Intravital widefield fluorescensmikroskopi av lungemikrosirkulasjon i eksperimentell akutt lungeskade ved hjelp av et vakuumstabilisert bildebehandlingssystem
Summary
Intravital fluorescensmikroskopi kan brukes til å studere leukocytt-endotelinteraksjoner og kapillær perfusjon i sanntid. Denne protokollen beskriver metoder for å avbilde og kvantifisere disse parametrene i lungemikrosirkulasjonen ved hjelp av et vakuumstabilisert lungeavbildningssystem.
Abstract
Intravital avbildning av leukocytt-endotelinteraksjoner gir verdifull innsikt i immunmediert sykdom hos levende dyr. Studien av akutt lungeskade (ALI)/akutt respiratorisk nødsyndrom (ARDS) og andre respiratoriske patologier in vivo er vanskelig på grunn av lungenes begrensede tilgjengelighet og iboende bevegelsesartefakter. Likevel er det utviklet ulike tilnærminger for å overvinne disse utfordringene. Denne protokollen beskriver en metode for intravital fluorescensmikroskopi for å studere sanntids leukocytt-endotelinteraksjoner i lungemikrosirkulasjonen i en eksperimentell modell av ALI. Et in vivo lungeavbildningssystem og 3D-trykt intravital mikroskopiplattform brukes til å sikre den bedøvede musen og stabilisere lungen samtidig som den forvirrende lungeskaden minimeres. Etter tilberedning brukes widefield fluorescensmikroskopi til å studere leukocyttadhesjon, leukocyttrulling og kapillærfunksjon. Mens protokollen som presenteres her fokuserer på avbildning i en akutt modell av inflammatorisk lungesykdom, kan den også tilpasses for å studere andre patologiske og fysiologiske prosesser i lungen.
Introduction
Intravital mikroskopi (IVM) er et nyttig bildeverktøy for visualisering og studier av ulike biofysiske prosesser in vivo. Lungen er svært utfordrende å avbilde in vivo på grunn av sin lukkede plassering, vevets skjøre natur og bevegelsesartefakter indusert av åndedrett og hjerterytme 1,2. Ulike intravitale mikroskopi (IVM) oppsett er utviklet for sanntidsavbildning av leukocytt-endotelinteraksjoner i lungemikrosirkulasjon for å overvinne disse utfordringene. Slike tilnærminger er basert på kirurgisk eksponering og stabilisering av lungen for avbildning.
Dyr er vanligvis forberedt på lunge IVM ved kirurgiske prosedyrer. For det første blir dyr intubert og ventilert, noe som tillater kirurgisk eksisjon av et thoraxvindu og etterfølgende intervensjoner for å stabilisere lungen for avbildning. En teknikk innebærer å lime parenchyma på en glassdekslerlip3, en prosedyre som risikerer betydelige fysiske traumer for det avbildede vevet. Mer avansert er bruken av et vakuumsystem for å stabilisere lungen under et glassvindu4. Dette oppsettet letter løs overholdelse av lungeoverflaten til dekslene via et reversibel vakuum spredt over et stort lokalområde og utvider lungen samtidig som bevegelsen i x-, y- og z-dimensjonene4 begrenses. Vakuumet påføres jevnt gjennom en kanal rundt bildeområdet til oppsettet og trekker vevet inn i et grunt konisk område vendt mot bildekvalitetsdekslene4. Gjennom dette visningsvinduet kan lungemikrosirkulasjonen studeres ved hjelp av ulike optiske bildemodaliteter.
Lunge IVM muliggjør kvantitativ avbildning av en rekke mikrosirkulasjonsparametere. Disse inkluderer målinger som leukocyttsporhastighet og lengde5, rød blodcellestrømningshastighet6 og oksygenering7, tumormetastaser8, skillet mellom immuncelledelpopulasjoner 9,10,11, visualisering av mikropartikler12, alveolardynamikk13,14, vaskulær permeabilitet15 og kapillærfunksjon16 . Fokuset her er på leukocyttrekruttering og kapillærfunksjon. Initiering av leukocyttrekruttering i lungemikrosirkulasjonen innebærer forbigående rullende interaksjoner og faste liminteraksjoner mellom leukocytter og endotelceller, som begge økes under inflammatoriske forhold 16,17. Rullende kvantifiseres vanligvis av antall leukocytter som passerer en operatørdefinert referanselinje, mens vedheft kvantifiseres av antall leukocytter som er immobile påendotelet 16. Kapillærfunksjon kan også påvirkes i inflammatoriske tilstander, noe som ofte resulterer i redusert perfusjon. Dette kan tilskrives flere faktorer, inkludert en reduksjon av røde blodlegemers deformabilitet18 og variert uttrykk for inducible NO-syntase ved endotelceller som resulterer i patologisk shunting19. Vanligvis måles og rapporteres den samlede lengden på perfused kapillærer per område som funksjonell kapillærtetthet (FCD).
Å studere leukocyttrekruttering i lungene i sanntid krever merking av biologiske mål med fluorescerende fargestoffer eller fluorescerende merkede antistoffer20. Alternativt kan ulike transgene musestammer som lysozyme M-grønn fluorescerende protein (LysM-GFP) mus brukes til å bildespesifikke immuncelleundergrupper som nøytrofiler21,22. De fluorescerende merkede leukocyttene kan deretter visualiseres ved hjelp av widefield fluorescensmikroskopi, konfettisk mikroskopi eller multifotonmikroskopi. Disse teknikkene oppnår kontrast ved å bruke spesifikke eksitasjonsbølgelengder og oppdage avgitt fluorescens samtidig som de blokkerer påvisning av eksitasjonsbølgelengden, og dermed fremhever det merkede objektet.
Eksisterende forskning om kvantifisering av leukocyttrulling, vedheft og funksjonell kapillærtetthet i murin lungen har hovedsakelig stolt på manuell videoanalyse. Dette er mulig gjennom programvare med åpen kildekode, for eksempel Fiji 6,23, proprietær programvare som CapImage12 eller skreddersydde bildebehandlingssystemer24. På den annen side muliggjør ulike proprietære programvareplattformer (f.eks. NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) automatisert måling av et bredt spekter av andre fysiologiske parametere, inkludert mange av de som tidligere er nevnt her 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Det er gjort viktige observasjoner vedrørende patologien til akutt lungeskade (ALI) og akutt respiratorisk nødsyndrom (ARDS) ved bruk av lunge IVM. ARDS er preget av en rekke patofysiologiske prosesser i lungen, inkludert lungeødem og alveolarskader forårsaket av dysfunksjon av endotelet og epitelbarrieren25. Ved hjelp av en murinmodell har det blitt funnet at sepsisindusert ALI er forbundet med betydelige skadelige endringer i immuncellehandel i lungemiljøet26. Nøytrofiler rekruttert til kapillærene til mus med sepsisindusert ALI ble funnet å hindre mikrosirkulasjon, og dermed øke hypoksi i ALI26. I tillegg har IVM blitt brukt til å få innsikt i den underliggende reparasjonsmekanismen etter utbruddet av ARDS27. Lunge IVM har også vært et verdifullt verktøy for å forstå patofysiologiske endringer i ulike obstruktive lungesykdommer. For eksempel har visualisering av slimtransport i sykdommer som cystisk fibrose (CF) og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) lagt til rette for studiet av nye og eksisterende behandlinger for slimete clearance28. Leukocytthandel under disse forholdene har også blitt analysert i tilleggtil 17.
Denne protokollen utvider tilnærmingen som opprinnelig ble beskrevet av Lamm et al.29 for å studere leukocytt-endotelinteraksjoner ved hjelp av konvensjonell fluorescensmikroskopi. De beskrevne prosedyrene benytter et in vivo lungeavbildningssystem, som inkluderer et metallbase på 16,5 cm x 12,7 cm, mikromanipulator og vakuumavbildningsvindu (figur 1). Systemet er montert i en 20 cm x 23,5 cm 3D-trykt plattform (tilleggsfil 1) for å gi sikkert feste til ventilatorslangen og varmeputen. Denne metoden gir reproduserbar og kvantifiserbar avbildning av murin lungemikrosirkulasjon in vivo. Viktige aspekter ved det kirurgiske preparatet samt riktig utnyttelse av et vakuumstabilisert lungeavbildningssystem forklares i detalj. Til slutt brukes en eksperimentell modell av ALI til å gi representativ avbildning og analyse av endret leukocyttrulling, leukocyttadhesjon og kapillær perfusjon forbundet med betennelse. Bruken av denne protokollen bør legge til rette for ytterligere viktige undersøkelser av patofysiologiske endringer i lungemikrosirkulasjonen under akutte sykdomstilstander.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen som presenteres her krever øvelse og oppmerksomhet på noen få kritiske trinn. For det første er det viktig å forberede bildevinduet før initiering av intubasjon og kirurgi. Bruk en minimal mengde vakuumfett til å belegge den ytre ringen i bildevinduet, påfør dekkglasset og testsuging med en dråpe destillert vann. Å forberede dette på forhånd vil forhindre at den eksponerte lungen tørker ut under oppsettet ellers. Selv om det er mulig å skylle med varm saltvann, kan dette risikere å skade det s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil takke Dr. Pina Colarusso, som ga betydelig kompetanse innen redigering og revidering av dette manuskriptet.
Materials
| 1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 1 mL syringe |
| ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm | RWD Life Science Co. | F12002-12 | Blunt forceps |
| Albumin-Fluorescein Isothiocyanate | Sigma-Aldrich | A9771-1G | FITC-albumin |
| Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v | Canadian Custom Packaging Company | 80002455 | Alcohol wipe |
| AVDC110 Advanced Digital Video Converter | Canopus | 00631069602029 | Digital video converter |
| B/W – CCD – Camera | Horn Imaging | BC-71 | Camera |
| Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Cauterizer |
| C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories International | C57BL/6NCrl | C57BL/6 Mice |
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | Cotton applicator |
| CS-8R 8mm Round Glass Coverslip | Warner Instruments | 64-0701 | Glass coverslip |
| Digital Pressure Gauge | ITM Instruments Inc. | DG2551L0NAM02L0IM&V | Digital Pressure Gauge |
| Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope | Dr. Mom Otoscopes | 1001 | Otoscope |
| Ethyl Alchohol 95% Vol | Commercial Alcohols | P016EA95 | 95% ethanol |
| Fine Scissors – Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | Scissors |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | Fisher Scientific | 1590110 | Labeling tape |
| Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump | Cole-Parmer Canada Company | ZA-07061-40 | Vacuum pump |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13003-10 | Hemostatic forceps |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | DC976VF | Vacuum grease |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Isoflurane |
| LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL | Teligent Canada | 0121AD01 | Lidocaine HCl 1% |
| Lung SurgiBoard | Luxidea, Inc. | IMCH-0001 | Designed for intravital microscopy of the lung |
| Mineral Oil | Teva Canada | 00485802 | Mineral oil |
| Mouse Endotracheal Intubation Kit | Kent Scientific Corporation | ETI-MSE | Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable |
| MST49 Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | 10 450 022 | Fluorescence Microscope |
| N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective | Leica Microsystems | 566035 | 20x objective |
| Non-Woven Sponges 2" x 2" | AMD-Ritmed | A2101-CH | Gauze |
| Optixcare Eye Lube Plus | Aventix | 5914322 | Tear gel |
| Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer | Prusa Research | PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI | 3D printer |
| Oxygen, Compressed | Linde Canada Inc. | Oxygen | |
| PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) | Becton, Dickinson and Company | 305106 | 30 G needle |
| Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL | Cole-Parmer Canada Company | 5340-2L | Vacuum flask |
| Rhodamine 6 G | Sigma-Aldrich | 252433 | Rhodamine 6G |
| Secure Soft Cloth Medical Tape – 3" | Primed | PM5-630709 | Cloth tape |
| Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD | Dow Corning | 602-205 | 1.0 mm I.D. polyethylene tubing |
| Somnosuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01, SS-04-module | Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter |
| Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth | World Precision Instruments | 501216 | Toothed forceps |
| Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) | 3M | 7000002795 | Medical tape |
| Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. | Grainger Canada | USSZUSA-HT3314 | 1.0 cm I.D. polyethylene tubing |
| Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm | Cole-Parmer Canada Company | 6720-5002 | Inline 0.2µm filter |
Riferimenti
- Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471 (2021).
- Gaertner, M., et al. Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009 (2015).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Looney, M., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).
- Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice. IntraVital. 3 (2), 29748 (2014).
- Blueschke, G., et al. Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630 (2014).
- Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation. Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).
- Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
- Tschernig, T., et al. Direct visualisation of microparticles in the living lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).
- Mertens, M., et al. Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse. Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).
- Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy. Frontiers in Physiology. 11, 291 (2020).
- Margraf, A., et al. 6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice. Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).
- Roller, J., et al. Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice. Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).
- Marques, P., et al. Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease. Frontiers in Immunology. 8, 1766 (2017).
- Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).
- Trzeciak, S., et al. Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival. Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).
- Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Orthgiess, J., et al. Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research. European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).
- Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).
- Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Amato, M. B. P., et al. Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).
- Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).
