La microscopia a fluorescenza intravitale può essere utilizzata per studiare le interazioni leucocita-endoteliali e la perfusione capillare in tempo reale. Questo protocollo descrive i metodi per visualizzare e quantificare questi parametri nel microcircolo polmonare utilizzando un sistema di imaging polmonare stabilizzato nel vuoto.
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Articolo metodologico
Microscopia a fluorescenza intravitale a campo largo della microcircolazione polmonare polmonare polmonare acuta sperimentale utilizzando un sistema di imaging stabilizzato sotto vuoto
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'imaging intravitale delle interazioni leucocita-endoteliali offre preziose informazioni sulla malattia immuno-mediata negli animali vivi. Lo studio della lesione polmonare acuta (ALI) / sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) e di altre patologie respiratorie in vivo è difficile a causa della limitata accessibilità e degli artefatti di movimento intrinseci dei polmoni. Tuttavia, sono stati sviluppati vari approcci per superare queste sfide. Questo protocollo descrive un metodo per la microscopia a fluorescenza intravitale per studiare in tempo reale le interazioni leucocita-endoteliale nella microcircolazione polmonare in un modello sperimentale di ALI. Un sistema di imaging polmonare in vivo e una piattaforma di microscopia intravitale stampata in 3D vengono utilizzati per proteggere il topo anestetizzato e stabilizzare il polmone riducendo al minimo le lesioni polmonari confondenti. Dopo la preparazione, la microscopia a fluorescenza a campo largo viene utilizzata per studiare l'adesione dei leucociti, il rotolamento dei leucociti e la funzione capillare. Mentre il protocollo qui presentato si concentra sull'imaging in un modello acuto di malattia polmonare infiammatoria, può anche essere adattato per studiare altri processi patologici e fisiologici nel polmone.
Introduzione
La microscopia intravitale (IVM) è un utile strumento di imaging per visualizzare e studiare vari processi biofisici in vivo. Il polmone è molto difficile da fotografare in vivo a causa della sua posizione chiusa, della natura fragile del suo tessuto e degli artefatti di movimento indotti dalla respirazione e dal battito cardiaco 1,2. Sono state sviluppate varie configurazioni di microscopia intravitale (IVM) per l'imaging in tempo reale delle interazioni leucocita-endoteliali nella microcircolazione polmonare per superare queste sfide. Tali approcci si basano sull'esposizione chirurgica e su....
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Protocollo
Tutte le procedure qui descritte sono state eseguite previa approvazione da parte del Comitato per gli animali da laboratorio dell'Università di Dalhousie (UCLA).
1. Preparazione
- Sistema di imaging polmonare: per preparare la finestra, somministrare un sottile strato di grasso sottovuoto nella parte superiore dell'anello esterno evitando la contaminazione del canale del vuoto. Posizionare un coperchio di vetro pulito da 8 mm sulla finestra e premere delicatamente verso il basso per creare una guarnizione.
- Microscopio a fluorescenza a campo largo: consente di eseguire l'imaging con un microscopio a fluore....
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Risultati
Per illustrare i risultati ottenibili attraverso questo protocollo, la lesione polmonare acuta (ALI) è stata indotta 6 ore prima dell'imaging utilizzando un modello di instillazione batterica intranasale di lipopolisaccaride (LPS). In breve, i topi (n = 3) sono stati anestetizzati con isoflurano e piccole goccioline di LPS da Pseudomonas aeruginosa in soluzione salina sterile (10 mg / mL) sono state pipettate nel naris sinistro alla dose di 5 mg / kg. Questo è stato confrontato con topi naïve (n = 3; nessuna som.......
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Discussione
Il protocollo qui presentato richiede pratica e attenzione ad alcuni passaggi critici. In primo luogo, è importante preparare la finestra di imaging prima di iniziare l'intubazione e la chirurgia. Utilizzare una quantità minima di grasso sottovuoto per rivestire l'anello esterno della finestra di imaging, applicare il vetro di copertura e testare l'aspirazione con una goccia di acqua distillata. Prepararlo in anticipo impedirà al polmone esposto di asciugarsi durante l'installazione, altrimenti. Mentre è possibile lavare.......
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Dichiarazioni
La dott.ssa Kamala D. Patel è presidente e co-fondatrice di Luxidea, l'impresa da cui è stata acquistata la finestra di imaging utilizzata in questo esperimento.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare la dott.ssa Pina Colarusso, che ha fornito una significativa esperienza nella redazione e revisione di questo manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringa BD Luer Slip Tip da 1 mL sterile, monouso | Becton, Dickinson and Company | 309659 | Siringa da 1 mL |
| Pinza per medicazione ADSON, larghezza punta 0,6 mm, lunghezza denti 11,5 mm, 12 cm | RWD Life Science Co. | F12002-12 | Pinze smussate |
| Albumina-fluoresceina Isotiocianato | Sigma-Aldrich | A9771-1G | FITC-albumina |
| Tampone alcolico Alcool isopropilico 70% v / v | Canadian Custom Packaging Company | 80002455 | Salvietta imbevuta di alcol |
| AVDC110 Convertitore video digitale avanzato | Canopus | 00631069602029 | Convertitore video digitale |
| B / N - CCD - Imaging | tromba della fotocamera | BC-71 | Camera |
| Bovie Deluxe Kit di cauterizzazione ad alta temperatura | Strumenti di scienza fine | 18010-00 | Cauterizzatore |
| C57BL / 6 Topi | Charles River Laboratories International | C57BL / 6NCrl | C57BL / 6 Topi |
| Applicatori con punta in cotone | Puritan | 806-WC | Applicatore |
| CS-8R 8mm Vetrino coprioggetto rotondo | Warner Instruments | 64-0701 | Vetrino coprioggetti in vetro |
| Manometro digitale | ITM Instruments Inc. | DG2551L0NAM02L0IM& V | Manometro digitale |
| Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscopio | Dr. Mom Otoscopi | 1001 | Otoscopio |
| Etilalcolico 95% Vol | Alcoli commerciali | P016EA95 | 95% etanolo |
| Forbici fini - Acciaio inossidabile martensitico | Fine Science Tools | 14094-11 | Forbici |
| Fisherbrand Nastro per etichettatura colorato | Fisher Scientific | 1590110 | Nastro adesivo |
| Gast DOA-P704-AA Pompa per vuoto ad alta capacità | Cole-Parmer Canada Company | ZA-07061-40 | Pompa per vuoto |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13003-10 | Pinze emostatiche |
| Grasso per vuoto Dow | Corning | DC976VF | Grasso per vuoto |
| Isoflurano USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Isoflurano |
| LIDOcaina HCl Iniezione 1% 50 mg/5 mL | Teligent Canada | 0121AD01 | Lidocaina HCl 1% |
| Lung SurgiBoard | Luxidea, Inc. | IMCH-0001 | Progettato per la microscopia intravitale del polmone |
| Olio minerale | Teva Canada | 00485802 | Olio minerale |
| Kit per intubazione endotracheale di topo | Kent Scientific Corporation | ETI-MSE | Supporto per intubazione, maschera per anestesia, cannula endotracheale da 20 G, cavo in fibra ottica |
| Microscopio a fluorescenza MST49 | Microsystems | 10 450 022 | Microscopio a fluorescenza |
| N Plan L 20x/0.40 Obiettivo per microscopio a lunga distanza di lavoro | Leica Microsystems | 566035 | 20x Obiettivo |
| Spugne non tessute 2" x 2" | AMD-Ritmed | A2101-CH | Garza |
| Optixcare Eye Lube Plus | Aventix | 5914322 | Gel lacrimale |
| Original Prusa i3 MK3S+ Stampante 3D | Prusa Research | PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI Stampante | 3D |
| Ossigeno, Compresso | Linde Canada Inc. | ||
| Ago Precision Glide per ossigeno 30 G x 1/2 (0,3 mm x 13 mm) | Becton, Dickinson and Company | 305106 | Ago da 30 G |
| Pyrex 5340-2L 5340 Palloni filtranti, 2000 mL | Cole-Parmer Canada Company | 5340-2L | Pallone sottovuoto |
| Rhodamine 6 G | Sigma-Aldrich 252433 | Rhodamine 6G | |
| Secure Soft Cloth Medical Tape - 3" | Primed | PM5-630709 | Nastro in tessuto |
| Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 pollici. OD | Dow Corning | 602-205 | Tubo in polietilene con diametro interno di 1,0 mm |
| Sistema di anestesia a basso flusso Somnosuite | Kent Scientific Corporation | SS-01, modulo SS-04 | Piccolo ventilatore per roditori, Sistema di anestesia a basso flusso, Termoforo, Sonda di temperatura rettale, Pulsossimetro |
| Pinze per tessuti, lunghe 12,5 cm, curve, 1 x 2 denti | World Precision Instruments | 501216 | Pinze |
| dentateNastro medico transporo, 1527-1, 1 in x 10 yd (2,5 cm x 9,1 m) | 3M | 7000002795 | Tubo nastro medico |
| , trasparente, 3/8 in diametro interno. | Grainger Canada | USSZUSA-HT3314 | Tubo in polietilene con diametro interno da 1,0 cm |
| Whatman 6720-5002 Filtri in linea da 50 mm, PTFE, 0,2 e micro; m | Cole-Parmer Canada Company | 6720-5002 | in linea 0.2µ Filtro M |
Riferimenti
- Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471(2021).
- Gaertner, M., et al.
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Ristampe e permessi
