Intravital Widefield Fluorescens Mikroskopi af lungemikrocirkulation ved eksperimentel akut lungeskade ved hjælp af et vakuumstabiliseret billeddannelsessystem
Summary
Intravital fluorescensmikroskopi kan anvendes til at studere leukocyt-endotelinteraktioner og kapillærperfusion i realtid. Denne protokol beskriver metoder til at afbilde og kvantificere disse parametre i lungemikrocirkulationen ved hjælp af et vakuumstabiliseret lungebilleddannelsessystem.
Abstract
Intravital billeddannelse af leukocyt-endotelinteraktioner giver værdifuld indsigt i immunmedieret sygdom hos levende dyr. Undersøgelsen af akut lungeskade (ALI)/akut respiratorisk distress syndrom (ARDS) og andre respiratoriske patologier in vivo er vanskelig på grund af lungernes begrænsede tilgængelighed og iboende bevægelsesartefakter. Ikke desto mindre er der udviklet forskellige tilgange til at overvinde disse udfordringer. Denne protokol beskriver en metode til intravital fluorescensmikroskopi til undersøgelse af realtids leukocyt-endotelinteraktioner i lungemikrocirkulationen i en eksperimentel model af ALI. Et in vivo lungebilleddannelsessystem og 3D-trykt intravital mikroskopiplatform bruges til at sikre den bedøvede mus og stabilisere lungen, samtidig med at forvirrende lungeskade minimeres. Efter fremstilling anvendes widefield fluorescensmikroskopi til at studere leukocytadhæsion, leukocytvalsning og kapillærfunktion. Mens protokollen, der præsenteres her, fokuserer på billeddannelse i en akut model af inflammatorisk lungesygdom, kan den også tilpasses til at studere andre patologiske og fysiologiske processer i lungen.
Introduction
Intravital mikroskopi (IVM) er et nyttigt billeddannelsesværktøj til visualisering og undersøgelse af forskellige biofysiske processer in vivo. Lungen er meget udfordrende at afbilde in vivo på grund af dens lukkede placering, den skrøbelige karakter af dets væv og bevægelsesartefakter induceret af åndedræt og hjerteslag 1,2. Forskellige intravital mikroskopi (IVM) opsætninger er blevet udviklet til real-time billeddannelse af leukocyt-endotel interaktioner i lungemikrocirkulation for at overvinde disse udfordringer. Sådanne tilgange er baseret på kirurgisk eksponering og stabilisering af lungen til billeddannelse.
Dyr er typisk forberedt til lunge IVM ved kirurgiske procedurer. For det første intuberes og ventileres dyr, hvilket tillader kirurgisk udskæring af et brystvindue og efterfølgende indgreb for at stabilisere lungen til billeddannelse. En teknik involverer limning af parenchymen på et glasdæksel3, en procedure, der risikerer betydeligt fysisk traume på det afbildede væv. Mere avanceret er brugen af et vakuumsystem til at stabilisere lungen under et glasvindue4. Denne opsætning letter løs vedhæftning af lungeoverfladen til dækslippen via et reversibelt vakuum spredt over et stort lokalt område og udvider lungen, mens den stadig begrænser bevægelsen i x, y og z dimensioner4. Vakuumet påføres jævnt gennem en kanal, der omgiver opsætningens billeddannelsesområde og trækker vævet ind i et lavt konisk område, der vender mod billeddannelsesdæksler4. Gennem dette visningsvindue kan lungemikrocirkulationen studeres ved hjælp af forskellige optiske billeddannelsesmetoder.
Lung IVM muliggør kvantitativ billeddannelse af en lang række mikrocirkulatoriske parametre. Disse omfatter målinger såsom leukocytsporhastighed og længde5, røde blodlegemers strømningshastighed6 og iltning7, tumormetastaser8, sondringen mellem immuncelleunderpopulationer 9,10,11, visualisering af mikropartikler12, alveolær dynamik13,14, vaskulær permeabilitet15 og kapillærfunktion16 . Fokus her er på leukocytrekruttering og kapillærfunktion. Initiering af leukocytrekruttering i lungemikrocirkulationen involverer forbigående rullende interaktioner og faste klæbende interaktioner mellem leukocytter og endotelceller, som begge øges under inflammatoriske tilstande16,17. Typisk kvantificeres rullning af antallet af leukocytter, der passerer en operatordefineret referencelinje, mens adhæsion kvantificeres af antallet af leukocytter, der er immobile på endotelet16. Kapillærfunktionen kan også påvirkes i inflammatoriske tilstande, hvilket ofte resulterer i nedsat perfusion. Dette kan tilskrives flere faktorer, herunder en reduktion af deformerbarheden af røde blodlegemer18 og varieret ekspression af inducerbar NO-syntase af endotelceller, hvilket resulterer i patologisk rangering19. Typisk måles og rapporteres den samlede længde af perfunderede kapillærer pr. område som funktionel kapillærtæthed (FCD).
Undersøgelse af leukocytrekruttering i lungerne i realtid kræver mærkning af biologiske mål med fluorescerende farvestoffer eller fluorescerende mærkede antistoffer20. Alternativt kan forskellige transgene musestammer såsom lysozym M-grønt fluorescerende protein (LysM-GFP) mus bruges til at afbilde specifikke immuncelleundergrupper såsom neutrofiler21,22. De fluorescerende mærkede leukocytter kan derefter visualiseres ved hjælp af widefield fluorescensmikroskopi, konfokal mikroskopi eller multiphotonmikroskopi. Disse teknikker opnår kontrast ved at anvende specifikke excitationsbølgelængder og detektere udsendt fluorescens, samtidig med at de blokerer detektionen af excitationsbølgelængden og dermed fremhæver det mærkede objekt.
Eksisterende forskning vedrørende kvantificering af leukocytvalsning, adhæsion og funktionel kapillærtæthed i murin lungen har primært været afhængig af manuel videoanalyse. Dette er muliggjort gennem open source-software som Fiji 6,23, proprietær software som CapImage12 eller specialfremstillede billedbehandlingssystemer24. Omvendt muliggør forskellige proprietære softwareplatforme (f.eks. NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) automatiseret måling af en lang række andre fysiologiske parametre, herunder mange af dem, der tidligere er nævnt her 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Der er gjort vigtige observationer vedrørende patologien for akut lungeskade (ALI) og akut respiratorisk nødsyndrom (ARDS) ved hjælp af lunge IVM. ARDS er kendetegnet ved en lang række patofysiologiske processer i lungen, herunder lungeødem og alveolær skade forårsaget af dysfunktion af endotel- og epitelbarrieren25. Ved hjælp af en murinmodel har det vist sig, at sepsis-induceret ALI er forbundet med betydelige skadelige ændringer i immuncellehandel i lungemiljøet26. Neutrofiler rekrutteret til kapillærerne hos mus med sepsisinduceret ALI viste sig at hæmme mikrocirkulationen og derved øge hypoxi i ALI26. Derudover er IVM blevet brugt til at få indsigt i den underliggende reparationsmekanisme efter begyndelsen af ARDS27. Lung IVM har også været et værdifuldt redskab til at forstå patofysiologiske ændringer i forskellige obstruktiv lungesygdomme. For eksempel har visualisering af slimtransport i sygdomme som cystisk fibrose (CF) og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) lettet undersøgelsen af nye og eksisterende behandlinger for slimclearance28. Leukocythandel under disse forhold er også blevet analyseret17.
Denne protokol udvider den tilgang, der oprindeligt blev beskrevet af Lamm et al.29 for at studere leukocyt-endotelinteraktioner ved anvendelse af konventionel fluorescensmikroskopi. De beskrevne procedurer anvender et in vivo lungebilleddannelsessystem, som omfatter et 16,5 cm x 12,7 cm metalbase, mikromanipulator og vakuumbilleddannelsesvindue (figur 1). Systemet er monteret i en 20 cm x 23,5 cm 3D trykt platform (Supplemental File 1) for at give sikker fastgørelse til ventilatorrør og varmepude. Denne metode tilbyder reproducerbar og kvantificerbar billeddannelse af murin lungemikrocirkulation in vivo. Vigtige aspekter af det kirurgiske præparat samt korrekt udnyttelse af et vakuumstabiliseret lungebilleddannelsessystem forklares detaljeret. Endelig anvendes en eksperimentel model af ALI til at tilvejebringe repræsentativ billeddannelse og analyse af ændret leukocytvalsning, leukocytadhæsion og kapillærperfusion forbundet med inflammation. Anvendelsen af denne protokol bør lette yderligere vigtige undersøgelser af patofysiologiske ændringer i lungemikrocirkulationen under akutte sygdomstilstande.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen, der præsenteres her, kræver øvelse og opmærksomhed på et par kritiske trin. For det første er det vigtigt at forberede billeddannelsesvinduet, inden intubation og kirurgi påbegyndes. Brug en minimal mængde vakuumfedt til at belægge den ydre ring i billedvinduet, påfør dækglasset og testsugningen med en dråbe destilleret vand. Forberedelse af dette på forhånd forhindrer den udsatte lunge i at tørre ud under opsætningen ellers. Selvom det er muligt at skylle med varmt saltvand, kan det risiker…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Dr. Pina Colarusso, som har ydet betydelig ekspertise i redigering og revision af dette manuskript.
Materials
| 1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 1 mL syringe |
| ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm | RWD Life Science Co. | F12002-12 | Blunt forceps |
| Albumin-Fluorescein Isothiocyanate | Sigma-Aldrich | A9771-1G | FITC-albumin |
| Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v | Canadian Custom Packaging Company | 80002455 | Alcohol wipe |
| AVDC110 Advanced Digital Video Converter | Canopus | 00631069602029 | Digital video converter |
| B/W – CCD – Camera | Horn Imaging | BC-71 | Camera |
| Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Cauterizer |
| C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories International | C57BL/6NCrl | C57BL/6 Mice |
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | Cotton applicator |
| CS-8R 8mm Round Glass Coverslip | Warner Instruments | 64-0701 | Glass coverslip |
| Digital Pressure Gauge | ITM Instruments Inc. | DG2551L0NAM02L0IM&V | Digital Pressure Gauge |
| Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope | Dr. Mom Otoscopes | 1001 | Otoscope |
| Ethyl Alchohol 95% Vol | Commercial Alcohols | P016EA95 | 95% ethanol |
| Fine Scissors – Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | Scissors |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | Fisher Scientific | 1590110 | Labeling tape |
| Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump | Cole-Parmer Canada Company | ZA-07061-40 | Vacuum pump |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13003-10 | Hemostatic forceps |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | DC976VF | Vacuum grease |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Isoflurane |
| LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL | Teligent Canada | 0121AD01 | Lidocaine HCl 1% |
| Lung SurgiBoard | Luxidea, Inc. | IMCH-0001 | Designed for intravital microscopy of the lung |
| Mineral Oil | Teva Canada | 00485802 | Mineral oil |
| Mouse Endotracheal Intubation Kit | Kent Scientific Corporation | ETI-MSE | Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable |
| MST49 Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | 10 450 022 | Fluorescence Microscope |
| N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective | Leica Microsystems | 566035 | 20x objective |
| Non-Woven Sponges 2" x 2" | AMD-Ritmed | A2101-CH | Gauze |
| Optixcare Eye Lube Plus | Aventix | 5914322 | Tear gel |
| Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer | Prusa Research | PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI | 3D printer |
| Oxygen, Compressed | Linde Canada Inc. | Oxygen | |
| PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) | Becton, Dickinson and Company | 305106 | 30 G needle |
| Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL | Cole-Parmer Canada Company | 5340-2L | Vacuum flask |
| Rhodamine 6 G | Sigma-Aldrich | 252433 | Rhodamine 6G |
| Secure Soft Cloth Medical Tape – 3" | Primed | PM5-630709 | Cloth tape |
| Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD | Dow Corning | 602-205 | 1.0 mm I.D. polyethylene tubing |
| Somnosuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01, SS-04-module | Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter |
| Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth | World Precision Instruments | 501216 | Toothed forceps |
| Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) | 3M | 7000002795 | Medical tape |
| Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. | Grainger Canada | USSZUSA-HT3314 | 1.0 cm I.D. polyethylene tubing |
| Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm | Cole-Parmer Canada Company | 6720-5002 | Inline 0.2µm filter |
Riferimenti
- Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471 (2021).
- Gaertner, M., et al. Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009 (2015).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Looney, M., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).
- Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice. IntraVital. 3 (2), 29748 (2014).
- Blueschke, G., et al. Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630 (2014).
- Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation. Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).
- Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
- Tschernig, T., et al. Direct visualisation of microparticles in the living lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).
- Mertens, M., et al. Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse. Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).
- Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy. Frontiers in Physiology. 11, 291 (2020).
- Margraf, A., et al. 6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice. Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).
- Roller, J., et al. Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice. Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).
- Marques, P., et al. Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease. Frontiers in Immunology. 8, 1766 (2017).
- Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).
- Trzeciak, S., et al. Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival. Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).
- Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Orthgiess, J., et al. Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research. European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).
- Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).
- Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Amato, M. B. P., et al. Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).
- Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).
