מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית של מיקרו-סירקולציה ריאתית בפגיעה חריפה ניסיונית של הריאות באמצעות מערכת הדמיה מיוצבת ואקום
Summary
ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית כדי לחקור אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל וזלוף נימי בזמן אמת. פרוטוקול זה מתאר שיטות לדמות ולכמת פרמטרים אלה במיקרו-סירקולציה ריאתית באמצעות מערכת הדמיית ריאות המיוצבת בריק.
Abstract
הדמיה תוך-ורידית של אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל מציעה תובנות חשובות על מחלות בתיווך מערכת החיסון בבעלי חיים. המחקר של פגיעה חריפה בריאות (ALI)/תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) ופתולוגיות נשימתיות אחרות in vivo הוא קשה בשל הנגישות המוגבלת וממצאי התנועה המובנים של הריאות. עם זאת, פותחו גישות שונות כדי להתגבר על אתגרים אלה. פרוטוקול זה מתאר שיטה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית לחקר אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל בזמן אמת במיקרו-סירקולציה ריאתית במודל ניסיוני של ALI. מערכת הדמיית ריאות in vivo ופלטפורמת מיקרוסקופיה תוך-ורידית מודפסת בתלת-ממד משמשות לאבטחת העכבר המרדים ולייצב את הריאה תוך מזעור פגיעה מבלבלת של הריאות. לאחר ההכנה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשדה רחב משמשת לחקר הידבקות לויקוציטים, גלגול לויקוציטים ותפקוד נימי. בעוד שהפרוטוקול המוצג כאן מתמקד בהדמיה במודל אקוטי של מחלת ריאות דלקתית, הוא עשוי להיות מותאם גם לחקר תהליכים פתולוגיים ופיזיולוגיים אחרים בריאה.
Introduction
מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM) היא כלי הדמיה שימושי להדמיה וחקר של תהליכים ביופיזיים שונים in vivo. הריאה מאתגרת מאוד לצילום in vivo בשל מיקומה הסגור, האופי השברירי של הרקמה שלה וממצאי תנועה המושרים על ידי נשימה ודופק 1,2. תצורות מיקרוסקופיה תוך-ורידית (IVM) שונות פותחו להדמיה בזמן אמת של אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל במיקרו-סירקולציה ריאתית כדי להתגבר על אתגרים אלה. גישות כאלה מבוססות על חשיפה כירורגית וייצוב של הריאה לצורך הדמיה.
בעלי חיים מוכנים בדרך כלל להפריה חוץ גופית של הריאות בהליכים כירורגיים. ראשית, בעלי חיים הם intubated ומאוורר, אשר מאפשר כריתה כירורגית של חלון בית החזה והתערבויות לאחר מכן כדי לייצב את הריאה להדמיה. טכניקה אחת כוללת הדבקת הפרנצ’ימה על כיסוי זכוכית3, הליך המסתכן בטראומה פיזית משמעותית לרקמה המצולמת. מתקדם יותר הוא השימוש במערכת ואקום לייצוב הריאה מתחת לחלון זכוכית4. מערך זה מאפשר היצמדות רופפת של פני הריאה לכיסוי באמצעות ואקום הפיך המתפשט על פני שטח מקומי גדול ומרחיב את הריאה תוך הגבלת התנועה בממדים x, y ו-z4. הוואקום מוחל באופן שווה דרך תעלה המקיפה את אזור ההדמיה של המערך ומושך את הרקמה לאזור חרוטי רדוד הפונה לכיסוי ברמת הדמיה4. דרך חלון צפייה זה, ניתן לחקור את המיקרו-סירקולציה של הריאות באמצעות שיטות הדמיה אופטיות שונות.
Lung IVM מאפשר הדמיה כמותית של מספר רב של פרמטרים מיקרו-מעגליים. אלה כוללים מדידות כגון מהירות ואורך מסלול לויקוציטים5, מהירות זרימת תאי דם אדומים6 וחמצון7, גרורות גידול8, הבחנה בין תת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון 9,10,11, הדמיה של מיקרו-חלקיקים12, דינמיקה של נאדיות13,14, חדירות כלי דם15 ותפקוד נימי16 . ההתמקדות כאן היא בגיוס לויקוציטים ותפקוד נימי. התחלת גיוס לויקוציטים במיקרו-סירקולציה ריאתית כוללת אינטראקציות גלגול חולפות ואינטראקציות דבקות מוצקות בין לויקוציטים לתאי אנדותל, שניהם מוגברים בתנאים דלקתיים16,17. בדרך כלל, גלגול הוא כימות על ידי מספר לויקוציטים העוברים קו ייחוס המוגדר על ידי מפעיל, בעוד הידבקות מכמתת על ידי מספר לויקוציטים שאינם תנועה על האנדותל16. תפקוד נימי עשוי להיות מושפע גם במצבים דלקתיים, לעתים קרובות וכתוצאה מכך ירידה בזלוף. ניתן לייחס זאת למספר גורמים, כולל הפחתה של עיוות תאי דם אדומים18 וביטוי מגוון של NO synthase inducible על ידי תאי אנדותל וכתוצאה מכך shunting פתולוגי19. בדרך כלל, האורך המצטבר של נימים מחוררים לכל אזור נמדד ומדווח כצפיפות נימי תפקודית (FCD).
חקר גיוס לויקוציטים בריאות בזמן אמת דורש תיוג מטרות ביולוגיות בצבעים פלואורסצנטיים או בנוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית20. לחלופין, ניתן להשתמש בזני עכברים מהונדסים שונים כגון lysozyme M-green fluorescent protein (LysM-GFP) עכברים כדי לצלם תת-קבוצות ספציפיות של תאי מערכת החיסון כגון נויטרופילים21,22. לאחר מכן ניתן לדמיין את הלויקוציטים בעלי התווית הפלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשדה רחב, מיקרוסקופיה קונפוקלית או מיקרוסקופיית מולטיפוטונים. טכניקות אלה משיגות ניגודיות על ידי שימוש באורכי גל ספציפיים של עירור וגילוי פלואורסצנציה הנפלטת תוך חסימת זיהוי אורך הגל של העירור, ובכך מדגישות את האובייקט המסומן.
מחקרים קיימים הנוגעים לכימות גלגול לויקוציטים, הידבקות וצפיפות נימים תפקודית בריאת מורין הסתמכו בעיקר על ניתוח וידאו ידני. זה מתאפשר באמצעות תוכנות קוד פתוח כגוןFiji 6,23, תוכנה קניינית כגון CapImage12, או מערכות עיבוד תמונה מותאמות אישית24. לעומת זאת, פלטפורמות תוכנה קנייניות שונות (למשל, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) מאפשרות מדידה אוטומטית של מגוון רחב של פרמטרים פיזיולוגיים אחרים, כולל רבים מאלה שהוזכרו כאן קודם לכן 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
נעשו תצפיות חשובות לגבי הפתולוגיה של פגיעה חריפה בריאה (ALI) ותסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS) באמצעות IVM ריאה. ARDS מאופיין בשורה של תהליכים פתופיזיולוגיים בריאה, כולל בצקת ריאות ונזק נאדי הנגרם על ידי תפקוד לקוי של מחסום האנדותל והאפיתל25. באמצעות מודל מורין, נמצא כי ALI המושרה על ידי אלח דם קשור לשינויים מזיקים משמעותיים בסחר בתאי מערכת החיסון בסביבת הריאות26. נויטרופילים שגויסו לנימים של עכברים עם ALI המושרה על ידי אלח דם נמצאו כמעכבים מיקרו-סירקולציה, ובכך מגבירים את ההיפוקסיה ב-ALI26. בנוסף, IVM שימש כדי לקבל תובנות לגבי המנגנון הבסיסי של תיקון לאחר הופעת ARDS27. Lung IVM היה גם כלי רב ערך בהבנת שינויים פתופיזיולוגיים במחלות ריאה חסימתיות שונות. לדוגמה, הדמיה של הובלת ריר במחלות כגון סיסטיק פיברוזיס (CF) ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) אפשרה את המחקר של טיפולים חדשניים וקיימים לפינוי ריריות28. סחר בלוקוציטים בתנאים אלה נותח גםכן 17.
פרוטוקול זה מרחיב את הגישה שתוארה לראשונה על ידי Lamm et al.29 לחקר אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית. הפרוצדורות המתוארות משתמשות במערכת הדמיית ריאות in vivo, הכוללת בסיס מתכת בגודל 16.5 ס”מ על 12.7 ס”מ, מיקרומניפולטור וחלון הדמיית ואקום (איור 1). המערכת מותקנת על פלטפורמה מודפסת תלת-ממדית בגודל 20 ס”מ על 23.5 ס”מ (קובץ משלים 1) כדי לספק חיבור מאובטח לצינורות האוורור ולמשטח החימום. שיטה זו מציעה הדמיה ניתנת לשחזור ולכימות של מיקרו-סירקולציה ריאתית של מורין in vivo. היבטים חשובים של ההכנה הכירורגית, כמו גם ניצול נכון של מערכת הדמיית ריאות מיוצבת ואקום מוסברים בפירוט. לבסוף, מודל ניסיוני של ALI משמש כדי לספק הדמיה ייצוגית וניתוח של גלגול לויקוציטים שהשתנה, הידבקות לויקוציטים וזלוף נימי הקשור לדלקת. השימוש בפרוטוקול זה אמור להקל על חקירות חשובות נוספות של שינויים פתופיזיולוגיים במיקרו-סירקולציה ריאתית במהלך מצבי מחלה חריפים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המוצג כאן דורש תרגול ותשומת לב לכמה שלבים קריטיים. ראשית, חשוב להכין את חלון ההדמיה לפני תחילת האינטובינציה והניתוח. השתמשו בכמות מינימלית של שומן ואקום כדי לצפות את הטבעת החיצונית של חלון ההדמיה, למרוח את זכוכית הכיסוי ולבדוק את היניקה עם טיפת מים מזוקקים. הכנה זו מראש תמנע מהרי…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לד”ר פינה קולארוסו, שסיפקה מומחיות משמעותית בעריכה ובתיקון של כתב יד זה.
Materials
| 1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 1 mL syringe |
| ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm | RWD Life Science Co. | F12002-12 | Blunt forceps |
| Albumin-Fluorescein Isothiocyanate | Sigma-Aldrich | A9771-1G | FITC-albumin |
| Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v | Canadian Custom Packaging Company | 80002455 | Alcohol wipe |
| AVDC110 Advanced Digital Video Converter | Canopus | 00631069602029 | Digital video converter |
| B/W – CCD – Camera | Horn Imaging | BC-71 | Camera |
| Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Cauterizer |
| C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories International | C57BL/6NCrl | C57BL/6 Mice |
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | Cotton applicator |
| CS-8R 8mm Round Glass Coverslip | Warner Instruments | 64-0701 | Glass coverslip |
| Digital Pressure Gauge | ITM Instruments Inc. | DG2551L0NAM02L0IM&V | Digital Pressure Gauge |
| Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope | Dr. Mom Otoscopes | 1001 | Otoscope |
| Ethyl Alchohol 95% Vol | Commercial Alcohols | P016EA95 | 95% ethanol |
| Fine Scissors – Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | Scissors |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | Fisher Scientific | 1590110 | Labeling tape |
| Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump | Cole-Parmer Canada Company | ZA-07061-40 | Vacuum pump |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13003-10 | Hemostatic forceps |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | DC976VF | Vacuum grease |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Isoflurane |
| LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL | Teligent Canada | 0121AD01 | Lidocaine HCl 1% |
| Lung SurgiBoard | Luxidea, Inc. | IMCH-0001 | Designed for intravital microscopy of the lung |
| Mineral Oil | Teva Canada | 00485802 | Mineral oil |
| Mouse Endotracheal Intubation Kit | Kent Scientific Corporation | ETI-MSE | Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable |
| MST49 Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | 10 450 022 | Fluorescence Microscope |
| N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective | Leica Microsystems | 566035 | 20x objective |
| Non-Woven Sponges 2" x 2" | AMD-Ritmed | A2101-CH | Gauze |
| Optixcare Eye Lube Plus | Aventix | 5914322 | Tear gel |
| Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer | Prusa Research | PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI | 3D printer |
| Oxygen, Compressed | Linde Canada Inc. | Oxygen | |
| PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) | Becton, Dickinson and Company | 305106 | 30 G needle |
| Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL | Cole-Parmer Canada Company | 5340-2L | Vacuum flask |
| Rhodamine 6 G | Sigma-Aldrich | 252433 | Rhodamine 6G |
| Secure Soft Cloth Medical Tape – 3" | Primed | PM5-630709 | Cloth tape |
| Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD | Dow Corning | 602-205 | 1.0 mm I.D. polyethylene tubing |
| Somnosuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01, SS-04-module | Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter |
| Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth | World Precision Instruments | 501216 | Toothed forceps |
| Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) | 3M | 7000002795 | Medical tape |
| Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. | Grainger Canada | USSZUSA-HT3314 | 1.0 cm I.D. polyethylene tubing |
| Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm | Cole-Parmer Canada Company | 6720-5002 | Inline 0.2µm filter |
Riferimenti
- Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471 (2021).
- Gaertner, M., et al. Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009 (2015).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Looney, M., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).
- Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice. IntraVital. 3 (2), 29748 (2014).
- Blueschke, G., et al. Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630 (2014).
- Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation. Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).
- Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
- Tschernig, T., et al. Direct visualisation of microparticles in the living lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).
- Mertens, M., et al. Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse. Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).
- Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy. Frontiers in Physiology. 11, 291 (2020).
- Margraf, A., et al. 6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice. Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).
- Roller, J., et al. Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice. Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).
- Marques, P., et al. Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease. Frontiers in Immunology. 8, 1766 (2017).
- Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).
- Trzeciak, S., et al. Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival. Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).
- Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Orthgiess, J., et al. Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research. European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).
- Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).
- Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Amato, M. B. P., et al. Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).
- Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).
