל ערך גולמי. נוסחת העיגול אמורה לעגל מנה זו למספר שלם ללא מספרים עשרוניים.
  21. צור את הערך עבור כל סל באמצעות נוסחת averageif. המטרה היא לממוצע את הערכים הגולמיים שהוקצו לסל מסוים בשלב 5.20. לפיכך, הארגומנטים בנוסחה צריכים להיות: (1) סלים מוקצים שנוצרו בשלב 5.20, (2) מספר סל, (3) ערכי עוצמה גולמית.
    הערה: הניתוח הראשון שאנו יכולים לבצע על הנתונים המאוגדים הוא ניתוח מרכז גיאומטרי, אשר מכמת עד כמה אנו רואים את עוצמת הפלואורסצנט הגבוהה ביותר לאורך המעי הדק (איור 4).
  22. נרמל כל ערך עוצמה מעל עוצמת הפלואורסצנט הכוללת. במילים אחרות, חלקו כל ערך עוצמה בסכום כל העוצמות.
  23. הכפל כל ערך מנורמל במספר הסל. המכפלה משקפת את המשקל היחסי של כל פח, ותורמת לעוצמת הפלואורסצנט הכוללת.
  24. חיבור כל הערכים הנוצרים בשלב 5.23 מניב את מספר הסל במרכז האות הפלואורסצנטי. חלקו במספר הפחים כדי לבטא את המרכז הגיאומטרי כשחלק המעי הדק נע על ידי המרכז הפלואורסצנטי.
    הערה: כדי לשקף את ההתפלגות המרחבית של האות, השלב הבא הוא ליצור את ספקטרום ההספק של מערך נתוני העוצמה המשולבת (איור 5).
  25. פתח אשף התמרת פורייה מהירה (FFT) בתוכנת הגיליון האלקטרוני. בחר את הקלט כערכת הנתונים המאוגדת ואת הפלט כערכה ריקה של אותו מספר שורות כמו סלים.
  26. חלץ את רכיב הערך האמיתי של ה- FFT.
  27. העלה כל ערך אמיתי של ה- FFT לכוח השני. זה מניב מערך נתונים של ספקטרום הספק.
  28. בחר את המחצית הראשונה של ערכת הנתונים של ספקטרום העוצמה והזז אותה כך שהיא תהיה מתחת למחצית השנייה. יש לכך השפעה של מרכוז ספקטרום ההספק סביב התדר המרכזי כאשר הוא מתווה בשלב הבא.
  29. התווה את ספקטרום העוצמה על ציר y של גרף x-y שבו ערכי ציר ה-x הם הטווח שבין -1 x (מספר הסלים/2) ל-(מספר הסלים/2) -1. במקרה של 1000 סלים, ערכי הציר ינועו בין -500 ל-499.
  30. יש להשוות את ספקטרום ההספק עבור כל חיה על בסיס התפשטות פסגות שאינן אפס והגבהים של פסגות אלה שאינן אפס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנו מציגים תוצאות מייצגות משלב 3 ואילך. איור 1 מראה את המעיים המושתלים השלמים, עם מדידות פלואורסצנטיות מעליהן. הקיבה (סגולה) מונחת לאורך אותו ציר כמו המעי הדק (כתום), אך אנו מעדיפים להזיז את הצקום (כחול) לצד כדי למנוע חפיפה עם המעי הגס (כתום). כפי שמעידים בלוח השמאלי, זה לא תמיד אפשרי בגלל גודל האיבר. אנחנו חותכים את המעי הדק ב~200 מ"מ כדי למקסם את הכיסוי של מקטעים רציפים, אבל זה לא תמיד אפשרי בגלל מזנטריה המגבילה את היכולת לפתוח את המעיים, ואת ההעדפה שלנו לא לחתוך דרך מבנים כמו גלולות פלואורסצנטיות או cecum. העוצמה האדומה בפאנל השמאלי של איור 1 והעוצמות הירוקות של הלוחות האמצעיים והימניים ממוינות לפחים בגדלים שונים כדי ליצור איור 3. רק את העוצמות בתוך ROIs כתום (המעי הדק) מופקים לניתוח. האורך המלא של המעי הדק (כל ROI כתום בכל פאנל) מופק לניתוח. ה-ROIs הכתומים הם באותו רוחב, כפי שמוצג ב-ImageJ (איור 2). הם תפורים יחד על ידי הצבת כל העוצמות ברצף לפני ההצמדה. איור 3 מראה את העקבות הפלואורסצנטיים הממוצעים ± SEM לקבוצה; ראה מקרא איור לפרטים.

שני הנתונים האחרונים מדגימים את תוצאות הניתוחים: מרכז גיאומטרי וספקטרום הספק. המרכז הגיאומטרי מודד את המיקום הממוצע של האותות הפלואורסצנטיים באיור 3, ושוקל את הממוצע לפי עוצמת האות של כל פח. לפיכך, פסגות גבוהות יותר בעקבות מושכות את הממוצע קרוב יותר למיקום של אותה פסגה. המרכז הגיאומטרי אינו מצליח לאפיין לחלוטין את ההתפלגות המרחבית של התוכן התוך-לומינלי. לדוגמה, ניתן לקבל את אותו מרכז גיאומטרי מבולוס המרוכז בנקודה אחת ואות מתפשט שמרכזו סביב אותה נקודה. מגבלה זו של מדידת המרכז הגיאומטרי ניכרת בהשוואה בין נוזלים לחרוזים גדולים יותר (איור 3 ואיור 4). רוב עקבות הפלואורסצנט הנוזלי מרוכזים סביב שתי פסגות מוקדמות, בעוד שהחרוזים הגדולים יותר מראים פסגות מרובות לכל אורכו של המעי הדק (איור 3, לוחות שמאליים וימניים). העקבות הפלואורסצנטיים של החרוזים הגדולים יותר מפוזרים יותר, אך הממוצע שלו מגיע לנקודה דומה לזו של הנוזל, ללא קשר לגרעיניות המתמזגת, מה שמדגיש את המגבלה של התמקדות אך ורק במרכז הגיאומטרי (איור 4). כדי להסביר את האופי החלוקתי של התכווצויות המעי הדק, שילבנו ניתוח ספקטרלי של הספק בפרוטוקול. ניתוח ספקטרום ההספק פועל על ידי פירוק התפלגות הפלואורסצנטיות במרחב למספר עקומות סינוסואידיות בתדרים מרחביים שונים. כל תדר מרחבי משקף את המרחק בין שתי נקודות שנבחרו באקראי בעקבות הפלואורסצנציה. חלק מהמרחקים הללו מתרחשים בתדירות גבוהה יותר מאחרים, ולכן לכל אחד מהם מיוחס כוח (כוח). העוצמה מתואמת עם התדירות שבה שתי נקודות אקראיות מופרדות על ידי מרחק זה. על-ידי התוויית ספקטרום ההספק (איור 5), אנו יכולים להדגים כמה תדרים מרחביים תורמים לאות הנמדד (התפשטות הספקטרום) ולהשוות את העוצמה היחסית של התרומות האלה (גובה הספקטרום). זה מאפשר לנו לתאר באופן כמותי את התפשטות הפלואורסצנציה לאורך מערכת העיכול.

Figure 1
איור 1. המעיים המנותקים נכרתים ומונחים על נייר סרגל למינציה לפני הצילום ומדידת הפלואורסצנציה. עוצמת הפלואורסצנציה היא שכבת-על ופסאודו-צבעונית כדי להתאים לפלואורסצנטיות הטבעית של החומר הגלותי. משמאל: רודאמין איזותיוציאנט נוזלי (RITC) פלואורסצנטי בספקטרום האדום; באמצע: קטן (קוטר: 75-90 מיקרומטר), וימין: גדול יותר (קוטר: 180-212 מיקרומטר) חרוזים שניהם פלואורסצנטיים בספקטרום הירוק. קופסאות סגולות, כתומות, כחולות וורודות מקיפות אזורי עניין (ROIs) בקיבה, במעי הדק, בצקום ובמעי הגס בכל דגימה, בהתאמה. הרוחב של כל החזר השקעה נשמר עקבי בין שורות כדי למנוע בלבול בעת חישוב עוצמת הפלואורסצנציה הגולמית במהלך ניתוח במורד הזרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2. מיקום אזור רוחב העניין (בפיקסלים) בסרגל הכלים ImageJ (קו תחתון צהוב). כדי לחזור ולהדגיש, הרוחב מוצג בפיקסלים רק אם קנה המידה הוסר (שלב 5.10). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3. עקבות פלואורסצנטיות לאורך המעי הדק. קו מציין את הפלואורסצנטיות הממוצעת בסל נתון. האזור המוצלל מציין את שגיאת התקן של הממוצע (SEM). התפלגות החומר הפלואורסצנטי משתנה בהתאם לתכונות החומר של התוכן התוך-לומינלי (עמודות). משמאל: נוזל (n = 7 עכברים) התפלגות על פני כמה מקטעי מעי דק 30 דקות לאחר gavage. באמצע ומימין: חרוזים קטנים (n = 6 עכברים) וגדולים יותר (n = 5 עכברים) מפוזרים בצורה רחבה יותר לאורך המעי הדק 30 דקות לאחר ההגייה. הגדלת מספר הפחים המשמשים למיון אותן ערכות נתונים גולמיות חושפת תכונות מעקב פרטניות שאינן ניתנות לפתרון עם פחות סלים (שורות). פחים קטנים יותר מפחיתים את אי-הוודאות במדידה, מגדילים את הרזולוציה המרחבית ומשקפים טוב יותר את המרכיב החלוקתי של התכווצויות המעי הדק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
תרשים 4. המרכז הגיאומטרי של התפלגות הפלואורסצנטיות במעי הדק 30 דקות לאחר ההגה עם RITC נוזלי, חרוזים קטנים (75-90 מיקרומטר) וחרוזים גדולים יותר (180-212 מיקרומטר) (ממוצע ± SEM, n = 7, n = 6, n = 5, ANOVA חד כיווני עם תיקון בונפרוני). גודל הפח אינו משפיע על פרשנות המעבר לפיה חרוזים קטנים מועברים באופן דיסטלי יותר מנוזלים 30 דקות לאחר ההטלה, אך החרוזים הגדולים יותר מפוזרים באופן כה נרחב עד שאין הבדלים משמעותיים במרכז הגיאומטרי שלהם בהשוואה הן לנוזלים והן לחרוזים קטנים (*P < 0.05. ns = לא מובהק סטטיסטית). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5. ספקטרום הספק מסווג לפי תכונות חומר (עמודות) וגודל סל (שורות). השיפורים ברזולוציה המרחבית והשילוב הקטן יותר ניכרים. בשורה העליונה: ניתן להבחין בהבדלים מעטים בספקטרום הרחב. שורה תחתונה: ככל שגודל הפחים מצטמצם, אנו יכולים להעריך תדרים דומיננטיים משמעותיים הקיימים בספקטרום החרוזים הגדול יותר, אך לא בספקטרום של החרוזים הקטנים. חלק מאותם תדרים דומיננטיים נוספים, אך לא כולם, נמצאים בספקטרום הנוזלי. באמצעות ספקטרום השורה התחתונה, אנו יכולים להשוות לעקבות הפלואורסצנטיים באיור 3. באיור 3, עקבות הפלואורסצנט הנוזלי מציגים שתי פסגות בולטות, אשר מתואמות עם כמה פסגות דומיננטיות בספקטרום ההספק. עקבות החרוזים הקטנים באיור 3 מציגים שיא דומיננטי יחיד, אשר נמצא בקורלציה עם שיא דומיננטי יחיד בספקטרום ההספק. עקבות החרוזים הגדולים יותר באיור 3 מציגים פסגות דומיננטיות יותר. בהתאם לכך, ספקטרום ההספק מראה מספר גדול יותר של תדרים דומיננטיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מערכת העיכול, כמו איברים צינוריים אחרים, כגון כלי דם, דורשת חיישנים מכניים ואפקטים כדי לשמור על הומאוסטזיס26,27,28. עם זאת, מערכת העיכול ייחודית בכך שהתכונות הפיזיקליות של החומרים החוצים אותה אינן קבועות לאורך ארוחות. תכולה תוך-גופית בעלת תכונות פיזיקליות שונות (מוצק, נוזל וגז) עוברת במעיים, ומייצרת תשומות מכניות שונות למכנורצפטורים של מערכת העיכול. ואכן, גירויים מכניים שונים במעי הגס חשים ומועברים על ידי מסלולים שונים29.

פרוטוקול זה נגיש מבחינה טכנית לכל מי שמבצע עבודת עכבר שגרתית, אך כמה שלבים קריטיים דורשים תשומת לב רבה. אנו מוצאים שעכברים בצום חשובים לפני תחילת המחקר, שכן הם מסירים את התרומה מארוחות קודמות ומדללים את האות הפלואורסצנטי. יתר על כן, עכברים שניזונו מתזונה סטנדרטית מפגינים פלואורסצנטיות תוך-לומינלית ממרכיבי התזונה, במיוחד מרכיב הכלורופיל30. על ידי צום ובחירת פלואורופור, אנו מונעים מפלואורסצנציה של צ'או להפריע לתנאים המבוקרים של הניסויים המפורטים בפרוטוקול זה. אנו ממליצים לנסיינים לאשר באופן עצמאי שתקופת הצום שנבחרה מספיקה כדי למנוע פלואורסצנטיות לא ספציפית במעי הדק, מכיוון שהיא עשויה להשתנות לפי זן, גיל או מין. הנסיין צריך להעריך באופן חזותי את ההתפלגות ההומוגנית של התוכן הגבי. אחרת, תהיה אי ודאות במסירתם ובתוצאות המחקר. Gavages צריך להתבצע באופן עקבי על ידי אותו נסיינית, רצוי מישהו שפיתח ניסיון עם הטכניקה. הנסיין צריך לשאוף להעברה עקבית של תוכן לקיבה. מציאת פלואורסצנציה בוושט או אך ורק בקיבה הם עילה להוציא בעל חיים מהניתוח, שכן לא ברור אם למעי הדק הייתה גישה זהה לתוכן הגנוז. לאחר ההמתנה, ניתן לקצר את זמני ההמתנה ל-15 דקות או להאריך אותם ל-90 דקות, תלוי אם שלבי המעבר המוקדמים או המאוחרים מעניינים22. הפרוטוקול המקורי שהשתמש ב-gavage נוזלי הראה שרוב החומר שוכן במעי הדק לאחר 30 דקות. יתר על כן, בעוד שזה קריטי לעבוד עם חיפזון במהלך שלב הנתיחה, יש להיזהר לא להפריע את המיקום של התוכן intraluminal ולא לקרוע את מערכת העיכול.

פרוטוקול זה התפתח מגישות שפורסמו בעבר, אשר קשרו פיזית את המעי הדק על ידי חיתוך שלו לחמישה עד עשרה מקטעים ותוכן תוך-לומינלי הומוגני לפני מדידת פלואורסצנציה/רדיואקטיביות22,23,24. הגישה הקודמת הייתה משמעותית משום שהיא קבעה סטנדרטיזציה של מדידת המעבר במעי הדק. המעי הדק ידוע לשמצה בתבניות מסובכות ובלתי צפויות בתוך חלל הבטן. מחקרי מעבר מבוססי הדמיה הם מאתגרים ללא קשר למינים31,32. בעוד שהפרוטוקול שלנו נותר ניסוי סופני שלא ניתן להרחיבו לבני אדם, אנו משפרים משמעותית את הרזולוציה המרחבית, ומנצלים את השיפור הזה כדי לפתור מעברים אזוריים ולתרגם אותם למדידה בלתי משוחדת של התפשטות בתוך המעי הדק (ספקטרום הכוח).

בפרוטוקול זה, הרזולוציה המרחבית מוגבלת על ידי רזולוציית המצלמה במערכת ההדמיה. מאחר שבינינג מנרמל את אורך המעי הדק על פני בעלי חיים, אנו יכולים להשוות ישירות את המיקום הממוצע של התוכן התוך-לומינלי. איור 3 מדגים בבירור את ההחלקה הדרסטית, את אי-הוודאות המוגברת ואת הרזולוציה המופחתת כתוצאה מגודל פח גדול. המרכז הגיאומטרי מכמת את המרכז הפלואורסצנטי לאורך מערכת העיכול (איור 4). כצפוי, מדידה זו אינה מושפעת באופן משמעותי מגודל הפח. ספקטרום העוצמה הוא שיטה בלתי משוחדת ומשלימה המתקננת את ניתוח הפסגות וההתפשטות בעקבות הפלואורסצנטיות של איור 3. שיפור הרזולוציה משפר את הספקטרום המחושב, ומאפשר להדגים הבדלים נראים לעין בין עקבות פלואורסצנטיים (איור 5). ברזולוציה נמוכה (10 סלים), יהיה קשה להבחין בין נוזלים לחרוזים גדולים יותר, בין אם על ידי המרכז הגיאומטרי או הערכות הספקטרום, למרות שברור מהתבוננות על עקבות הפלואורסצנט שהם אינם מפוזרים באופן דומה במרחב. ברזולוציה גבוהה יותר (1000 פחים), המרכזים הגיאומטריים עדיין דומים (בשל העובדה שהמרכז הגיאומטרי הוא מדידה ממוצעת), אך ניתן להשתמש בספקטרום ההספק באופן אמין כדי להבדיל בין שתי הקבוצות. ראוי לציין כי עקבות הפלואורסצנט מקובלים על סוגים אחרים של ניתוחים, כגון מדידות מובילות. ניתן להשתמש בשינויים הצפויים במרכז הגיאומטרי במהלך חישובי גודל המדגם לפני תחילת הניסויים. בידיעה שלנוזלים יש מרכז גיאומטרי של כ-0.4-0.518, השתמשנו בלפחות חמישה עכברים בכל קבוצה כדי לפתור סטטיסטית שינויים של עד 45%.

הרחבנו את ההיקף והשתמשנו בפרוטוקול זה כדי לחקור את המעבר של מוצקים בתוך המעי הדק. בדומה לנוזלים, הכנסנו את המיקרוספרות המוצקות לתוך הקיבה. הסוגר הפילורי ממוקם במעבר הקיבה-המעי הדק. סוגר זה פועל כמסנן אי-הכללת גודל. בעכברים, חתך הגודל הוא ~300 מיקרומטר, כאשר חלקיקים <300 מיקרומטר לא נתקלים בהתנגדות בכניסה למעי הדק33, אך גישה זו פועלת גם עם חלקיקים מעט גדולים יותר בהם השתמשנו במחקר שנערך לאחרונה18. בחרנו את גדלי המיקרוספרה שלנו כאן כדי לספק מגוון גדלים המשלימים את המחקר האחרון. השתמשנו בשני תכשירי חרוזים פלואורסצנטיים מסחריים בקטרים של 75-90 מיקרומטר ו-180-212 מיקרומטר. איור 1 מראה צפיפות פלואורסצנטית דומה ופרופילים דומים בקיבה על פני קבוצות, מה שמצביע על כך שלא נוזלים ולא חלקיקים נשמרים באופן דיפרנציאלי על ידי הקיבה. הנתונים המקוריים המוצגים כאן מדגימים כיצד המעי הדק של עכברים מסוג בר מטפל בנוזלים ובמוצקים מיקרוסקופיים באופן שונה. עד כה השתמשנו בחרוזים בטווח גודל אחד לכל ניסוי עצמאי. מחקרים עתידיים יוכלו להתמקד באופן הטיפול בתערובות של חלקיקים בגדלים שונים, ובערבוב נוזלים פלואורסצנטיים בעלי תכונות פיזיקליות שונות עם חרוזים פלואורסצנטיים כדי לקבוע כיצד תערובות צ'ים מציאותיות יותר מטופלות על ידי המעי הדק.

הבדלי ההתפלגות המדווחים כאן מצביעים על הבדל בדפוסי התנועתיות המופעלים על ידי חומרים בעלי תכונות שונות. אנו מניחים כי האיזון של פילוח לעומת התכווצויות הנעה קובע כמה רחוק וכמה הומוגני חומרים עוברים את המעי הדק. המרכז הגיאומטרי של חרוזים קטנים נמצא רחוק יותר לאורך המעי הדק בהשוואה לנוזלים, מה שמרמז על כך שחלקיקים מוצקים קטנים מפעילים התכווצויות הנעה. מצד שני, בעוד שהמרכז הגיאומטרי של חרוזים גדולים יותר דומה לנוזל, ניתוח ספקטרלי מראה הבדלים משמעותיים בהתפלגות המרחבית, שיכולים להיות תוצאה של יותר התכווצויות סגמנטיות בסביבת החרוזים הגדולה יותר. אנו משערים כי המעי הדק משתמש בהבחנה בגודל, סוג של מעגל מכנו-חושי, כאחת התשומות המזינות את ההחלטה על האיזון בין סוגי הכיווץ. לדוגמה, נוירונים מסוג Dogiel II הם נוירונים מכנו-חושיים המשערים כי הם ממלאים תפקיד בהכוונת המעבר מהנעה להתכווצויות סגמנטציה16,34. השערות מסקרנות אלה דורשות מחקר נוסף כדי לקבוע את המנגנונים שבאמצעותם מערכת העיכול חשה תכונות פיזיקליות ומתמרת אותן לתפוקות פיזיולוגיות כגון התכווצויות.

אנו מאמינים שפרוטוקול זה יעזור ככלי נוסף לגשר על הפער בין מולקולות לתאים לתפקוד האיברים. זיהינו כי מכנורצפטורים של אפיתל במערכת העיכול חולקים דמיון התפתחותי ומבני עם מכנורצפטורים בעור35. באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל, עזרנו להדגים את התפקיד החושי של "מגע במעיים" שבו המכנורפטורים האפיתליאליים האלה של מערכת העיכול חשים גירויים מכניים קלים ומשתתפים ברגישות מישושית פנימית18. אנו צופים כי פרוטוקול זה יועיל באופן דומה לחקר האופן שבו מעגלים חושיים אחרים תורמים למעבר במעי הדק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ללא.

Acknowledgments

אנו מודים לגברת לינדזי באזבי על הסיוע האדמיניסטרטיבי ולמר ג'ואל פינו על התמיכה התקשורתית. מענקי NIH תמכו בעבודה זו: DK123549, AT010875, DK052766, DK128913, ומרכז מאיו קליניק לאיתות תאי בגסטרואנטרולוגיה (DK084567).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664 other mice can be used with this protocol
Dissection tools n/a n/a
Excel software Microsoft n/a used for spreadsheet analysis
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g Cospheric UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g "smaller beads" in the manuscript
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g Cospheric UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g "larger beads" in the manuscript
Gavage needles Instech FTP-18-50-50
ImageJ software n/a n/a used to extract fluorescence profile
Laminated ruler paper (prepared in-house) n/a n/a
Methyl cellulose (viscosity: 400 cP) Sigma M0262
Photoshop software Adobe n/a used for image processing
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran Sigma r8881-100mg "liquid" condition in the manuscript
Xenogen IVIS 200 Perkin Elmer 124262 In vivo imaging system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stevens, C. E., Hume, I. D. Comparative Physiology of the Vertebrate Digestive System. 2nd ed. , Cambridge University Press. (2004).
  2. Bayliss, W. M., Starling, E. H. The movements and innervation of the small intestine. The Journal of Physiology. 24 (2), 99-143 (1899).
  3. Husebye, E. The patterns of small bowel motility: physiology and implications in organic disease and functional disorders. Neurogastroenterology and Motility. (11), 141-161 (1999).
  4. Bush, T. G., et al. Effects of alosetron on spontaneous migrating motor complexes in murine small and large bowel in vitro. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 281 (4), 974-983 (2001).
  5. Der-Silaphet, T., et al. Interstitial cells of cajal direct normal propulsive contractile activity in the mouse small intestine. Gastroenterology. 114 (4), 724-736 (1998).
  6. Szurszewski, J. H. A migrating electric complex of the canine small intestine. American Journal of Physiology. 217 (6), 1757-1763 (1969).
  7. Deloose, E., et al. The migrating motor complex: control mechanisms and its role in health and disease. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 9 (5), 271-285 (2012).
  8. Johansoon, C., Ekelund, K. Relation between body weight and the gastric and intestinal handling of an oral caloric load. Gut. 17, 456-462 (1976).
  9. Sarna, S. K., et al. Spatial and temporal patterns of human jejunal contractions. American Journal of Physiology. 257 (1), 423-432 (1989).
  10. Hall, K. E., El-Sharkawy, T. Y., Diamant, N. E. Vagal control ofcanine postprandial upper gastrointestinal motility. American Journal of Physiology. 250, 501-510 (1986).
  11. Mayer, E. A. Gut feelings: the emerging biology of gut-brain communication. Nature Reviews Neuroscience. 12 (8), 453-466 (2011).
  12. Alcaino, C., et al. A population of gut epithelial enterochromaffin cells is mechanosensitive and requires Piezo2 to convert force into serotonin release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Sciences. 115 (32), 7632-7641 (2018).
  13. Kugler, E. M., et al. Mechanical stress activates neurites and somata of myenteric neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 342 (2015).
  14. Mazzuoli, G., Schemann, M. Mechanosensitive enteric neurons in the myenteric plexus of the mouse intestine. PloS One. 7 (7), 39887 (2012).
  15. Won, K. J., Sanders, K. M., Ward, S. M. Interstitial cells of Cajal mediate mechanosensitive responses in the stomach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (41), 14913-14918 (2005).
  16. Mao, Y., Wang, B., Kunze, W. Characterization of myenteric sensory neurons in the mouse small intestine. Journal of Neurophysiology. 96 (3), 998-1010 (2006).
  17. McIntyre, A., et al. Effect of bran, ispaghula, and inert plastic particles on gastric emptying and small bowel transit in humans: the role of physical factors. Gut. 40 (2), 223-227 (1997).
  18. Treichel, A. J., et al. Specialized mechanosensory epithelial cells in mouse gut intrinsic tactile sensitivity. Gastroenterology. 162 (2), 535-547 (2022).
  19. Bharucha, A. E., Anderson, B., Bouchoucha, M. More movement with evaluating colonic transit in humans. Neurogastroenterology and Motility. 31 (2), 13541 (2019).
  20. Camilleri, M., et al. Human gastric emptying and colonic filling of solids characterized by a new method. American Journal of Physiology. 257 (2), 284-290 (1989).
  21. Wang, D., et al. Trans-illumination intestine projection imaging of intestinal motility in mice. Nature Communications. 12 (1), 1682 (2021).
  22. Woting, A., Blaut, M. Small intestinal permeability and gut-transit time determined with low and high molecular weight fluorescein isothiocyanate-dextrans in C3H mice. Nutrients. 10 (6), 685 (2018).
  23. Miller, M. S., Galligan, J. J., Burks, T. F. Accurate measurement of intestinal transit in the rat. The Journal of Pharmacologial and Toxicological Methods. 6 (3), 211-217 (1981).
  24. Moore, B. A., et al. Inhaled carbon monoxide suppresses the development of postoperative ileus in the murine small intestine. Gastroenterology. 124 (2), 377-391 (2003).
  25. Machholz, E., et al. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  26. Baeyens, N., Schwartz, M. A. Biomechanics of vascular mechanosensation and remodeling. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 7-11 (2016).
  27. Ye, G. J., Nesmith, A. P., Parker, K. K. The role of mechanotransduction on vascular smooth muscle myocytes' cytoskeleton and contractile function. The Anatomical Record (Hoboken). 297 (9), 1758-1769 (2014).
  28. Mercado-Perez, A., Beyder, A. Gut feelings: mechanosensing in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. , 1-14 (2022).
  29. Brierley, S. M., et al. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
  30. Inoue, Y., et al. Diet and abdominal autofluorescence detected by in vivo fluorescence imaging of living mice. Molecular Imaging. 7 (1), 21-27 (2008).
  31. Szarka, L. A., Camilleri, M. Methods for the assessment of small-bowel and colonic transit. Seminars in Nuclear Medicine. 42 (2), 113-123 (2012).
  32. Padmanabhan, P., et al. Gastrointestinal transit measurements in mice with 99mTc-DTPA-labeled activated charcoal using NanoSPECT-CT. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 3 (1), 1-8 (2013).
  33. Jang, S. F., et al. Size discrimination in rat and mouse gastric emptying. Biopharmaceutics and Drug Disposition. 34 (2), 107-124 (2013).
  34. Zhu, Y. F., et al. Enteric sensory neurons communicate with interstitial cells of Cajal to affect pacemaker activity in the small intestine. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 446 (7), 1467-1475 (2014).
  35. Treichel, A. J., Farrugia, G., Beyder, A. The touchy business of gastrointestinal (GI) mechanosensitivity. Brain Research. 1693, 197-200 (2018).

Tags

רפואה גיליון 181
חקר מורין מעיים קטנים מכנוסנס של חלקיקים לומינליים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mercado-Perez, A., Wegner, A.,… More

Mercado-Perez, A., Wegner, A., Knutson, K., Zumchak, M., Beyder, A. Studying Murine Small Bowel Mechanosensing of Luminal Particulates. J. Vis. Exp. (181), e63697, doi:10.3791/63697 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter