Summary

Intravitale widefield fluorescentiemicroscopie van pulmonale microcirculatie bij experimenteel acuut longletsel met behulp van een vacuümgestabiliseerd beeldvormingssysteem

Published: April 06, 2022
doi:

Summary

Intravitale fluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om leukocyten-endotheelinteracties en capillaire perfusie in realtime te bestuderen. Dit protocol beschrijft methoden om deze parameters in de pulmonale microcirculatie in beeld te brengen en te kwantificeren met behulp van een vacuümgestabiliseerd longbeeldvormingssysteem.

Abstract

Intravitale beeldvorming van leukocyten-endotheelinteracties biedt waardevolle inzichten in immuungemedieerde ziekten bij levende dieren. De studie van acute longbeschadiging (ALI) / acute respiratory distress syndrome (ARDS) en andere respiratoire pathologieën in vivo is moeilijk vanwege de beperkte toegankelijkheid en inherente bewegingsartefacten van de longen. Niettemin zijn er verschillende benaderingen ontwikkeld om deze uitdagingen het hoofd te bieden. Dit protocol beschrijft een methode voor intravitale fluorescentiemicroscopie om real-time leukocyten-endotheelinteracties in de pulmonale microcirculatie te bestuderen in een experimenteel model van ALI. Een in vivo longbeeldvormingssysteem en een 3D-geprint intravitaal microscopieplatform worden gebruikt om de verdoofde muis te beveiligen en de long te stabiliseren, terwijl verstorend longletsel wordt geminimaliseerd. Na voorbereiding wordt widefield fluorescentiemicroscopie gebruikt om leukocytenadhesie, leukocytenrollen en capillaire functie te bestuderen. Hoewel het hier gepresenteerde protocol zich richt op beeldvorming in een acuut model van inflammatoire longziekte, kan het ook worden aangepast om andere pathologische en fysiologische processen in de long te bestuderen.

Introduction

Intravitale microscopie (IVM) is een nuttig beeldvormingsinstrument voor het visualiseren en bestuderen van verschillende biofysische processen in vivo. De long is zeer uitdagend om in vivo in beeld te brengen vanwege de ingesloten locatie, de fragiele aard van het weefsel en bewegingsartefacten veroorzaakt door ademhaling en hartslag 1,2. Verschillende intravitale microscopie (IVM) opstellingen zijn ontwikkeld voor real-time beeldvorming van leukocyt-endotheel interacties in pulmonale microcirculatie om deze uitdagingen te overwinnen. Dergelijke benaderingen zijn gebaseerd op het chirurgisch blootstellen en stabiliseren van de long voor beeldvorming.

Dieren worden meestal voorbereid op long IVM door chirurgische ingrepen. Ten eerste worden dieren geïntubeerd en beademd, wat chirurgische excisie van een thoracale venster en daaropvolgende interventies mogelijk maakt om de long te stabiliseren voor beeldvorming. Eén techniek omvat het lijmen van het parenchym op een glazen afdekplaat3, een procedure die een aanzienlijk fysiek trauma aan het afgebeelde weefsel riskeert. Geavanceerder is het gebruik van een vacuümsysteem om de long te stabiliseren onder een glazen venster4. Deze opstelling vergemakkelijkt de losse hechting van het longoppervlak aan de coverslip via een omkeerbaar vacuüm verspreid over een groot lokaal gebied en breidt de long uit terwijl de beweging in x-, y- en z-dimensies4 nog steeds wordt beperkt. Het vacuüm wordt gelijkmatig aangebracht door een kanaal rond het beeldvormende gebied van de opstelling en trekt het weefsel in een ondiep conisch gebied tegenover de imaging-grade coverslip4. Via dit kijkvenster kan de longmicrocirculatie worden bestudeerd met behulp van verschillende optische beeldvormingsmodaliteiten.

Long IVM maakt kwantitatieve beeldvorming van een veelheid aan microcirculatieparameters mogelijk. Deze omvatten metingen zoals leukocytenspoorsnelheid en -lengte5, rode bloedcelstroomsnelheid6 en oxygenatie7, tumormetastasen8, het onderscheid van immuuncelsubpopulaties 9,10,11, visualisatie van microdeeltjes12, alveolaire dynamica13,14, vasculaire permeabiliteit15 en capillaire functie16 . De focus ligt hier op leukocytenrekrutering en capillaire functie. Initiatie van leukocytenrekrutering in de pulmonale microcirculatie omvat voorbijgaande rollende interacties en stevige kleefinteracties tussen leukocyten en endotheelcellen, die beide verhoogd zijn onder ontstekingsomstandigheden 16,17. Typisch wordt rollen gekwantificeerd door het aantal leukocyten dat een door de operator gedefinieerde referentielijn passeert, terwijl de adhesie wordt gekwantificeerd door het aantal leukocyten dat onbeweeglijk is op het endotheel16. Capillaire functie kan ook worden beïnvloed in inflammatoire toestanden, vaak resulterend in verminderde perfusie. Dit kan worden toegeschreven aan verschillende factoren, waaronder een vermindering van de vervormbaarheid van rode bloedcellen18 en bonte expressie van induceerbare NO-synthase door endotheelcellen, resulterend in pathologische rangering19. Doorgaans wordt de totale lengte van geperfuseerde haarvaten per gebied gemeten en gerapporteerd als functionele capillaire dichtheid (FCD).

Het bestuderen van leukocytenrekrutering in de longen in realtime vereist het labelen van biologische doelen met fluorescerende kleurstoffen of fluorescerend gelabelde antilichamen20. Als alternatief kunnen verschillende transgene muizenstammen zoals lysozyme M-green fluorescent protein (LysM-GFP) muizen worden gebruikt om specifieke immuuncelsubsets zoals neutrofielen21,22 in beeld te brengen. De fluorescerend gelabelde leukocyten kunnen vervolgens worden gevisualiseerd met behulp van widefield fluorescentiemicroscopie, confocale microscopie of multifotonenmicroscopie. Deze technieken bereiken contrast door gebruik te maken van specifieke excitatiegolflengten en uitgezonden fluorescentie te detecteren, terwijl tegelijkertijd de detectie van de excitatiegolflengte wordt geblokkeerd, waardoor het gelabelde object wordt gemarkeerd.

Bestaand onderzoek naar de kwantificering van leukocytenrollen, adhesie en functionele capillaire dichtheid in de muizenlong is voornamelijk gebaseerd op handmatige video-analyse. Dit wordt mogelijk gemaakt door open-source software zoals Fiji 6,23, propriëtaire software zoals CapImage12, of op maat gemaakte beeldverwerkingssystemen24. Omgekeerd maken verschillende eigen softwareplatforms (bijv. NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) geautomatiseerde meting mogelijk van een breed scala aan andere fysiologische parameters, waaronder veel van de eerder hier genoemde 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.

Er zijn belangrijke observaties gedaan met betrekking tot de pathologie van acuut longletsel (ALI) en acute respiratory distress syndrome (ARDS) met behulp van long IVM. ARDS wordt gekenmerkt door een groot aantal pathofysiologische processen in de longen, waaronder longoedeem en alveolaire schade veroorzaakt door disfunctie van het endotheel en de epitheliale barrière25. Met behulp van een muizenmodel is gebleken dat sepsis-geïnduceerde ALI geassocieerd is met significante schadelijke veranderingen in de handel in immuuncellen in de longomgeving26. Neutrofielen die werden gerekruteerd voor de haarvaten van muizen met sepsis-geïnduceerde ALI bleken de microcirculatie te belemmeren, waardoor hypoxie in ALI26 toenam. Daarnaast is IVM gebruikt om inzicht te krijgen in het onderliggende reparatiemechanisme na het begin van ARDS27. Long IVM is ook een waardevol hulpmiddel geweest bij het begrijpen van pathofysiologische veranderingen in verschillende obstructieve longziekten. Visualisatie van slijmtransport bij ziekten zoals cystic fibrosis (CF) en chronische obstructieve longziekte (COPD) heeft bijvoorbeeld de studie van nieuwe en bestaande behandelingen voor slijmklaringvergemakkelijkt 28. Leukocytenhandel onder deze omstandigheden is ook geanalyseerd17.

Dit protocol borduurt voort op de aanpak die oorspronkelijk werd beschreven door Lamm et al.29 om leukocyten-endotheelinteracties te bestuderen met behulp van conventionele fluorescentiemicroscopie. De beschreven procedures maken gebruik van een in vivo longbeeldvormingssysteem, dat een metalen basis van 16,5 cm x 12,7 cm, micromanipulator en vacuümbeeldvormingsvenster omvat (figuur 1). Het systeem is gemonteerd in een 20 cm x 23,5 cm 3D-geprint platform (Supplemental File 1) om een veilige bevestiging voor de ventilatorbuis en het verwarmingskussen te bieden. Deze methode biedt reproduceerbare en kwantificeerbare beeldvorming van murine pulmonale microcirculatie in vivo. Belangrijke aspecten van de chirurgische voorbereiding en het juiste gebruik van een vacuümgestabiliseerd longbeeldvormingssysteem worden in detail uitgelegd. Ten slotte wordt een experimenteel model van ALI gebruikt om representatieve beeldvorming en analyse te bieden van veranderde leukocytenrollen, leukocytenadhesie en capillaire perfusie geassocieerd met ontsteking. Het gebruik van dit protocol moet verder belangrijk onderzoek naar pathofysiologische veranderingen in de pulmonale microcirculatie tijdens acute ziektetoestanden vergemakkelijken.

Protocol

Alle hier beschreven procedures werden uitgevoerd met voorafgaande goedkeuring van de Dalhousie University Committee on Laboratory Animals (UCLA). 1. Voorbereiding Longbeeldvormingssysteem: Om het venster voor te bereiden, dient u een dunne laag vacuümvet toe aan de bovenkant van de buitenste ring terwijl verontreiniging van het vacuümkanaal wordt vermeden. Plaats een schone glazen afdekplaat van 8 mm op het raam en druk zachtjes naar beneden om een afdichting te c…

Representative Results

Om de resultaten te illustreren die via dit protocol kunnen worden bereikt, werd acuut longletsel (ALI) geïnduceerd 6 uur voorafgaand aan beeldvorming met behulp van een model van intranasale bacteriële lipopolysaccharide (LPS) instillatie. In het kort werden muizen (n = 3) verdoofd met isofluraan en kleine druppeltjes LPS van Pseudomonas aeruginosa in steriele zoutoplossing (10 mg / ml) werden in de linker naris gepipetteerd in een dosering van 5 mg / kg. Dit werd vergeleken met naïeve muizen (n = 3; geen in…

Discussion

Het hier gepresenteerde protocol vereist oefening en aandacht voor een paar kritieke stappen. Ten eerste is het belangrijk om het beeldvormingsvenster voor te bereiden voordat de intubatie en operatie worden gestart. Gebruik een minimale hoeveelheid vacuümvet om de buitenste ring van het beeldvenster te coaten, breng het afdekglas aan en test de zuigkracht met een druppel gedestilleerd water. Door dit van tevoren voor te bereiden, voorkomt u dat de blootgestelde long tijdens de installatie uitdroogt. Hoewel het mogelijk…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen dr. Pina Colarusso bedanken, die aanzienlijke expertise heeft geleverd bij het redigeren en herzien van dit manuscript.

Materials

1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use Becton, Dickinson and Company 309659 1 mL syringe
ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm RWD Life Science Co. F12002-12 Blunt forceps
Albumin-Fluorescein Isothiocyanate Sigma-Aldrich A9771-1G FITC-albumin
Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v Canadian Custom Packaging Company 80002455 Alcohol wipe
AVDC110 Advanced Digital Video Converter Canopus 00631069602029 Digital video converter
B/W – CCD – Camera Horn Imaging BC-71 Camera
Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit Fine Science Tools 18010-00 Cauterizer
C57BL/6 Mice Charles River Laboratories International C57BL/6NCrl C57BL/6 Mice
Cotton Tipped Applicators Puritan 806-WC Cotton applicator
CS-8R 8mm Round Glass Coverslip Warner Instruments 64-0701 Glass coverslip
Digital Pressure Gauge ITM Instruments Inc. DG2551L0NAM02L0IM&V Digital Pressure Gauge
Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope Dr. Mom Otoscopes 1001 Otoscope
Ethyl Alchohol 95% Vol Commercial Alcohols P016EA95 95% ethanol
Fine Scissors – Martensitic Stainless Steel Fine Science Tools 14094-11 Scissors
Fisherbrand Colored Labeling Tape Fisher Scientific 1590110 Labeling tape
Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump Cole-Parmer Canada Company ZA-07061-40 Vacuum pump
Hartman Hemostats Fine Science Tools 13003-10 Hemostatic forceps
High Vacuum Grease Dow Corning DC976VF Vacuum grease
Isoflurane USP Fresenius Kabi CP0406V2 Isoflurane
LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL Teligent Canada 0121AD01 Lidocaine HCl 1%
Lung SurgiBoard Luxidea, Inc. IMCH-0001 Designed for intravital microscopy of the lung
Mineral Oil Teva Canada 00485802 Mineral oil
Mouse Endotracheal Intubation Kit Kent Scientific Corporation ETI-MSE Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable
MST49 Fluorescence Microscope Leica Microsystems 10 450 022 Fluorescence Microscope
N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective Leica Microsystems 566035 20x objective
Non-Woven Sponges 2" x 2" AMD-Ritmed A2101-CH Gauze
Optixcare Eye Lube Plus Aventix 5914322 Tear gel
Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer Prusa Research PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI 3D printer
Oxygen, Compressed Linde Canada Inc. Oxygen
PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) Becton, Dickinson and Company 305106 30 G needle
Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL Cole-Parmer Canada Company 5340-2L Vacuum flask
Rhodamine 6 G Sigma-Aldrich 252433 Rhodamine 6G
Secure Soft Cloth Medical Tape – 3" Primed PM5-630709 Cloth tape
Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD Dow Corning 602-205 1.0 mm I.D. polyethylene tubing
Somnosuite Low-Flow Anesthesia System Kent Scientific Corporation SS-01, SS-04-module Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter
Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth World Precision Instruments 501216 Toothed forceps
Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) 3M 7000002795 Medical tape
Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. Grainger Canada USSZUSA-HT3314 1.0 cm I.D. polyethylene tubing
Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm Cole-Parmer Canada Company 6720-5002 Inline 0.2µm filter

Riferimenti

  1. Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471 (2021).
  2. Gaertner, M., et al. Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009 (2015).
  3. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  4. Looney, M., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).
  5. Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice. IntraVital. 3 (2), 29748 (2014).
  6. Blueschke, G., et al. Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630 (2014).
  7. Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).
  8. Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
  9. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
  10. Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation. Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).
  11. Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
  12. Tschernig, T., et al. Direct visualisation of microparticles in the living lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).
  13. Mertens, M., et al. Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse. Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).
  14. Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy. Frontiers in Physiology. 11, 291 (2020).
  15. Margraf, A., et al. 6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice. Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).
  16. Roller, J., et al. Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice. Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).
  17. Marques, P., et al. Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease. Frontiers in Immunology. 8, 1766 (2017).
  18. Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).
  19. Trzeciak, S., et al. Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival. Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).
  20. Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).
  21. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  22. Orthgiess, J., et al. Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research. European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
  25. Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
  26. Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
  27. Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).
  28. Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).
  29. Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).
  30. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  31. Amato, M. B. P., et al. Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).
  32. Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).

Play Video

Citazione di questo articolo
Hall, S., Faridi, S., Euodia, I., Tanner, S., Chojnacki, A. K., Patel, K. D., Zhou, J., Lehmann, C. Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System. J. Vis. Exp. (182), e63733, doi:10.3791/63733 (2022).

View Video