Прижизненная широкополевая флуоресцентная микроскопия микроциркуляции легких при экспериментальном остром повреждении легких с использованием вакуум-стабилизированной системы визуализации
Summary
Прижизненная флуоресцентная микроскопия может быть использована для изучения лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий и капиллярной перфузии в режиме реального времени. Этот протокол описывает методы изображения и количественной оценки этих параметров в легочной микроциркуляции с использованием вакуум-стабилизированной системы визуализации легких.
Abstract
Прижизненная визуализация взаимодействий лейкоцитов и эндотелия дает ценную информацию об иммуноопосредованных заболеваниях у живых животных. Изучение острого повреждения легких (АЛИ)/острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) и других респираторных патологий in vivo затруднено из-за ограниченной доступности и присущих легким артефактов движения. Тем не менее для преодоления этих проблем были разработаны различные подходы. Данный протокол описывает метод прижизненной флуоресцентной микроскопии для изучения в реальном времени лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий в легочной микроциркуляции в экспериментальной модели ALI. Система визуализации легких in vivo и 3D-печатная платформа прижизненной микроскопии используются для защиты анестезированной мыши и стабилизации легкого, сводя к минимуму запутанное повреждение легких. После подготовки широкоугольная флуоресцентная микроскопия используется для изучения адгезии лейкоцитов, катания лейкоцитов и функции капилляров. Хотя протокол, представленный здесь, фокусируется на визуализации в острой модели воспалительного заболевания легких, он также может быть адаптирован для изучения других патологических и физиологических процессов в легких.
Introduction
Прижизненная микроскопия (IVM) является полезным инструментом визуализации для визуализации и изучения различных биофизических процессов in vivo. Легкое очень сложно изобразить in vivo из-за его закрытого расположения, хрупкой природы его ткани и артефактов движения, вызванных дыханием и сердцебиением 1,2. Различные установки прижизненной микроскопии (IVM) были разработаны для визуализации в режиме реального времени взаимодействий лейкоцитов и эндотелия в микроциркуляции легких для преодоления этих проблем. Такие подходы основаны на хирургическом обнажении и стабилизации легких для визуализации.
Животные обычно готовятся к IVM легких хирургическими процедурами. Во-первых, животных интубируют и вентилируют, что позволяет хирургическое иссечение грудного окна и последующие вмешательства для стабилизации легкого для визуализации. Один из методов включает в себя приклеивание паренхимы на стеклянную крышку3, процедуру, которая рискует значительной физической травмой изображенной ткани. Более продвинутым является использование вакуумной системы для стабилизации легких под стеклянным окном4. Эта установка облегчает свободное прилипание поверхности легкого к покровному листу через обратимый вакуум, распределенный по большой локальной области, и расширяет легкое, в то же время ограничивая движение в размерах x, y и z4. Вакуум применяется равномерно через канал, окружающий область визуализации установки, и втягивает ткань в неглубокую коническую область, обращенную к крышке4 класса визуализации. Через это смотровое окно микроциркуляция легких может быть изучена с использованием различных оптических методов визуализации.
IVM легких позволяет проводить количественную визуализацию множества микроциркуляторных параметров. К ним относятся такие измерения, как скорость и длина трека лейкоцитов5, скорость кровотока эритроцитов6 и оксигенация7, метастазы опухоли8, различие субпопуляций иммунных клеток 9,10,11, визуализация микрочастиц12, альвеолярная динамика13,14, проницаемость сосудов15 и капиллярная функция16 . Основное внимание здесь уделяется рекрутированию лейкоцитов и функции капилляров. Начало рекрутирования лейкоцитов в легочной микроциркуляции включает в себя преходящие скользящие взаимодействия и твердые адгезивные взаимодействия между лейкоцитами и эндотелиальными клетками, оба из которых увеличиваются в воспалительных состояниях16,17. Как правило, прокатка количественно определяется количеством лейкоцитов, которые проходят определенную оператором контрольную линию, в то время как адгезия количественно определяется количеством лейкоцитов, которые неподвижны на эндотелии16. Капиллярная функция также может быть затронута в воспалительных состояниях, что часто приводит к снижению перфузии. Это можно объяснить несколькими факторами, включая снижение деформируемости эритроцитов18 и пеструю экспрессию индуцируемой NO-синтазы эндотелиальными клетками, что приводит к патологическому шунтированию19. Как правило, совокупная длина перфузированных капилляров на площадь измеряется и сообщается как функциональная плотность капилляров (FCD).
Изучение рекрутирования лейкоцитов в легких в режиме реального времени требует маркировки биологических мишеней флуоресцентными красителями или флуоресцентно-мечеными антителами20. Альтернативно, различные трансгенные мышиные штаммы, такие как лизоцим M-зеленого флуоресцентного белка (LysM-GFP) мышей, могут быть использованы для изображения специфических подмножеств иммунных клеток, таких как нейтрофилы21,22. Флуоресцентно меченые лейкоциты затем могут быть визуализированы с использованием широкоугольной флуоресцентной микроскопии, конфокальной микроскопии или многофотонной микроскопии. Эти методы достигают контраста, используя определенные длины волн возбуждения и обнаруживая излучаемую флуоресценцию, одновременно блокируя обнаружение длины волны возбуждения, тем самым выделяя меченый объект.
Существующие исследования, касающиеся количественной оценки катания лейкоцитов, адгезии и функциональной плотности капилляров в легких мышей, опирались в основном на ручной видеоанализ. Это стало возможным благодаря программному обеспечению с открытым исходным кодом, такому как Fiji 6,23, проприетарному программному обеспечению, такому как CapImage12, или индивидуальным системам обработки изображений24. И наоборот, различные проприетарные программные платформы (например, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) позволяют автоматически измерять широкий спектр других физиологических параметров, включая многие из ранее упомянутых здесь 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Важные наблюдения были сделаны относительно патологии острого повреждения легких (АЛИ) и острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) с использованием ЛВМ легких. ОРДС характеризуется множеством патофизиологических процессов в легких, включая отек легких и повреждение альвеоляров, вызванное дисфункцией эндотелия и эпителиального барьера25. Используя мышиную модель, было обнаружено, что АЛИ, индуцированный сепсисом, связан со значительными пагубными изменениями в торговле иммунными клетками в легочной среде26. Было обнаружено, что нейтрофилы, набранные в капилляры мышей с ALI, вызванным сепсисом, препятствуют микроциркуляции, тем самым увеличивая гипоксию в ALI26. Кроме того, IVM был использован для получения информации о базовом механизме восстановления после начала ARDS27. IVM легких также был ценным инструментом в понимании патофизиологических изменений при различных обструктивных заболеваниях легких. Например, визуализация транспорта слизи при таких заболеваниях, как муковисцидоз (МВ) и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), облегчила изучение новых и существующих методов лечения клиренса слизи28. Также проанализирован оборот лейкоцитов в этих условиях17.
Этот протокол расширяет подход, первоначально описанный Lamm et al.29 для изучения лейкоцитарно-эндотелиальных взаимодействий с использованием обычной флуоресцентной микроскопии. В описанных процедурах используется система визуализации легких in vivo , которая включает в себя металлическую основу размером 16,5 см х 12,7 см, микроманипулятор и вакуумное окно визуализации (рисунок 1). Система смонтирована в 3D-печатной платформе размером 20 см х 23,5 см (дополнительный файл 1) для обеспечения надежного крепления для трубки вентилятора и грелки. Этот метод предлагает воспроизводимую и поддающуюся количественной оценке визуализацию микроциркуляции легких мышей in vivo. Подробно объясняются важные аспекты хирургической подготовки, а также правильное использование вакуумно-стабилизированной системы визуализации легких. Наконец, экспериментальная модель ALI используется для обеспечения репрезентативной визуализации и анализа измененного катания лейкоцитов, адгезии лейкоцитов и капиллярной перфузии, связанной с воспалением. Использование этого протокола должно способствовать дальнейшим важным исследованиям патофизиологических изменений в микроциркуляции легких во время острых болезненных состояний.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный здесь протокол требует практики и внимания к нескольким критическим шагам. Во-первых, важно подготовить окно визуализации до начала интубации и операции. Используйте минимальное количество вакуумной смазки для покрытия наружного кольца окна визуализации, нанесите пок…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Пину Коларуссо, которая предоставила значительный опыт в редактировании и редактировании этой рукописи.
Materials
| 1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 1 mL syringe |
| ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm | RWD Life Science Co. | F12002-12 | Blunt forceps |
| Albumin-Fluorescein Isothiocyanate | Sigma-Aldrich | A9771-1G | FITC-albumin |
| Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v | Canadian Custom Packaging Company | 80002455 | Alcohol wipe |
| AVDC110 Advanced Digital Video Converter | Canopus | 00631069602029 | Digital video converter |
| B/W – CCD – Camera | Horn Imaging | BC-71 | Camera |
| Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Cauterizer |
| C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories International | C57BL/6NCrl | C57BL/6 Mice |
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | Cotton applicator |
| CS-8R 8mm Round Glass Coverslip | Warner Instruments | 64-0701 | Glass coverslip |
| Digital Pressure Gauge | ITM Instruments Inc. | DG2551L0NAM02L0IM&V | Digital Pressure Gauge |
| Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope | Dr. Mom Otoscopes | 1001 | Otoscope |
| Ethyl Alchohol 95% Vol | Commercial Alcohols | P016EA95 | 95% ethanol |
| Fine Scissors – Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | Scissors |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | Fisher Scientific | 1590110 | Labeling tape |
| Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump | Cole-Parmer Canada Company | ZA-07061-40 | Vacuum pump |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13003-10 | Hemostatic forceps |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | DC976VF | Vacuum grease |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Isoflurane |
| LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL | Teligent Canada | 0121AD01 | Lidocaine HCl 1% |
| Lung SurgiBoard | Luxidea, Inc. | IMCH-0001 | Designed for intravital microscopy of the lung |
| Mineral Oil | Teva Canada | 00485802 | Mineral oil |
| Mouse Endotracheal Intubation Kit | Kent Scientific Corporation | ETI-MSE | Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable |
| MST49 Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | 10 450 022 | Fluorescence Microscope |
| N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective | Leica Microsystems | 566035 | 20x objective |
| Non-Woven Sponges 2" x 2" | AMD-Ritmed | A2101-CH | Gauze |
| Optixcare Eye Lube Plus | Aventix | 5914322 | Tear gel |
| Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer | Prusa Research | PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI | 3D printer |
| Oxygen, Compressed | Linde Canada Inc. | Oxygen | |
| PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) | Becton, Dickinson and Company | 305106 | 30 G needle |
| Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL | Cole-Parmer Canada Company | 5340-2L | Vacuum flask |
| Rhodamine 6 G | Sigma-Aldrich | 252433 | Rhodamine 6G |
| Secure Soft Cloth Medical Tape – 3" | Primed | PM5-630709 | Cloth tape |
| Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD | Dow Corning | 602-205 | 1.0 mm I.D. polyethylene tubing |
| Somnosuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01, SS-04-module | Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter |
| Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth | World Precision Instruments | 501216 | Toothed forceps |
| Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) | 3M | 7000002795 | Medical tape |
| Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. | Grainger Canada | USSZUSA-HT3314 | 1.0 cm I.D. polyethylene tubing |
| Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm | Cole-Parmer Canada Company | 6720-5002 | Inline 0.2µm filter |
Riferimenti
- Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471 (2021).
- Gaertner, M., et al. Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009 (2015).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Looney, M., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).
- Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice. IntraVital. 3 (2), 29748 (2014).
- Blueschke, G., et al. Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630 (2014).
- Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation. Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).
- Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
- Tschernig, T., et al. Direct visualisation of microparticles in the living lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).
- Mertens, M., et al. Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse. Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).
- Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy. Frontiers in Physiology. 11, 291 (2020).
- Margraf, A., et al. 6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice. Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).
- Roller, J., et al. Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice. Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).
- Marques, P., et al. Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease. Frontiers in Immunology. 8, 1766 (2017).
- Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).
- Trzeciak, S., et al. Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival. Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).
- Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Orthgiess, J., et al. Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research. European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).
- Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).
- Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Amato, M. B. P., et al. Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).
- Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).
