진공 안정화 이미징 시스템을 이용한 실험적 급성 폐 손상에서의 폐 미세순환의 생체내 광역 형광 현미경 검사
Summary
생체 내 형광 현미경 검사는 백혈구 – 내피 상호 작용 및 모세관 관류를 실시간으로 연구하는 데 활용 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 진공-안정화된 폐 영상화 시스템을 사용하여 폐 미세순환에서 이러한 파라미터를 영상화하고 정량화하는 방법을 기술한다.
Abstract
백혈구 – 내피 상호 작용의 생체 내 영상은 살아있는 동물의 면역 매개 질환에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 생체 내에서 급성 폐 손상 (ALI) / 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 및 기타 호흡 병리에 대한 연구는 제한된 접근성과 폐의 고유 한 운동 아티팩트로 인해 어렵습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 도전을 극복하기 위해 다양한 접근법이 개발되었습니다. 이 프로토콜은 ALI의 실험 모델에서 폐 미세순환에서의 실시간 백혈구-내피 상호작용을 연구하기 위해 생체내 형광 현미경 검사에 대한 방법을 기술한다. 생체 내 폐 영상 시스템과 3-D 프린팅된 생체내 현미경 플랫폼은 마취된 마우스를 고정하고 폐를 안정화시키면서 혼란스러운 폐 손상을 최소화하는 데 사용됩니다. 준비 후, 광역 형광 현미경 검사는 백혈구 부착, 백혈구 롤링 및 모세관 기능을 연구하는 데 사용됩니다. 여기에 제시된 프로토콜은 염증성 폐 질환의 급성 모델에서의 이미징에 초점을 맞추지 만, 폐의 다른 병리학 적 및 생리적 과정을 연구하기 위해 적용될 수도 있습니다.
Introduction
생체 내 현미경 (IVM)은 생체 내에서 다양한 생물 물리학 적 과정을 시각화하고 연구하는 데 유용한 이미징 도구입니다. 폐는 밀폐 된 위치, 조직의 깨지기 쉬운 특성 및 호흡 및 심장 박동에 의해 유도 된 모션 아티팩트 1,2로 인해 생체 내에서 이미지화하기가 매우 어렵습니다. 이러한 도전을 극복하기 위해 폐 미세순환에서 백혈구-내피 상호작용의 실시간 이미징을 위해 다양한 생체내 현미경(IVM) 설정이 개발되었습니다. 이러한 접근법은 영상화를 위해 폐를 외과 적으로 노출시키고 안정화시키는 것을 기반으로합니다.
동물은 전형적으로 외과적 절차에 의해 폐 IVM을 위해 제조된다. 첫째, 동물들은 삽관되고 환기되어 흉부 창문을 외과 적으로 절제하고 이미징을 위해 폐를 안정시키기위한 후속 개입을 허용합니다. 한 가지 기술은 실질종을 유리 커버 슬립3에 붙이는 것인데, 이는 이미지 된 조직에 심각한 신체적 외상을 줄 위험이 있습니다. 보다 진보된 것은 유리 창 하에서 폐를 안정화시키기 위한 진공 시스템의 활용이다(4). 이 설정은 넓은 국소 영역에 걸쳐 확산되는 가역적 진공을 통해 커버슬립에 대한 폐 표면의 느슨한 부착을 용이하게 하고, x, y 및 z 치수4에서의 이동을 제한하면서 폐를 확장시킨다. 진공은 셋업의 이미징 영역을 둘러싸는 채널을 통해 고르게 적용되고, 이미징 등급 커버슬립(4)을 향하는 얕은 원뿔형 영역으로 조직을 당긴다. 이 시청 창을 통해, 폐 미세 순환은 다양한 광학 이미징 양식을 사용하여 연구 될 수 있습니다.
폐 IVM은 다수의 미세순환 파라미터의 정량적 이미징을 가능하게 한다. 여기에는 백혈구 추적 속도 및 길이5, 적혈구 유속6 및 산소화7, 종양 전이8, 면역 세포 하위집단의 구별 9,10,11, 미세입자의 시각화 12, 폐포 역학13,14, 혈관 투과성15, 및 모세관 기능 16과 같은 측정이 포함됩니다. . 여기서 초점은 백혈구 모집 및 모세관 기능에 있습니다. 폐 미세순환에서 백혈구 모집의 개시는 백혈구와 내피 세포 사이의 일시적인 롤링 상호작용 및 확고한 접착 상호작용을 포함하며, 둘 다 염증 조건 하에서 증가된다16,17. 전형적으로, 압연은 오퍼레이터-정의된 기준선을 통과하는 백혈구의 수에 의해 정량화되는 반면, 부착은 내피(16) 상에서 움직이지 않는 백혈구의 수에 의해 정량화된다. 모세관 기능은 또한 염증 상태에서 영향을 받을 수 있으며, 종종 관류 감소를 초래합니다. 이는 적혈구 변형성(18)의 감소 및 병리학적 션트(19)를 초래하는 내피 세포에 의한 유도성 NO 신타제의 잡색발현을 포함하는 몇몇 인자에 기인할 수 있다. 전형적으로, 면적당 관류된 모세혈관의 응집체 길이는 측정되고 기능적 모세관 밀도(FCD)로서 보고된다.
폐에서 백혈구 모집을 실시간으로 연구하려면 형광 염료 또는 형광 표지 항체20으로 생물학적 표적을 표지해야합니다. 대안적으로, 리소자임 M-녹색 형광 단백질(LysM-GFP) 마우스와 같은 다양한 트랜스제닉 마우스 균주는 호중구21,22와 같은 특이적 면역 세포 서브세트를 이미지화하는데 이용될 수 있다. 형광 표지된 백혈구는 광역 형광 현미경, 공초점 현미경 또는 다중 광자 현미경을 사용하여 시각화할 수 있습니다. 이러한 기술은 특정 여기 파장을 활용하고 방출된 형광을 검출하는 동시에 여기 파장의 검출을 차단함으로써 대조를 달성함으로써 라벨링된 물체를 강조한다.
뮤린 폐에서 백혈구 롤링, 접착 및 기능적 모세관 밀도의 정량화에 관한 기존 연구는 주로 수동 비디오 분석에 의존해 왔습니다. 이것은 피지(6,23)와 같은 오픈 소스 소프트웨어, CapImage12와 같은 독점 소프트웨어 또는 맞춤형 이미지 처리 시스템(24)을 통해 가능하게 된다. 반대로, 다양한 독점 소프트웨어 플랫폼(예를 들어, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph)은 이전에 언급한 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15를 포함하는 다양한 다른 생리학적 파라미터들의 자동화된 측정을 가능하게 한다.
폐 IVM을 이용한 급성 폐 손상 (ALI) 및 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)의 병리학에 관한 중요한 관찰이 이루어졌습니다. ARDS는 내피 및 상피 장벽(25)의 기능장애로 인한 폐부종 및 폐포 손상을 포함하는 폐의 병리생리학적 과정의 숙주를 특징으로 한다. 뮤린 모델을 사용하여, 패혈증-유도된 ALI가 폐 환경에서의 면역 세포 밀매의 유의한 해로운 변화와 연관된다는 것이 밝혀졌다(26). 패혈증 유발 ALI를 가진 마우스의 모세혈관으로 모집된 호중구는 미세순환을 방해하는 것으로 밝혀졌으며, 이로써 ALI26에서 저산소증이 증가하였다. 또한, IVM은 ARDS27의 발병 후 수리의 기본 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해 사용되었습니다. 폐 IVM은 또한 다양한 폐쇄성 폐 질환의 병리생리학적 변화를 이해하는 데 유용한 도구이다. 예를 들어, 낭포성 섬유증 (CF) 및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)과 같은 질병에서 점액 수송의 시각화는 점액 클리어런스28에 대한 신규 및 기존 치료법의 연구를 촉진시켰다. 이러한 조건하에서의 백혈구 밀매는또한 17 뿐만 아니라 분석되었다.
이 프로토콜은 Lamm et al.29 에 의해 초기에 기술된 접근법을 확장하여 기존의 형광 현미경을 사용하여 백혈구-내피 상호작용을 연구한다. 설명된 절차는 16.5 cm x 12.7 cm 금속 베이스, 미세 조작기 및 진공 이미징 윈도우를 포함하는 생체내 폐 영상 시스템을 채용한다(도 1). 이 시스템은 20cm x 23.5cm 3D 인쇄 플랫폼(보충 파일 1)에 장착되어 인공 호흡기 튜브 및 난방 패드에 안전하게 부착할 수 있습니다. 이 방법은 생체 내에서 뮤린 폐 미세 순환의 재현 가능하고 정량화 가능한 이미징을 제공합니다. 수술 준비의 중요한 측면뿐만 아니라 진공 안정화 폐 영상 시스템의 적절한 활용이 자세히 설명된다. 마지막으로, ALI의 실험 모델은 염증과 관련된 변경된 백혈구 롤링, 백혈구 부착 및 모세관 관류의 대표적인 이미징 및 분석을 제공하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜의 사용은 급성 질환 상태 동안 폐 미세 순환의 병리 생리학적 변화에 대한 더 중요한 조사를 촉진해야한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 몇 가지 중요한 단계에 대한 연습과주의가 필요합니다. 첫째, 삽관 및 수술을 시작하기 전에 이미징 창을 준비하는 것이 중요합니다. 최소한의 진공 그리스를 사용하여 이미징 창의 외부 링을 코팅하고, 커버 글라스를 적용하고, 증류수 한 방울로 흡입을 테스트합니다. 이것을 미리 준비하면 그렇지 않으면 설치 중에 노출 된 폐가 건조되는 것을 방지 할 수 있습니다. 따…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는이 원고의 편집 및 수정에 상당한 전문 지식을 제공 한 Pina Colarusso 박사에게 감사하고 싶습니다.
Materials
| 1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 1 mL syringe |
| ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm | RWD Life Science Co. | F12002-12 | Blunt forceps |
| Albumin-Fluorescein Isothiocyanate | Sigma-Aldrich | A9771-1G | FITC-albumin |
| Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v | Canadian Custom Packaging Company | 80002455 | Alcohol wipe |
| AVDC110 Advanced Digital Video Converter | Canopus | 00631069602029 | Digital video converter |
| B/W – CCD – Camera | Horn Imaging | BC-71 | Camera |
| Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Cauterizer |
| C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories International | C57BL/6NCrl | C57BL/6 Mice |
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | Cotton applicator |
| CS-8R 8mm Round Glass Coverslip | Warner Instruments | 64-0701 | Glass coverslip |
| Digital Pressure Gauge | ITM Instruments Inc. | DG2551L0NAM02L0IM&V | Digital Pressure Gauge |
| Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope | Dr. Mom Otoscopes | 1001 | Otoscope |
| Ethyl Alchohol 95% Vol | Commercial Alcohols | P016EA95 | 95% ethanol |
| Fine Scissors – Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | Scissors |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | Fisher Scientific | 1590110 | Labeling tape |
| Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump | Cole-Parmer Canada Company | ZA-07061-40 | Vacuum pump |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13003-10 | Hemostatic forceps |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | DC976VF | Vacuum grease |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Isoflurane |
| LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL | Teligent Canada | 0121AD01 | Lidocaine HCl 1% |
| Lung SurgiBoard | Luxidea, Inc. | IMCH-0001 | Designed for intravital microscopy of the lung |
| Mineral Oil | Teva Canada | 00485802 | Mineral oil |
| Mouse Endotracheal Intubation Kit | Kent Scientific Corporation | ETI-MSE | Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable |
| MST49 Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | 10 450 022 | Fluorescence Microscope |
| N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective | Leica Microsystems | 566035 | 20x objective |
| Non-Woven Sponges 2" x 2" | AMD-Ritmed | A2101-CH | Gauze |
| Optixcare Eye Lube Plus | Aventix | 5914322 | Tear gel |
| Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer | Prusa Research | PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI | 3D printer |
| Oxygen, Compressed | Linde Canada Inc. | Oxygen | |
| PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) | Becton, Dickinson and Company | 305106 | 30 G needle |
| Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL | Cole-Parmer Canada Company | 5340-2L | Vacuum flask |
| Rhodamine 6 G | Sigma-Aldrich | 252433 | Rhodamine 6G |
| Secure Soft Cloth Medical Tape – 3" | Primed | PM5-630709 | Cloth tape |
| Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD | Dow Corning | 602-205 | 1.0 mm I.D. polyethylene tubing |
| Somnosuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01, SS-04-module | Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter |
| Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth | World Precision Instruments | 501216 | Toothed forceps |
| Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) | 3M | 7000002795 | Medical tape |
| Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. | Grainger Canada | USSZUSA-HT3314 | 1.0 cm I.D. polyethylene tubing |
| Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm | Cole-Parmer Canada Company | 6720-5002 | Inline 0.2µm filter |
Riferimenti
- Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471 (2021).
- Gaertner, M., et al. Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009 (2015).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Looney, M., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).
- Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice. IntraVital. 3 (2), 29748 (2014).
- Blueschke, G., et al. Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630 (2014).
- Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation. Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).
- Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
- Tschernig, T., et al. Direct visualisation of microparticles in the living lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).
- Mertens, M., et al. Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse. Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).
- Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy. Frontiers in Physiology. 11, 291 (2020).
- Margraf, A., et al. 6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice. Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).
- Roller, J., et al. Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice. Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).
- Marques, P., et al. Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease. Frontiers in Immunology. 8, 1766 (2017).
- Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).
- Trzeciak, S., et al. Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival. Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).
- Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Orthgiess, J., et al. Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research. European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).
- Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).
- Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Amato, M. B. P., et al. Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).
- Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).
