Microscopie à fluorescence intravitale à grand champ de la microcirculation pulmonaire dans une lésion pulmonaire aiguë expérimentale à l’aide d’un système d’imagerie stabilisé sous vide
Summary
La microscopie à fluorescence intravitale peut être utilisée pour étudier les interactions leucocytaires-endothéliales et la perfusion capillaire en temps réel. Ce protocole décrit des méthodes pour imager et quantifier ces paramètres dans la microcirculation pulmonaire à l’aide d’un système d’imagerie pulmonaire stabilisé sous vide.
Abstract
L’imagerie intravitale des interactions leucocytaires-endothéliales offre des informations précieuses sur les maladies à médiation immunitaire chez les animaux vivants. L’étude des lésions pulmonaires aiguës (AIP)/syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) et d’autres pathologies respiratoires in vivo est difficile en raison de l’accessibilité limitée et des artefacts de mouvement inhérents aux poumons. Néanmoins, diverses approches ont été développées pour surmonter ces défis. Ce protocole décrit une méthode de microscopie à fluorescence intravitale pour étudier en temps réel les interactions leucocytaires-endothéliales dans la microcirculation pulmonaire dans un modèle expérimental d’ALI. Un système d’imagerie pulmonaire in vivo et une plate-forme de microscopie intravitale imprimée en 3D sont utilisés pour sécuriser la souris anesthésiée et stabiliser le poumon tout en minimisant les lésions pulmonaires confondantes. Après la préparation, la microscopie à fluorescence à grand champ est utilisée pour étudier l’adhésion des leucocytes, le roulement des leucocytes et la fonction capillaire. Bien que le protocole présenté ici se concentre sur l’imagerie dans un modèle aigu de maladie pulmonaire inflammatoire, il peut également être adapté pour étudier d’autres processus pathologiques et physiologiques dans le poumon.
Introduction
La microscopie intravitale (MIV) est un outil d’imagerie utile pour visualiser et étudier divers processus biophysiques in vivo. Le poumon est très difficile à imager in vivo en raison de son emplacement fermé, de la nature fragile de ses tissus et des artefacts de mouvement induits par la respiration et le rythme cardiaque 1,2. Diverses configurations de microscopie intravitale (MIV) ont été développées pour l’imagerie en temps réel des interactions leucocytaires-endothéliales dans la microcirculation pulmonaire afin de surmonter ces défis. De telles approches sont basées sur l’exposition chirurgicale et la stabilisation du poumon pour l’imagerie.
Les animaux sont généralement préparés pour la MIV pulmonaire par des interventions chirurgicales. Tout d’abord, les animaux sont intubés et ventilés, ce qui permet l’excision chirurgicale d’une fenêtre thoracique et des interventions ultérieures pour stabiliser le poumon pour l’imagerie. Une technique consiste à coller le parenchyme sur un couvercle de verre3, une procédure qui risque de causer un traumatisme physique important au tissu imagé. Plus avancée est l’utilisation d’un système de vide pour stabiliser le poumon sous une fenêtre en verre4. Cette configuration facilite l’adhérence lâche de la surface du poumon au couvercle via un vide réversible réparti sur une grande zone locale et dilate le poumon tout en limitant le mouvement dans les dimensions x, y et z4. Le vide est appliqué uniformément à travers un canal entourant la zone d’imagerie de la configuration et tire le tissu dans une région conique peu profonde faisant face au couvercle4 de qualité d’imagerie. Grâce à cette fenêtre de visualisation, la microcirculation pulmonaire peut être étudiée à l’aide de diverses modalités d’imagerie optique.
La MIV pulmonaire permet l’imagerie quantitative d’une multitude de paramètres microcirculatoires. Il s’agit notamment de mesures telles que la vitesse et la longueur de la piste des leucocytes5, la vitessed’écoulement des globules rouges 6 et l’oxygénation7, les métastases tumorales8, la distinction des sous-populations de cellules immunitaires 9,10,11, la visualisation des microparticules12, la dynamique alvéolaire 13,14, la perméabilité vasculaire15 et la fonction capillaire16 . L’accent est mis ici sur le recrutement des leucocytes et la fonction capillaire. L’initiation du recrutement des leucocytes dans la microcirculation pulmonaire implique des interactions de roulement transitoires et des interactions adhésives fermes entre les leucocytes et les cellules endothéliales, qui sont toutes deux augmentées dans des conditions inflammatoires16,17. Typiquement, le laminage est quantifié par le nombre de leucocytes qui passent une ligne de référence définie par l’opérateur, tandis que l’adhérence est quantifiée par le nombre de leucocytes immobiles sur l’endothélium16. La fonction capillaire peut également être affectée dans les états inflammatoires, entraînant souvent une diminution de la perfusion. Cela peut être attribué à plusieurs facteurs, notamment une réduction de la déformabilité des globules rouges18 et l’expression panachée de la NO synthase inductible par les cellules endothéliales entraînant une dérivation pathologique19. En règle générale, la longueur agrégée des capillaires perfusés par zone est mesurée et rapportée en densité capillaire fonctionnelle (FCD).
L’étude du recrutement des leucocytes dans les poumons en temps réel nécessite de marquer des cibles biologiques avec des colorants fluorescents ou des anticorps marqués par fluorescence20. Alternativement, diverses souches de souris transgéniques telles que les souris lysozyme M-green fluorescent protein (LysM-GFP) peuvent être utilisées pour imager des sous-ensembles de cellules immunitaires spécifiques tels que les neutrophiles21,22. Les leucocytes marqués par fluorescence peuvent ensuite être visualisés à l’aide de la microscopie à fluorescence à grand champ, de la microscopie confocale ou de la microscopie multiphotonique. Ces techniques permettent d’obtenir un contraste en utilisant des longueurs d’onde d’excitation spécifiques et en détectant la fluorescence émise tout en bloquant simultanément la détection de la longueur d’onde d’excitation, mettant ainsi en évidence l’objet étiqueté.
Les recherches existantes concernant la quantification du roulement des leucocytes, de l’adhérence et de la densité capillaire fonctionnelle dans le poumon murin reposent principalement sur l’analyse vidéo manuelle. Ceci est rendu possible grâce à des logiciels open source tels que Fiji 6,23, des logiciels propriétaires tels que CapImage12 ou des systèmes de traitement d’image sur mesure24. Inversement, diverses plates-formes logicielles propriétaires (par exemple, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) permettent la mesure automatisée d’un large éventail d’autres paramètres physiologiques, y compris beaucoup de ceux mentionnés précédemment ici 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Des observations importantes ont été faites concernant la pathologie des lésions pulmonaires aiguës (AIP) et du syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) à l’aide de la MIV pulmonaire. Le SDRA est caractérisé par une foule de processus physiopathologiques dans les poumons, y compris l’œdème pulmonaire et les dommages alvéolaires causés par un dysfonctionnement de l’endothélium et de la barrière épithéliale25. En utilisant un modèle murin, il a été constaté que la SA induite par la septicémie est associée à des changements préjudiciables importants dans le trafic de cellules immunitaires dans l’environnement pulmonaire26. Les neutrophiles recrutés dans les capillaires de souris atteintes d’ALI induite par la septicémie ont empêché la microcirculation, augmentant ainsi l’hypoxie dans l’ALI26. En outre, la MIV a été utilisée pour mieux comprendre le mécanisme sous-jacent de réparation après l’apparition du SDRA27. La MIV pulmonaire a également été un outil précieux pour comprendre les changements physiopathologiques dans diverses maladies pulmonaires obstructives. Par exemple, la visualisation du transport du mucus dans des maladies telles que la fibrose kystique (FK) et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) a facilité l’étude de traitements nouveaux et existants pour la clairance muqueuse28. Le trafic de leucocytes dans ces conditions a également été analysé17.
Ce protocole élargit l’approche initialement décrite par Lamm et al.29 pour étudier les interactions leucocytaires-endothéliales en utilisant la microscopie à fluorescence conventionnelle. Les procédures décrites utilisent un système d’imagerie pulmonaire in vivo , qui comprend une base métallique de 16,5 cm x 12,7 cm, un micromanipulateur et une fenêtre d’imagerie sous vide (Figure 1). Le système est monté sur une plate-forme imprimée en 3D de 20 cm x 23,5 cm (fichier supplémentaire 1) afin de fournir une fixation sécurisée pour le tube de ventilateur et le coussin chauffant. Cette méthode offre une imagerie reproductible et quantifiable de la microcirculation pulmonaire murine in vivo. Les aspects importants de la préparation chirurgicale ainsi que l’utilisation correcte d’un système d’imagerie pulmonaire stabilisé sous vide sont expliqués en détail. Enfin, un modèle expérimental d’ALI est utilisé pour fournir une imagerie et une analyse représentatives du roulage altéré des leucocytes, de l’adhésion des leucocytes et de la perfusion capillaire associée à l’inflammation. L’utilisation de ce protocole devrait faciliter d’autres recherches importantes sur les changements physiopathologiques de la microcirculation pulmonaire au cours des états pathologiques aigus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté ici nécessite de la pratique et de l’attention à quelques étapes critiques. Tout d’abord, il est important de préparer la fenêtre d’imagerie avant d’initier l’intubation et la chirurgie. Utilisez une quantité minimale de graisse sous vide pour recouvrir l’anneau extérieur de la fenêtre d’imagerie, appliquez le verre de couverture et testez l’aspiration avec une goutte d’eau distillée. Préparer cela à l’avance empêchera le poumon exposé de se dessécher pendant la c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier la Dre Pina Colarusso, qui a fourni une expertise considérable dans l’édition et la révision de ce manuscrit.
Materials
| 1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 1 mL syringe |
| ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm | RWD Life Science Co. | F12002-12 | Blunt forceps |
| Albumin-Fluorescein Isothiocyanate | Sigma-Aldrich | A9771-1G | FITC-albumin |
| Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v | Canadian Custom Packaging Company | 80002455 | Alcohol wipe |
| AVDC110 Advanced Digital Video Converter | Canopus | 00631069602029 | Digital video converter |
| B/W – CCD – Camera | Horn Imaging | BC-71 | Camera |
| Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Cauterizer |
| C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories International | C57BL/6NCrl | C57BL/6 Mice |
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | Cotton applicator |
| CS-8R 8mm Round Glass Coverslip | Warner Instruments | 64-0701 | Glass coverslip |
| Digital Pressure Gauge | ITM Instruments Inc. | DG2551L0NAM02L0IM&V | Digital Pressure Gauge |
| Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope | Dr. Mom Otoscopes | 1001 | Otoscope |
| Ethyl Alchohol 95% Vol | Commercial Alcohols | P016EA95 | 95% ethanol |
| Fine Scissors – Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | Scissors |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | Fisher Scientific | 1590110 | Labeling tape |
| Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump | Cole-Parmer Canada Company | ZA-07061-40 | Vacuum pump |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13003-10 | Hemostatic forceps |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | DC976VF | Vacuum grease |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Isoflurane |
| LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL | Teligent Canada | 0121AD01 | Lidocaine HCl 1% |
| Lung SurgiBoard | Luxidea, Inc. | IMCH-0001 | Designed for intravital microscopy of the lung |
| Mineral Oil | Teva Canada | 00485802 | Mineral oil |
| Mouse Endotracheal Intubation Kit | Kent Scientific Corporation | ETI-MSE | Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable |
| MST49 Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | 10 450 022 | Fluorescence Microscope |
| N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective | Leica Microsystems | 566035 | 20x objective |
| Non-Woven Sponges 2" x 2" | AMD-Ritmed | A2101-CH | Gauze |
| Optixcare Eye Lube Plus | Aventix | 5914322 | Tear gel |
| Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer | Prusa Research | PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI | 3D printer |
| Oxygen, Compressed | Linde Canada Inc. | Oxygen | |
| PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) | Becton, Dickinson and Company | 305106 | 30 G needle |
| Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL | Cole-Parmer Canada Company | 5340-2L | Vacuum flask |
| Rhodamine 6 G | Sigma-Aldrich | 252433 | Rhodamine 6G |
| Secure Soft Cloth Medical Tape – 3" | Primed | PM5-630709 | Cloth tape |
| Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD | Dow Corning | 602-205 | 1.0 mm I.D. polyethylene tubing |
| Somnosuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01, SS-04-module | Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter |
| Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth | World Precision Instruments | 501216 | Toothed forceps |
| Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) | 3M | 7000002795 | Medical tape |
| Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. | Grainger Canada | USSZUSA-HT3314 | 1.0 cm I.D. polyethylene tubing |
| Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm | Cole-Parmer Canada Company | 6720-5002 | Inline 0.2µm filter |
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