Summary
Om te bestuderen hoe de dunne darm omgaat met deeltjes van verschillende groottes, hebben we een gevestigde in vivo methode aangepast om de doorvoer van de dunne darm te bepalen.
Abstract
Gastro-intestinale (GI) motiliteit is van cruciaal belang voor een normale spijsvertering en absorptie. In de dunne darm, die voedingsstoffen absorbeert, optimaliseert beweeglijkheid de spijsvertering en absorptie. Om deze reden omvatten sommige van de beweeglijkheidspatronen in de dunne darm segmentatie voor het mengen van luminale inhoud en peristaltiek voor hun voortstuwing. Fysische eigenschappen van luminale inhoud moduleren de patronen van dunne darmmotiliteit. De mechanische stimulatie van GI-mechanosensorische circuits door luminale inhoud en onderliggende darmmotiliteit initiëren en moduleren complexe GI-motorpatronen. Toch blijven de mechanosensorische mechanismen die dit proces aansturen slecht begrepen. Dit is voornamelijk te wijten aan een gebrek aan hulpmiddelen om te ontleden hoe de dunne darm omgaat met materialen met verschillende fysieke eigenschappen. Om te bestuderen hoe de dunne darm omgaat met deeltjes van verschillende groottes, hebben we een gevestigde in vivo methode aangepast om de doorvoer van de dunne darm te bepalen. We vangen levende muizen met fluorescerende vloeistof of kleine fluorescerende kralen. Na 30 minuten ontleden we de darmen om de verdeling van fluorescerende inhoud over het hele maagdarmkanaal in beeld te brengen. Naast metingen met hoge resolutie van het geometrische centrum, gebruiken we binning van variabele grootte en spectrale analyse om te bepalen hoe verschillende materialen de doorvoer van de dunne darm beïnvloeden. We hebben onderzocht hoe een recent ontdekt "darmaanraking" -mechanisme de beweeglijkheid van de dunne darm beïnvloedt met behulp van deze aanpak.
Introduction
Het menselijke maagdarmkanaal (GI) is een orgaansysteem van meerdere meters lang, ruwweg benaderd als een buis van verschillende afmetingen en fysieke eigenschappen1. Naarmate de inhoud door de lengte beweegt, is de primaire functie van het maagdarmkanaal het absorberen van stoffen die van cruciaal belang zijn voor het leven. De dunne darm is specifiek verantwoordelijk voor de opname van voedingsstoffen. De transit van de dunne darm is strak gereguleerd om overeen te komen met de spijsvertering en absorptiefuncties, wat resulteert in verschillende beweeglijkheidspatronen. Bayliss en Starling beschreven de "wet van de darm"2 in 1899, met het contractiele voortstuwingsprogramma in de darm dat tegenwoordig bekend staat als de peristaltische reflex; het segment proximaal aan de voedselbolus trekt samen om het voort te stuwen, en het distale segment ontspant om het te ontvangen. In theorie zou dit patroon alleen al voldoende kunnen zijn om materiaal aboraal te transporteren, maar meer dan een eeuw onderzoek heeft een complexer beeld geschetst van contractiele activiteit in het maagdarmkanaal. Drie dunne darmmotiliteitsperioden worden bij mensen herkend: het migrerende motorische complex (MMC), de vastenperiode en de postprandiale periode3. Dezelfde patronen zijn gemeld bij muizen 4,5. De MMC is een cyclisch motorisch patroon dat bij de meeste zoogdieren bewaardblijft 6,7. Het MMC heeft een karakteristiek vierfasenpatroon dat dient als een nuttige klinische marker bij functionele GI-stoornissen7. De vier fasen, in volgorde van voorkomen, zijn (I) rust, (II) onregelmatige contracties met lage amplitude, (III) regelmatige contracties met hoge amplitude en (IV) ramp-down periode van afnemende activiteit7. De MMC markeert het belangrijkste motorische patroon van de vastenperiode3. MMC's van de vastenperiode ruimen de inhoud van de dunne darm op ter voorbereiding op de volgende maaltijd.
De motorische patronen van de postprandiale periode zijn geoptimaliseerd voor de spijsverterings- en absorptiefuncties3. Ongeacht de calorische samenstelling, de eerste doorvoer is snel langs de dunne darm, de inhoud wordt verspreid over de lengte van de darm en de doorvoer vertraagt vervolgens8. De absorptie wordt geoptimaliseerd door het contactoppervlak te vergroten en te vertragen om de verblijftijd te verlengen. Zodra de voedingsstoffen zich in het lumen bevinden, bestaat het dominante patroon uit nauwe (<2 cm uit elkaar) ongecoördineerde contracties (segmenteringscontracties), met een paar over elkaar geplaatste contracten met grote amplitude over de hele lengte van de dunne darm (peristaltische contracties)9. Segmenterende contracties mengen de intraluminale inhoud op zijn plaats. De incidentele grote peristaltische samentrekkingen stuwen de inhoud naar de dikke darm.
De timing van deze overgang terug naar MMC's hangt af van het voedselvolume en de calorische samenstelling10. De dunne darmmonsters geven dus luminale aanwijzingen om te regelen wanneer de overgang tussen motiliteitsperioden moet worden overgezet. Mechanische aanwijzingen, zoals fysische eigenschappen van luminale inhoud11, luminaal volume en wandspanning, betrekken mechanoreceptorcellen in de GI-wand 12,13,14,15,16. Inderdaad, het verhogen van de vaste component van een maaltijd leidt tot een toename van de dunne darmtransit17. We speculeren dat fysische eigenschappen, zoals de vloeibare of vaste toestand van intraluminale inhoud, verschillende mechanoreceptoren moeten aanspreken vanwege de verschillende krachten die ze genereren op de GI-wand18.
De gouden standaard voor het meten van in vivo GI-transit bij mensen, zoals bij muizen, is het gebruik van radioactieve tracers gemeten door scintigrafie als ze de maag verlaten of langs de dikke darm19,20. Bij zoogdieren loopt de dunne darm op onvoorspelbare manieren waardoor de dunne darm moeilijk in vivo betrouwbaar in beeld kan worden gebracht, maar er wordt vooruitgang geboekt21. Verder is er momenteel een gebrek aan hulpmiddelen om te kwantificeren hoe de dunne darm omgaat met deeltjes van verschillende eigenschappen en groottes. Het uitgangspunt hier was een gouden standaardtechniek die de studie van dunne darmtransit22,23,24 en barrièrefunctie22 standaardiseert. Het bestaat uit het verbijsteren van muizen met een fluorescerend materiaal, wachten op GI-beweeglijkheid om het materiaal te transporteren, het maagdarmkanaal uit te schakelen, het in verschillende secties van maag tot dikke darm te segmenteren, te sectieren en intraluminale inhoud te homogeniseren voor fluorescentiekwantificering. We hebben twee verbeteringen aangebracht. Ten eerste hebben we de samenstelling van de gegavaagde inhoud gewijzigd om fluorescerende microscopische kralen op te nemen om te bepalen hoe de dunne darm fysieke deeltjes verdeelt. Ten tweede hebben we de ruimtelijke resolutie verbeterd door het hele maagdarmkanaal van maag tot dikke darm ex vivo in beeld te brengen en binning van variabele grootte te gebruiken om onze analyse over dieren te standaardiseren. We stellen dat dit nieuwe inzichten onthult in de balans tussen propulsieve versus segmenterende contracties tijdens de postprandiale fase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Mayo Clinic.
1. Instellen
- Snelle 8- tot 10 weken oude muizen gedurende 4 uur. Geef muizen toegang tot water.
OPMERKING: We gebruiken wild-type mannelijke C57BL / 6J-muizen voor alle experimenten die hier worden gepresenteerd, maar ze kunnen worden uitgevoerd op muizen van elke stam, geslacht en genotype. - Koel 15 ml gedestilleerd water in een conische buis van 50 ml in een koelkast van 4 °C.
- Verwarm nog eens 15 ml gedestilleerd water in een bekerglas met behulp van een hete plaat met een magnetische roerstaaf tot ongeveer 80-90 °C.
- Meet 0,5% methylcellulose voor een totaal van 30 ml (0,15 g).
- Voeg voorzichtig methylcellulose toe aan 15 ml heet water, zodat het niet klontert. De methylcellulose-oplossing zal tijdens dit proces troebel zijn.
- Eenmaal opgelost, verwijder je het bekerglas van de hete plaat en voeg je de 15 ml gekoeld water toe aan het hete bekerglas.
- Plaats in een koelkast van 4 °C tot de oplossing helder is, ongeveer 15-20 min.
- Weeg, indien helder, 3 mg rhodamine isothiocyanaat (RITC)-dextran per 5 ml 0,5% methylcellulose-oplossing en meng om te combineren. Dit is de vloeibare toestand in de sectie Representatieve resultaten .
- U kunt ook 25 mg fluorescerende polyethyleenmicrosferen wegen en mengen met 200 μL van de methylcellulose-oplossing totdat deze goed is opgenomen. Een grondige integratie van microsferen wordt verzekerd door vortex voorafgaand aan de maagsonde. De experimentator moet een homogene verdeling van gesuspendeerde microsferen in het mengsel visualiseren.
- Omdat de RITC-dextran-oplossing lichtgevoelig is, moet u de oplossing in de koelkast bewaren. Bereid de RITC-dextran-oplossing en het microshperemengsel van tevoren voor en gebruik binnen 2 maanden. Resuspendeer het microsfeermengsel voor gebruik.
OPMERKING: Microsferen van verschillende groottes worden gebruikt om gastro-intestinale behandeling van verschillende materialen te bestuderen. In de sectie Representatieve resultaten demonstreren we de resultaten van het gebruik van kleine (diameter: 75-90 μm) en grotere (diameter: 180-212 μm) microsferen.
2. Binneninale inhoudszone
- Bereid de maagsonde voor door een voedingssonde van 18 Ga x 50 mm aan een spuit van 1 ml te bevestigen en 200 μL RITC-oplossing of microsfeeroplossing te trekken.
- Houd het nuchtere dier handmatig vast met behulp van de eenhandige fixatietechniek25. Raadpleeg de informatie van de instelling over de juiste murine restraint-technieken.
- Steek de voedingssonde voorzichtig door de mond en slokdarm van de muis totdat deze in de maag komt.
OPMERKING: De stap van de maagsonde is van cruciaal belang voor een succesvol experiment. Het vereist ervaren handen die de buis consequent ongeveer op dezelfde afstand in elke muis kunnen inbrengen. Deze stap moet worden gestandaardiseerd door experimentatoren die het protocol uitvoeren. Dezelfde experimentator moet alle muizencohorten die met elkaar worden vergeleken, binnendringen. - Verwijder langzaam de inhoud van de spuit in de maag en verwijder voorzichtig de buis van de muis.
- Volg de maagsonde en breng de muis terug naar de kooi.
- Gooi de maagsonde weg.
- Herhaal het proces indien nodig voor het gewenste aantal dieren.
3. Darmdissectie
- Voordat u met de dissecties begint, schakelt u het in vivo beeldvormingsinstrument in om het op temperatuur te laten komen.
- Offer de muis 30 minuten na de maagsonde. Gebruik kooldioxide-inhalatie om de muis op te offeren, gevolgd door cervicale dislocatie om succesvolle euthanasie te garanderen.
- Na bevestiging van succesvolle euthanasie plaatst u de muis in rugligging op een dissectiestadium en pint u zijn vier aanhangsels op het podium om toegang te krijgen tot de buik. Maak het oppervlak van de buik nat met 70% ethanol om de buikharen nat te maken.
- Gebruik een microdissectietang (#5) om aan de huid te trekken en een scherpe chirurgische schaar te verkrijgen om een dwarse incisie te maken op 1 cm boven de anus. Om de intraperitoneale holte bloot te leggen, zet u de incisie verticaal op de buik voort tot aan de ribbenkast.
- Beweeg de blindedarm voorzichtig naar links met de microdissectietang om de distale dikke darm bloot te leggen.
- Knip de distale dikke darm met een microdissectieschaar net proximaal aan het rectum.
- Ontrafel voorzichtig de dikke darm, blindedarm en dunne darm door langzaam in de tegenovergestelde richting te trekken.
OPMERKING: Het handhaven van de ontleedde darmen in één continu segment zal het meeste gemak voor de onderzoeker creëren. Scheuren en scheuren langs het segment zullen ervoor zorgen dat vervolgstappen moeilijker zijn. - Gebruik een microdissectieschaar om proximaal naar de maag te snijden.
- Gebruik een tang om de ontlede darmen over te brengen naar het meetblad (figuur 1). Plaats de maag op 0 mm en schik de darmen langs de liniaal tot 200 mm. Gebruik een microdissectieschaar om op 200 mm te knippen. Herhaal dit proces van het uitlijnen van de darmen van 0 mm tot 200 mm langs de linialen, terwijl u erop kunt vertrouwen dat de oriëntatie van de darmen niet in de war raakt.
- Zorg ervoor dat u de darmen niet uitrekt terwijl u zich op de linialen richt.
- Zodra het weefsel op de liniaal is gerangschikt, rangschikt u de blindedarm zo dat deze parallel loopt met het weefsel, maar er niet direct mee in contact staat (als er fluorescentie in dat gebied wordt gevonden, is een duidelijk verschil tussen de blindedarm en de darmen nodig).
- Plaats het meetblad met het ontleedde weefsel in een donker gebied, zodat de fluorescentie kan worden bewaard totdat het tijd is om te fotograferen.
4. Ex vivo beeldvorming
- Open de in vivo imaging software en log in.
- Initialiseer het beeldvormende instrument zodat het klaar is voor beeldacquisitie.
- Stel de velden 'Excitatie' en 'Emissie' in op de overeenkomstige kleur die wordt gebruikt voor de kraal of RITC-maagsonde. Rood (vloeibaar): excitatie 535 nm /emissie 600 nm. Groen (microsferen): excitatie 465 nm /emissie 520 nm.
- Stel de belichting in op 'Auto'.
- Selecteer het gezichtsveld.
- Voordat u het meetblad in het instrument plaatst, moet u ervoor zorgen dat de darmen tijdens het transport niet zijn verschoven.
- Plaats het meetblad in het instrument binnen het gezichtsveld.
- Sluit de deur van het instrument veilig en selecteer Snapshot om het gezichtsveld te fotograferen.
- Sla verzamelde foto's op een flashstation op voor analyse. Sla individuele opnamen van de fluorescerende en fotografische afbeeldingen op. Een overlay van de foto en fluorescentie geeft de locatie van fluorescerend materiaal in het maagdarmkanaal aan (figuur 1).
OPMERKING: We raden u aan de bestanden op te slaan in de indeling Tag Image File (.tif) voor downstreamverwerking.
5. Analyse
- Open de fluorescerende en fotografische afbeeldingsbestanden in een beeldbewerkingssoftware.
- Pas de pixelgrootte van beide afbeeldingen zodanig aan dat ze exact dezelfde afmetingen hebben (onze conventie was om beide afbeeldingen in te stellen op 1280 pixels bij 850 pixels [hoogte x breedte]).
- Sluit het fotobestand. De volgende stappen hebben alleen betrekking op het fluorescerende beeld.
- Gebruik een gum om de achtergrond te verwijderen en transparant te maken. Een gum kan nodig zijn om patches van de resterende achtergrond te verwijderen.
- Maak een nieuwe laag. Maak er een volledig zwarte achtergrond van het fluorescerende signaal van. Dit kan worden bereikt door een zwarte vulling naar de laag te kiezen en de laag te slepen om onder de laag met de fluorescerende afbeelding te liggen.
- Sla de nieuwe fluorescerende afbeelding, die alleen het fluorescerende signaal op een zwarte achtergrond bevat, op als een nieuw .tif bestand.
- Open de nieuwe fluorescerende en fotografeer afbeeldingen in ImageJ.
- Verander elke afbeelding in een 32-bits afbeelding door Afbeelding > Type > 32-bits te kiezen.
- Maak een samengevoegde afbeelding van beide door Afbeelding > Kleur > Kanalen samenvoegen te kiezen. Selecteer in het dialoogvenster dat wordt geopend het fotobestand voor het grijze kanaal en het fluorescerende bestand onder eventuele gekleurde kanalen.
- Schakel de schaal van de samengevoegde afbeelding uit door Analyseren > Schaal instellen > Klik om schaal te verwijderen te selecteren.
- Selecteer het gereedschap "Rechthoek" in ImageJ.
- Teken een rechthoek rond een deel van de dunne darm. Let goed op de breedte van deze regio van belang (ROI), omdat deze constant moet blijven tussen alle ROI's. De nominale waarde is niet essentieel, alleen dat deze consistent wordt gehouden over alle ROI's die op deze afbeelding zijn getekend [aangezien de dunne darm meerdere rijen overneemt, worden individuele ROI's in een andere rij over elk deel van de dunne darm getrokken (figuur 1)]. Figuur 2 toont de locatie van de breedtewaarde in de werkbalk ImageJ.
- Dupliceer de ROI door Afbeelding > Dupliceren te selecteren. Selecteer alleen het kanaal dat overeenkomt met het gekleurde kanaal.
- Gebruik het gereedschap rechthoek opnieuw om een ROI over de hele nieuwe afbeelding te tekenen.
- Haal een profiel van de fluorescentie op door Analyseren > Plotprofiel te selecteren. De resulterende grafiek toont op de y-as de gemiddelde intensiteit voor elke pixel langs de lengte van de ROI. Dit werd in stap 5.12 geselecteerd om de lengte van het geanalyseerde gedeelte van de dunne darm te zijn
- Open de lijst met waarden en kopieer ze naar een spreadsheetsoftware.
- Herhaal stap 5.12-5.16 voor elk deel van de dunne darm op een andere liniaalrij. Blijf de waarden in hetzelfde spreadsheetbestand direct onder elke vorige set waarden plakken, zodat alle doorlopende rijen in die kolom de gemiddelde intensiteitswaarde voor de gehele lengte van de dunne darm bevatten.
- Vermenigvuldig in de spreadsheetsoftware elke gemiddelde intensiteitswaarde met de constante breedte van de ROI-rechthoek die in stap 5.12 is gemaakt. Dit levert op elk punt de werkelijke intensiteitswaarde langs de dunne darm op.
OPMERKING: Verschillende dieren zullen lichte variaties op de lengte van de dunne darm hebben. Om te voorkomen dat de lengteverschillen van invloed zijn op de uitkomst van downstream-gegevensanalyse, moet de reeks intensiteitswaarden in een consistent aantal bakken in alle experimentele monsters worden gegooid (figuur 3, figuur 4 en figuur 5 geven resultaten weer voor drie bakgroottes). - Deel het aantal intensiteitswaarden door het gewenste aantal bakken. Het resulterende quotiënt S bepaalt het aantal intensiteitswaarden dat in elke bak wordt opgenomen.
- Bepaal de bak waar elke waarde voor de onbewerkte intensiteit naartoe gaat met behulp van een roundup-formule. Met deze stap wordt elke waarde voor onbewerkte intensiteit in een prullenbak geplaatst. Elke ruwe intensiteitswaarde wordt chronologisch geïndexeerd met het gehele getal N. Het quotiënt N/S bepaalt het binnummer dat aan elke onbewerkte waarde wordt toegewezen. De roundup-formule moet dit quotiënt afronden op een geheel getal zonder decimalen.
- Genereer de waarde voor elke bin met behulp van een averageif-formule. Het doel is om het gemiddelde te nemen van de onbewerkte waarden die in stap 5.20 aan een specifieke bak zijn toegewezen. Daarom moeten de argumenten in de formule zijn: (1) toegewezen bakken gegenereerd in stap 5.20, (2) binnummer, (3) onbewerkte intensiteitswaarden.
OPMERKING: De eerste analyse die we kunnen uitvoeren op de binned data is een geometrische centrumanalyse, die kwantificeert hoe ver we de hoogste fluorescerende intensiteit langs de dunne darm waarnemen (figuur 4). - Normaliseer elke intensiteitswaarde over de totale fluorescerende intensiteit. Met andere woorden, deel elke intensiteitswaarde door de som van alle intensiteiten.
- Vermenigvuldig elke genormaliseerde waarde met het binnummer. Het product weerspiegelt het relatieve gewicht van elke bak en draagt bij aan de totale fluorescerende intensiteit.
- Het optellen van alle waarden die in stap 5.23 zijn gegenereerd, levert het binnummer op in het midden van het fluorescerende signaal. Deel door het aantal bakken om het geometrische centrum uit te drukken als de fractie van de dunne darm die door het fluorescerende centrum wordt gereisd.
OPMERKING: Om de ruimtelijke verdeling van het signaal weer te geven, is de volgende stap het genereren van het vermogensspectrum van de binned intensiteit dataset (figuur 5). - Open een FFT-wizard (Fast Fourier Transform) in de spreadsheetsoftware. Selecteer de invoer als de in de prullenbak gebakken gegevensset en de uitvoer als een lege set van hetzelfde aantal rijen als bakken.
- Extraheer de reële waardecomponent van de FFT.
- Verhoog elke reële waarde van de FFT naar de tweede macht. Dit levert een dataset van vermogensspectra op.
- Selecteer de eerste helft van de vermogensspectragegevensset en verplaats deze zodat deze onder de tweede helft ligt. Dit heeft het effect dat de vermogensspectra rond de middenfrequentie worden gecentreerd wanneer deze in de volgende stap wordt uitgezet.
- Plot de vermogensspectra op de y-as van een x-y-grafiek waarbij de x-aswaarden het bereik zijn van -1 x (aantal bakken/2) tot (aantal bakken/2) -1. In het geval van 1000 bakken zouden de aswaarden variëren van -500 tot 499.
- Vermogensspectra voor elk dier moeten worden vergeleken op basis van de spreiding van niet-nulpieken en de hoogten van deze niet-nulpieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We tonen representatieve resultaten vanaf stap 3. Figuur 1 toont de intacte geëxplanteerde darmen, met fluorescerende metingen eroverheen. De maag (paars) wordt langs dezelfde as gelegd als de dunne darm (oranje), maar we geven er de voorkeur aan om de blindedarm (blauw) naar de zijkant te verplaatsen om overlapping met de dikke darm (oranje) te voorkomen. Zoals blijkt uit het linkerpaneel, is dit niet altijd mogelijk vanwege de grootte van het orgaan. We snijden de dunne darm op ~ 200 mm om de dekking van continue segmenten te maximaliseren, maar dit is niet altijd mogelijk vanwege mesenterium dat het vermogen om de darmen te ontvouwen beperkt, en onze voorkeur om niet door structuren zoals fluorescerende pellets of de blindedarm te snijden. De rode intensiteit in het linkerdeelvenster van figuur 1 en de groene intensiteiten van het middelste en rechterpaneel worden gesorteerd in bakken van verschillende grootte om figuur 3 te genereren. Alleen de intensiteiten binnen de oranje ROIs (dunne darm) worden geëxtraheerd voor analyse. De volledige lengte van de dunne darm (elke oranje ROI in elk paneel) wordt geëxtraheerd voor analyse. Oranje ROIs hebben dezelfde breedte, zoals weergegeven in ImageJ (figuur 2). Ze worden aan elkaar genaaid door alle intensiteiten in volgorde te plaatsen voorafgaand aan het binnen. Figuur 3 toont het gemiddelde fluorescerende spoor ± SEM per cohort; zie figuurlegende voor details.
De laatste twee cijfers tonen de resultaten van de analyses: geometrisch centrum en vermogensspectrum. Het geometrische midden meet de gemiddelde locatie van de fluorescerende signalen in figuur 3 en weegt het gemiddelde met de signaalsterkte van elke bak. Vandaar dat hogere pieken in het spoor het gemiddelde dichter bij de positie van die piek brengen. Het geometrische centrum slaagt er niet in om de ruimtelijke verdeling van intraluminale inhoud volledig te karakteriseren. Hetzelfde geometrische centrum kan bijvoorbeeld worden verkregen uit een bolus geconcentreerd op een enkel punt en een gespreid signaal gecentreerd rond hetzelfde punt. Deze beperking van de geometrische centrummeting blijkt duidelijk uit de vergelijking tussen vloeistoffen en grotere kralen (figuur 3 en figuur 4). Het grootste deel van het vloeibare fluorescerende spoor is gecentreerd rond twee vroege pieken, terwijl de grotere kralen meerdere pieken vertonen over de volledige lengte van de dunne darm (figuur 3, linker- en rechterpanelen). Het fluorescerende spoor van de grotere kralen is meer verdeeld, maar het gemiddelde is tot een vergelijkbaar punt als dat van de vloeistof, ongeacht de binning granulariteit, wat de beperking benadrukt van alleen focussen op het geometrische centrum (figuur 4). Om rekening te houden met de distributieve aard van dunne darmcontracties, hebben we een vermogensspectrale analyse in het protocol opgenomen. De vermogensspectrumanalyse werkt door de fluorescentieverdeling in de ruimte te deconstrueren in meerdere sinusoïde krommen van verschillende ruimtelijke frequenties. Elke ruimtelijke frequentie weerspiegelt de afstand tussen twee willekeurig geselecteerde punten in het fluorescentiespoor. Sommige van deze afstanden komen vaker voor dan andere, dus aan elk wordt een sterkte (kracht) toegeschreven. Het vermogen correleert met hoe vaak twee willekeurige punten door die afstand van elkaar worden gescheiden. Door het vermogensspectrum uit te zetten (figuur 5) kunnen we aantonen hoeveel ruimtelijke frequenties bijdragen aan het gemeten signaal (spreiding van het spectrum) en de relatieve sterkte van die bijdragen (hoogte van het spectrum) vergelijken. Dit stelt ons in staat om de verspreiding van fluorescentie langs het maagdarmkanaal kwantitatief te beschrijven.
Figuur 1. De ontlede darmen worden geëxplanteerd en op gelamineerd liniaalpapier geplaatst voorafgaand aan fotografie en fluorescentiemeting. Fluorescentie-intensiteit wordt overlayed en pseudokleurd om overeen te komen met de inheemse fluorescentie van gavaged materiaal. Links: vloeibaar rhodamine isothiocyanaat (RITC) fluoresces in het rode spectrum; Midden: klein (diameter: 75-90 μm), en rechts: groter (diameter: 180-212 μm) kralen fluoresceren beide in het groene spectrum. Paarse, oranje, blauwe en roze vakken omringen gebieden van belang (ROIs) in respectievelijk de maag, dunne darm, blindedarm en dikke darm in elk exemplaar. De breedte van elke ROI wordt consistent gehouden in rijen om verwarring te voorkomen bij het berekenen van de ruwe fluorescentie-intensiteit tijdens downstream-analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Locatie van het interessegebied breedte (in pixels) op de werkbalk ImageJ (gele onderstreping). Nogmaals, de breedte wordt alleen in pixels weergegeven als de schaal is verwijderd (stap 5.10). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Fluorescentie sporen langs de lengte van de dunne darm. Lijn geeft de gemiddelde fluorescentie aan bij een bepaalde bak. Het gearceerde gebied geeft de standaardfout van het gemiddelde (SEM) aan. De verdeling van fluorescerend materiaal varieert afhankelijk van de materiaaleigenschappen van de intraluminale inhoud (kolommen). Links: vloeibare (n = 7 muizen) verdeling over een paar dunne darmsegmenten 30 minuten na de maagsonde. Midden en rechts: kleine (n = 6 muizen) en grotere (n = 5 muizen) kralen verspreiden zich breder langs de dunne darm 30 minuten na de maagsonde. Als u het aantal bakken verhoogt dat wordt gebruikt om dezelfde onbewerkte gegevenssets te sorteren, worden granulaire traceerfuncties onthuld die onoplosbaar zijn met minder bakken (rijen). Kleinere bakken verminderen de meetonzekerheid, verhogen de ruimtelijke resolutie en weerspiegelen beter de verdelende component van dunne darmcontracties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Het geometrische centrum van de fluorescentieverdeling in dunne darm 30 min na de maagsonde met vloeibare RITC, kleine kralen (75-90 μm) en grotere kralen (180-212 μm) (gemiddelde ± SEM, n = 7, n = 6, n = 5, eenrichtings-ANOVA met Bonferroni-correctie). De grootte van de bak heeft geen invloed op de transitinterpretatie dat kleine kralen 30 minuten na de maagsonde meer distisch worden vervoerd dan vloeistoffen, maar de grotere kralen verspreiden zich zo wijd dat er geen significante verschillen zijn in hun geometrische centrum in vergelijking met zowel vloeistoffen als kleine kralen (* P < 0,05. ns = niet statistisch significant). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Vermogensspectra worden gecategoriseerd op materiaaleigenschap (kolommen) en bakgrootte (rijen). De verbeteringen in ruimtelijke resolutie en kleinere binning zijn duidelijk. Bovenste rij: er zijn weinig verschillen te onderscheiden in de wijd ver doorgevoerde spectra. Onderste rij: naarmate de bakgroottes krimpen, kunnen we aanzienlijke dominante frequenties waarderen die aanwezig zijn in het spectrum van de grotere kralen, maar niet in die van de kleine kralen. Sommige, maar niet alle, van die extra dominante frequenties zijn aanwezig in het vloeibare spectrum. Met behulp van de spectra van de onderste rij kunnen we vergelijken met de fluorescerende sporen in figuur 3. In figuur 3 toont het vloeibare fluorescerende spoor twee prominente pieken, die correleren met enkele dominante pieken in het vermogensspectrum. Het kleine kralenspoor in figuur 3 toont een enkele dominante piek, die correleert met een enkele dominante piek in het vermogensspectrum. Het grotere kralenspoor in figuur 3 geeft meer dominante pieken weer. Dienovereenkomstig vertoont het vermogensspectrum een groter aantal dominante frequenties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het maagdarmkanaal vereist, net als andere buisvormige organen, zoals bloedvaten, mechanische sensoren en effectoren om de homeostase 26,27,28 te behouden. Het maagdarmkanaal is echter uniek omdat de fysieke eigenschappen van de materialen die het doorkruisen niet constant zijn tijdens maaltijden. Intraluminale inhoud van verschillende fysische eigenschappen (vast, vloeibaar en gas) passeert de darm en genereert verschillende mechanische ingangen naar de GI-mechanoreceptoren. Inderdaad, verschillende mechanische stimuli in de dikke darm worden waargenomen en doorgegeven door verschillende paden29.
Dit protocol is technisch toegankelijk voor iedereen die routinematig muiswerk uitvoert, maar een paar kritieke stappen vereisen veel aandacht. We vinden vastende muizen belangrijk voordat we met de studie beginnen, omdat het de bijdrage van eerdere maaltijden verwijdert en het fluorescerende signaal verdunt. Bovendien vertonen muizen die een standaarddieet krijgen intraluminale fluorescentie van dieetcomponenten, met name de chlorofylcomponent30. Door vasten en fluorofoorselectie voorkomen we dat chow-fluorescentie de gecontroleerde omstandigheden van de experimenten in dit protocol verstoort. We raden experimentatoren aan om onafhankelijk te bevestigen dat de geselecteerde vastenperiode voldoende is om niet-specifieke fluorescentie in de dunne darm te elimineren, omdat dit kan variëren per stam, leeftijd of geslacht. De experimentator moet de homogene verdeling van de besmette inhoud visueel beoordelen. Anders ontstaat er onzekerheid over de levering en de studieresultaten. Gavages moeten consequent worden uitgevoerd door dezelfde experimentator, bij voorkeur iemand die ervaring heeft ontwikkeld met de techniek. De experimentator moet streven naar een consistente levering van inhoud aan de maag. Het vinden van fluorescentie in de slokdarm of uitsluitend in de maag is reden om een dier uit te sluiten van de analyse, omdat het onzeker is of de dunne darm dezelfde toegang had tot de besmette inhoud. Na het sluimeren kunnen de wachttijden worden verkort tot 15 minuten of worden verlengd tot 90 minuten, afhankelijk van of vroege of late transitfasen van belang zijn22. Het oorspronkelijke protocol met behulp van vloeibare maagsonde toonde aan dat het grootste deel van het materiaal zich na 30 minuten in de dunne darm bevindt. Bovendien, hoewel het van cruciaal belang is om met haast te werken tijdens de dissectiestap, moet ervoor worden gezorgd dat de locatie van de intraluminale inhoud niet wordt verstoord en het maagdarmkanaal niet wordt gescheurd.
Dit protocol is geëvolueerd uit eerder gepubliceerde benaderingen die de dunne darm fysiek in de prullenbak gooiden door deze in vijf tot 10 segmenten te snijden en intraluminale inhoud te homogeniseren voorafgaand aan fluorescentie / radioactiviteitsmeting 22,23,24. De vorige aanpak was belangrijk omdat het de meting van de doorvoer van de dunne darm standaardiseerde. De dunne darm loopt notoir in gecompliceerde en onvoorspelbare patronen in de buikholte. Op beeldvorming gebaseerde transitstudies zijn een uitdaging, ongeacht soort 31,32. Hoewel ons protocol een terminaal experiment blijft dat niet kan worden uitgebreid naar mensen, verbeteren we de ruimtelijke resolutie aanzienlijk en grijpen we die verbetering aan om regionale transits op te lossen en te vertalen in een onbevooroordeelde meting van de verspreiding binnen de dunne darm (vermogensspectrum).
In dit protocol wordt de ruimtelijke resolutie beperkt door de resolutie van de camera in het beeldsysteem. Omdat binning de dunne darmlengte bij dieren normaliseert, kunnen we de gemiddelde positie van de intraluminale inhoud direct vergelijken. Figuur 3 toont duidelijk de drastische afvlakking, toegenomen onzekerheid en verminderde resolutie als gevolg van grote bakafmetingen. Het geometrische centrum kwantificeert het fluorescentiecentrum langs het maagdarmkanaal (figuur 4). Zoals verwacht wordt deze meting niet significant beïnvloed door de grootte van de bak. Het vermogensspectrum is een onbevooroordeelde en complementaire methode die de analyse van pieken en spreads in de fluorescerende sporen van figuur 3 standaardiseert. Het verbeteren van de resolutie verbetert de berekende spectra, waardoor het mogelijk wordt om zichtbare verschillen tussen fluorescerende sporen aan te tonen (figuur 5). Bij een lage resolutie (10 bakken) zou het moeilijk zijn om onderscheid te maken tussen vloeistoffen en grotere kralen, hetzij door het geometrische centrum of spectrumbeoordelingen, ook al is het duidelijk als je naar de fluorescerende sporen kijkt dat ze niet op dezelfde manier in de ruimte zijn verdeeld. Bij een hogere resolutie (1000 bakken) zijn de geometrische centra nog steeds vergelijkbaar (vanwege het feit dat het geometrische centrum een gemiddelde meting is), maar het vermogensspectrum kan betrouwbaar worden gebruikt om onderscheid te maken tussen beide cohorten. Het is vermeldenswaard dat de fluorescerende sporen vatbaar zijn voor andere soorten analyses, zoals geavanceerde metingen. Verwachte veranderingen in het geometrische centrum kunnen worden gebruikt tijdens de berekening van de steekproefgrootte voorafgaand aan de experimenten. Wetende dat vloeistoffen een geometrisch centrum van ongeveer 0,4-0,518 hebben, gebruikten we ten minste vijf muizen in elke groep om statistisch veranderingen tot 45% op te lossen.
We hebben de reikwijdte uitgebreid en dit protocol gebruikt om de doorvoer van vaste stoffen in de dunne darm te bestuderen. Net als bij vloeistoffen hebben we de vaste microsferen in de maag gesmeten. De pylorische sluitspier bevindt zich bij de maag-dunne darmovergang. Deze sluitspier werkt als een filter voor het uitsluiten van maten. Bij muizen is de grootte cutoff op ~ 300 μm, waarbij deeltjes <300 μm geen weerstand ondervinden bij het binnendringen van de dunne darm33, maar deze aanpak werkt ook met iets grotere deeltjes die we gebruikten in een recente studie18. We hebben hier onze microsfeergroottes gekozen om een reeks maten te bieden die de recente studie aanvullen. We gebruikten twee commerciële fluorescerende kraalpreparaten met diameters van 75-90 μm en 180-212 μm. Figuur 1 toont vergelijkbare fluorescentiedichtheid en profielen in de maag in cohorten, wat suggereert dat noch vloeistoffen noch deeltjes differentieel door de maag worden vastgehouden. De oorspronkelijke gegevens die hier worden gepresenteerd, laten zien hoe de dunne darm van wild-type muizen anders omgaat met vloeistoffen en microscopische vaste stoffen. Tot nu toe hebben we kralen van één groottebereik per onafhankelijk experiment gebruikt. Toekomstige studies kunnen zich richten op hoe mengsels van deeltjes van verschillende grootte worden behandeld en fluorescerende vloeistoffen van verschillende fysieke eigenschappen mengen met fluorescerende kralen om te bepalen hoe meer realistische chymemengsels door de dunne darm worden behandeld.
De hier gerapporteerde verdelingsverschillen suggereren een verschil in de beweeglijkheidspatronen die worden geactiveerd door materialen met verschillende eigenschappen. We stellen dat de balans tussen segmentering versus voortstuwende contracties bepaalt hoe ver en hoe homogeen materialen de dunne darm passeren. Het geometrische centrum voor kleine kralen ligt verder langs de dunne darm in vergelijking met vloeistoffen, wat suggereert dat kleine vaste deeltjes voortstuwende contracties vertonen. Aan de andere kant, terwijl het geometrische centrum voor grotere kralen vergelijkbaar is met een vloeistof, toont spectrale analyse significante verschillen in ruimtelijke verdeling, wat een gevolg kan zijn van meer segmenterende contracties in de grotere kraalinstelling. We veronderstellen dat de dunne darm gebruik maakt van groottediscriminatie, een soort mechanosensorisch circuit, als een van de inputs die bijdragen aan het bepalen van de balans tussen contractietypen. Dogiel type II neuronen zijn bijvoorbeeld mechanosensorische neuronen waarvan wordt gespeculeerd dat ze een rol spelen bij het sturen van de overgang van voortstuwende naar segmenterende contracties16,34. Deze intrigerende speculaties vereisen verder onderzoek om de mechanismen te bepalen waarmee het maagdarmkanaal fysieke eigenschappen detecteert en transduceert naar fysiologische outputs zoals contracties.
Wij geloven dat dit protocol nuttig zal zijn als een extra hulpmiddel om de kloof van moleculen naar cellen naar orgaanfunctie te overbruggen. We erkenden dat GI-epitheliale mechanoreceptoren ontwikkelings- en structurele overeenkomsten vertonen met huidmechanoreceptoren35. Met behulp van het hierboven beschreven protocol hebben we geholpen de sensorische rol van "darmaanraking" aan te tonen, waarbij deze GI-epitheliale mechanoreceptoren lichtmechanische stimuli detecteren en deelnemen aan intrinsieke tactiele gevoeligheid18. We verwachten dat dit protocol even nuttig zal zijn om te bestuderen hoe andere sensorische circuits bijdragen aan de doorvoer van de dunne darm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
We danken mevrouw Lyndsay Busby voor administratieve hulp en de heer Joel Pino voor de steun van de media. NIH-subsidies ondersteunden dit werk: DK123549, AT010875, DK052766, DK128913 en Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology (DK084567).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | other mice can be used with this protocol |
| Dissection tools | n/a | n/a | |
| Excel software | Microsoft | n/a | used for spreadsheet analysis |
| Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g | Cospheric | UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g | "smaller beads" in the manuscript |
| Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g | Cospheric | UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g | "larger beads" in the manuscript |
| Gavage needles | Instech | FTP-18-50-50 | |
| ImageJ software | n/a | n/a | used to extract fluorescence profile |
| Laminated ruler paper (prepared in-house) | n/a | n/a | |
| Methyl cellulose (viscosity: 400 cP) | Sigma | M0262 | |
| Photoshop software | Adobe | n/a | used for image processing |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma | r8881-100mg | "liquid" condition in the manuscript |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
References
- Stevens, C. E., Hume, I. D. Comparative Physiology of the Vertebrate Digestive System. 2nd ed. , Cambridge University Press. (2004).
- Bayliss, W. M., Starling, E. H. The movements and innervation of the small intestine. The Journal of Physiology. 24 (2), 99-143 (1899).
- Husebye, E. The patterns of small bowel motility: physiology and implications in organic disease and functional disorders. Neurogastroenterology and Motility. (11), 141-161 (1999).
- Bush, T. G., et al. Effects of alosetron on spontaneous migrating motor complexes in murine small and large bowel in vitro. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 281 (4), 974-983 (2001).
- Der-Silaphet, T., et al. Interstitial cells of cajal direct normal propulsive contractile activity in the mouse small intestine. Gastroenterology. 114 (4), 724-736 (1998).
- Szurszewski, J. H. A migrating electric complex of the canine small intestine. American Journal of Physiology. 217 (6), 1757-1763 (1969).
- Deloose, E., et al. The migrating motor complex: control mechanisms and its role in health and disease. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 9 (5), 271-285 (2012).
- Johansoon, C., Ekelund, K. Relation between body weight and the gastric and intestinal handling of an oral caloric load. Gut. 17, 456-462 (1976).
- Sarna, S. K., et al. Spatial and temporal patterns of human jejunal contractions. American Journal of Physiology. 257 (1), 423-432 (1989).
- Hall, K. E., El-Sharkawy, T. Y., Diamant, N. E. Vagal control ofcanine postprandial upper gastrointestinal motility. American Journal of Physiology. 250, 501-510 (1986).
- Mayer, E. A. Gut feelings: the emerging biology of gut-brain communication. Nature Reviews Neuroscience. 12 (8), 453-466 (2011).
- Alcaino, C., et al. A population of gut epithelial enterochromaffin cells is mechanosensitive and requires Piezo2 to convert force into serotonin release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Sciences. 115 (32), 7632-7641 (2018).
- Kugler, E. M., et al. Mechanical stress activates neurites and somata of myenteric neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 342 (2015).
- Mazzuoli, G., Schemann, M. Mechanosensitive enteric neurons in the myenteric plexus of the mouse intestine. PloS One. 7 (7), 39887 (2012).
- Won, K. J., Sanders, K. M., Ward, S. M. Interstitial cells of Cajal mediate mechanosensitive responses in the stomach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (41), 14913-14918 (2005).
- Mao, Y., Wang, B., Kunze, W. Characterization of myenteric sensory neurons in the mouse small intestine. Journal of Neurophysiology. 96 (3), 998-1010 (2006).
- McIntyre, A., et al. Effect of bran, ispaghula, and inert plastic particles on gastric emptying and small bowel transit in humans: the role of physical factors. Gut. 40 (2), 223-227 (1997).
- Treichel, A. J., et al. Specialized mechanosensory epithelial cells in mouse gut intrinsic tactile sensitivity. Gastroenterology. 162 (2), 535-547 (2022).
- Bharucha, A. E., Anderson, B., Bouchoucha, M. More movement with evaluating colonic transit in humans. Neurogastroenterology and Motility. 31 (2), 13541 (2019).
- Camilleri, M., et al. Human gastric emptying and colonic filling of solids characterized by a new method. American Journal of Physiology. 257 (2), 284-290 (1989).
- Wang, D., et al. Trans-illumination intestine projection imaging of intestinal motility in mice. Nature Communications. 12 (1), 1682 (2021).
- Woting, A., Blaut, M. Small intestinal permeability and gut-transit time determined with low and high molecular weight fluorescein isothiocyanate-dextrans in C3H mice. Nutrients. 10 (6), 685 (2018).
- Miller, M. S., Galligan, J. J., Burks, T. F. Accurate measurement of intestinal transit in the rat. The Journal of Pharmacologial and Toxicological Methods. 6 (3), 211-217 (1981).
- Moore, B. A., et al. Inhaled carbon monoxide suppresses the development of postoperative ileus in the murine small intestine. Gastroenterology. 124 (2), 377-391 (2003).
- Machholz, E., et al. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
- Baeyens, N., Schwartz, M. A. Biomechanics of vascular mechanosensation and remodeling. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 7-11 (2016).
- Ye, G. J., Nesmith, A. P., Parker, K. K. The role of mechanotransduction on vascular smooth muscle myocytes' cytoskeleton and contractile function. The Anatomical Record (Hoboken). 297 (9), 1758-1769 (2014).
- Mercado-Perez, A., Beyder, A. Gut feelings: mechanosensing in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. , 1-14 (2022).
- Brierley, S. M., et al. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- Inoue, Y., et al. Diet and abdominal autofluorescence detected by in vivo fluorescence imaging of living mice. Molecular Imaging. 7 (1), 21-27 (2008).
- Szarka, L. A., Camilleri, M. Methods for the assessment of small-bowel and colonic transit. Seminars in Nuclear Medicine. 42 (2), 113-123 (2012).
- Padmanabhan, P., et al. Gastrointestinal transit measurements in mice with 99mTc-DTPA-labeled activated charcoal using NanoSPECT-CT. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 3 (1), 1-8 (2013).
- Jang, S. F., et al. Size discrimination in rat and mouse gastric emptying. Biopharmaceutics and Drug Disposition. 34 (2), 107-124 (2013).
- Zhu, Y. F., et al. Enteric sensory neurons communicate with interstitial cells of Cajal to affect pacemaker activity in the small intestine. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 446 (7), 1467-1475 (2014).
- Treichel, A. J., Farrugia, G., Beyder, A. The touchy business of gastrointestinal (GI) mechanosensitivity. Brain Research. 1693, 197-200 (2018).
