Microscopia de Fluorescência De Largura Intravital de Microcirculação Pulmonar em Lesão Pulmonar Aguda Experimental Usando um Sistema de Imagem Estabilizada a Vácuo
Summary
A microscopia de fluorescência intravital pode ser utilizada para estudar interações leucócito-endotelial e perfusão capilar em tempo real. Este protocolo descreve métodos para imagem e quantificação desses parâmetros na microcirculação pulmonar usando um sistema de imagem pulmonar estabilizado a vácuo.
Abstract
A imagem intravital das interações leucócito-endotelial oferece insights valiosos sobre doenças imunomediadas em animais vivos. O estudo da lesão pulmonar aguda (ALI)/síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS) e outras patologias respiratórias in vivo é difícil devido à acessibilidade limitada e artefatos de movimento inerentes aos pulmões. No entanto, várias abordagens foram desenvolvidas para superar esses desafios. Este protocolo descreve um método para microscopia de fluorescência intravital para estudar interações leucócito-endoteliais em tempo real na microcirculação pulmonar em um modelo experimental de ALI. Um sistema de imagem pulmonar in vivo e uma plataforma de microscopia intravital impressa em 3D são usados para proteger o camundongo anestesiado e estabilizar o pulmão, minimizando a lesão pulmonar confusa. Após a preparação, a microscopia de fluorescência widefield é usada para estudar a adesão de leucócitos, rolamento de leucócitos e função capilar. Embora o protocolo aqui apresentado se concentre na imagem em um modelo agudo de doença pulmonar inflamatória, ele também pode ser adaptado para estudar outros processos patológicos e fisiológicos no pulmão.
Introduction
A microscopia intravital (IVM) é uma ferramenta útil de imagem para visualizar e estudar vários processos biofísicos in vivo. O pulmão é altamente desafiador para a imagem in vivo devido à sua localização fechada, a natureza frágil de seu tecido, e artefatos de movimento induzidos pela respiração e batimentos cardíacos 1,2. Várias configurações de microscopia intravital (IVM) foram desenvolvidas para imagens em tempo real de interações leucócito-endotelial em microcirculação pulmonar para superar esses desafios. Tais abordagens baseiam-se na exposição cirúrgica e estabilização do pulmão para imagem.
Os animais são tipicamente preparados para o IVM pulmonar por procedimentos cirúrgicos. Primeiro, os animais são entubados e ventilados, o que permite a excisão cirúrgica de uma janela torácica e intervenções subsequentes para estabilizar o pulmão para imagem. Uma técnica envolve colar o parenchyma em uma tampa de vidro3, procedimento que corre o risco de trauma físico significativo no tecido imageado. Mais avançado é a utilização de um sistema de vácuo para estabilizar o pulmão sob uma janela de vidro4. Esta configuração facilita a adesão frouxa da superfície pulmonar ao deslizamento de cobertura através de um vácuo reversível espalhado sobre uma grande área local e expande o pulmão enquanto ainda limita o movimento nas dimensões x, y e z4. O vácuo é aplicado uniformemente através de um canal ao redor da área de imagem da configuração e puxa o tecido para uma região cônica rasa de frente para o deslizamento de grau de imagem4. Através desta janela de visualização, a microcirculação pulmonar pode ser estudada utilizando várias modalidades de imagem óptica.
O IVM pulmonar permite imagens quantitativas de uma infinidade de parâmetros microcirculatórios. Estes incluem medidas como velocidade da pista leucócito e comprimento5, velocidade de fluxo de glóbulos vermelhos6 e oxigenação7, metástasestumorais 8, distinção de subpopulações de células imunes 9,10,11, visualização de micropartículas12, dinâmica alveolar13,14, permeabilidade vascular15, e função capilar16 . O foco aqui é o recrutamento de leucócitos e a função capilar. O início do recrutamento de leucócitos na microcirculação pulmonar envolve interações rolantes transitórias e interações adesivas firmes entre leucócitos e células endoteliais, ambas aumentadas sob condições inflamatórias16,17. Normalmente, a rolagem é quantificada pelo número de leucócitos que passam por uma linha de referência definida pelo operador, enquanto a adesão é quantificada pelo número de leucócitos que são imóveis no endotélio16. A função capilar também pode ser afetada em estados inflamatórios, muitas vezes resultando em diminuição da perfusão. Isso pode ser atribuído a vários fatores, incluindo uma redução da deformabilidade dos glóbulos vermelhos18 e expressão variegada de sinthase indutível por células endoteliais resultando em desvio patológico19. Normalmente, o comprimento agregado de capilares perfusados por área é medido e relatado como densidade capilar funcional (FCD).
Estudar o recrutamento de leucócitos nos pulmões em tempo real requer rotular alvos biológicos com corantes fluorescentes ou anticorpos fluorescentes20. Alternativamente, várias cepas de camundongos transgênicos, como camundongos lysozyme M-green fluorescente (LysM-GFP), podem ser utilizadas para imagem de subconjuntos de células imunes específicas, como os neutrófilos21,22. Os leucócitos com rótulo fluorescente podem então ser visualizados usando microscopia de fluorescência widefield, microscopia confocal ou microscopia multifotífera. Essas técnicas conseguem o contraste utilizando comprimentos de onda de excitação específicos e detectando fluorescência emitida ao mesmo tempo em que bloqueiam simultaneamente a detecção do comprimento de onda de excitação, destacando assim o objeto rotulado.
Pesquisas existentes sobre a quantificação do rolamento de leucócitos, adesão e densidade capilar funcional no pulmão murino basearam-se principalmente na análise manual de vídeo. Isso é possível através de software de código aberto, como o Fiji 6,23, software proprietário como o CapImage12 ou sistemas de processamento de imagempersonalizados 24. Por outro lado, várias plataformas de software proprietárias (por exemplo, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) permitem a medição automatizada de uma ampla gama de outros parâmetros fisiológicos, incluindo muitos dos mencionados anteriormente aqui 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Observações importantes têm sido feitas em relação à patologia da lesão pulmonar aguda (ALI) e síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS) utilizando IVM pulmonar. A ARDS é caracterizada por uma série de processos fisiodicosiológicos no pulmão, incluindo edema pulmonar e danos alveolares causados pela disfunção do endotélio e barreira epitelial25. Usando um modelo murino, descobriu-se que a ALI induzida pela sepse está associada a mudanças prejudiciais significativas no tráfico de células imunes no ambiente pulmonar26. Os neutrófilos recrutados para os capilares de camundongos com ALI induzido pela sepse foram encontrados para impedir a microcirculação, aumentando assim a hipóxia em ALI26. Além disso, o IVM tem sido usado para obter insights sobre o mecanismo de reparo subjacente após o início do ARDS27. O IVM pulmonar também tem sido uma ferramenta valiosa na compreensão de alterações fisiodicosiológicas em várias doenças pulmonares obstrutivas. Por exemplo, a visualização do transporte de mucosa em doenças como fibrose cística (CF) e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) tem facilitado o estudo de tratamentos novos e existentes para a liberação de mucosas28. O tráfico de leucócitos nessas condições também foi analisado, assim como17.
Este protocolo expande a abordagem inicialmente descrita por Lamm et al.29 para estudar interações leucócito-endotelial usando microscopia de fluorescência convencional. Os procedimentos descritos empregam um sistema de imagem pulmonar in vivo , que inclui uma base metálica de 16,5 cm x 12,7 cm, micromanipulador e janela de imagem a vácuo (Figura 1). O sistema é montado em uma plataforma impressa 3D de 20 cm x 23,5 cm (Arquivo Suplementar 1) para fornecer fixação segura para o tubo do ventilador e almofada de aquecimento. Este método oferece imagens reprodutíveis e quantificáveis de microcirculação pulmonar murina em vivo. Aspectos importantes da preparação cirúrgica, bem como a utilização adequada de um sistema de imagem pulmonar estabilizado a vácuo são explicados em detalhes. Finalmente, um modelo experimental de ALI é usado para fornecer imagens representativas e análises de rolagem de leucócitos alterados, aderência leucócito e perfusão capilar associada à inflamação. O uso deste protocolo deve facilitar investigações mais importantes sobre alterações fisiofisiológicas na microcirculação pulmonar durante estados com doenças agudas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui apresentado requer prática e atenção a alguns passos críticos. Primeiro, é importante preparar a janela de imagem antes de iniciar a intubação e a cirurgia. Use uma quantidade mínima de graxa de vácuo para revestir o anel externo da janela de imagem, aplique o vidro de cobertura e teste a sucção com uma gota de água destilada. Prepará-lo com antecedência evitará que o pulmão exposto seque durante a configuração de outra forma. Embora seja possível lavar com soro fisiológico quente, is…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem à Dra.
Materials
| 1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 1 mL syringe |
| ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm | RWD Life Science Co. | F12002-12 | Blunt forceps |
| Albumin-Fluorescein Isothiocyanate | Sigma-Aldrich | A9771-1G | FITC-albumin |
| Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v | Canadian Custom Packaging Company | 80002455 | Alcohol wipe |
| AVDC110 Advanced Digital Video Converter | Canopus | 00631069602029 | Digital video converter |
| B/W – CCD – Camera | Horn Imaging | BC-71 | Camera |
| Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Cauterizer |
| C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories International | C57BL/6NCrl | C57BL/6 Mice |
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | Cotton applicator |
| CS-8R 8mm Round Glass Coverslip | Warner Instruments | 64-0701 | Glass coverslip |
| Digital Pressure Gauge | ITM Instruments Inc. | DG2551L0NAM02L0IM&V | Digital Pressure Gauge |
| Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope | Dr. Mom Otoscopes | 1001 | Otoscope |
| Ethyl Alchohol 95% Vol | Commercial Alcohols | P016EA95 | 95% ethanol |
| Fine Scissors – Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | Scissors |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | Fisher Scientific | 1590110 | Labeling tape |
| Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump | Cole-Parmer Canada Company | ZA-07061-40 | Vacuum pump |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13003-10 | Hemostatic forceps |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | DC976VF | Vacuum grease |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Isoflurane |
| LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL | Teligent Canada | 0121AD01 | Lidocaine HCl 1% |
| Lung SurgiBoard | Luxidea, Inc. | IMCH-0001 | Designed for intravital microscopy of the lung |
| Mineral Oil | Teva Canada | 00485802 | Mineral oil |
| Mouse Endotracheal Intubation Kit | Kent Scientific Corporation | ETI-MSE | Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable |
| MST49 Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | 10 450 022 | Fluorescence Microscope |
| N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective | Leica Microsystems | 566035 | 20x objective |
| Non-Woven Sponges 2" x 2" | AMD-Ritmed | A2101-CH | Gauze |
| Optixcare Eye Lube Plus | Aventix | 5914322 | Tear gel |
| Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer | Prusa Research | PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI | 3D printer |
| Oxygen, Compressed | Linde Canada Inc. | Oxygen | |
| PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) | Becton, Dickinson and Company | 305106 | 30 G needle |
| Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL | Cole-Parmer Canada Company | 5340-2L | Vacuum flask |
| Rhodamine 6 G | Sigma-Aldrich | 252433 | Rhodamine 6G |
| Secure Soft Cloth Medical Tape – 3" | Primed | PM5-630709 | Cloth tape |
| Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD | Dow Corning | 602-205 | 1.0 mm I.D. polyethylene tubing |
| Somnosuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01, SS-04-module | Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter |
| Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth | World Precision Instruments | 501216 | Toothed forceps |
| Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) | 3M | 7000002795 | Medical tape |
| Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. | Grainger Canada | USSZUSA-HT3314 | 1.0 cm I.D. polyethylene tubing |
| Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm | Cole-Parmer Canada Company | 6720-5002 | Inline 0.2µm filter |
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