Intravital widefield fluorescensmikroskopi av lungmikrocirkulation vid experimentell akut lungskada med hjälp av ett vakuumstabiliserat bildsystem
Summary
Intravital fluorescensmikroskopi kan användas för att studera leukocyt-endotelinteraktioner och kapillärperfusion i realtid. Detta protokoll beskriver metoder för att avbilda och kvantifiera dessa parametrar i lungmikrocirkulationen med hjälp av ett vakuumstabiliserat lungavbildningssystem.
Abstract
Intravital avbildning av leukocyt-endotelinteraktioner ger värdefulla insikter om immunmedierad sjukdom hos levande djur. Studien av akut lungskada (ALI)/akut respiratoriskt nödsyndrom (ARDS) och andra andningspatologier in vivo är svår på grund av den begränsade tillgängligheten och inneboende rörelseartefakterna i lungorna. Icke desto mindre har olika tillvägagångssätt utvecklats för att övervinna dessa utmaningar. Detta protokoll beskriver en metod för intravital fluorescensmikroskopi för att studera realtid leukocyt-endotelinteraktioner i lungmikrocirkulationen i en experimentell modell av ALI. Ett in vivo lungavbildningssystem och 3D-tryckt intravital mikroskopiplattform används för att säkra den sövda musen och stabilisera lungan samtidigt som den minimerar förvirrande lungskador. Efter beredning används widefield fluorescensmikroskopi för att studera leukocytadhesion, leukocytvalsning och kapillärfunktion. Medan protokollet som presenteras här fokuserar på avbildning i en akut modell av inflammatorisk lungsjukdom, kan det också anpassas för att studera andra patologiska och fysiologiska processer i lungan.
Introduction
Intravital mikroskopi (IVM) är ett användbart bildverktyg för att visualisera och studera olika biofysiska processer in vivo. Lungan är mycket utmanande att avbilda in vivo på grund av dess slutna plats, vävnadens ömtåliga natur och rörelseartefakter inducerade av andning och hjärtslag 1,2. Olika intravitala mikroskopi (IVM) -inställningar har utvecklats för realtidsavbildning av leukocyt-endotelinteraktioner i lungmikrocirkulation för att övervinna dessa utmaningar. Sådana tillvägagångssätt är baserade på kirurgisk exponering och stabilisering av lungan för avbildning.
Djur förbereds vanligtvis för lung-IVM genom kirurgiska ingrepp. Först intuberas och ventileras djur, vilket möjliggör kirurgisk excision av ett bröstfönster och efterföljande ingrepp för att stabilisera lungan för avbildning. En teknik innebär att parenkymen limmas på ett glasöverdrag3, ett förfarande som riskerar betydande fysiskt trauma på den avbildade vävnaden. Mer avancerat är användningen av ett vakuumsystem för att stabilisera lungan under ett glasfönster4. Denna inställning underlättar lös vidhäftning av lungytan till täckglaset via ett reversibelt vakuum som sprids över ett stort lokalt område och expanderar lungan samtidigt som rörelsen i x-, y- och z-dimensionerna4 begränsas. Vakuumet appliceras jämnt genom en kanal som omger avbildningsområdet för installationen och drar vävnaden in i ett grunt koniskt område som vetter mot bildkvalitetsöverdrag4. Genom detta visningsfönster kan lungmikrocirkulationen studeras med hjälp av olika optiska avbildningsmetoder.
Lung IVM möjliggör kvantitativ avbildning av en mängd mikrocirkulationsparametrar. Dessa inkluderar mätningar såsom leukocytspårhastighet och längd5, flödeshastighetför röda blodkroppar 6 och syresättning7, tumörmetastaser8, skillnaden mellan immuncellsunderpopulationer 9,10,11, visualisering av mikropartiklar12, alveolär dynamik13,14, vaskulär permeabilitet15 och kapillärfunktion16 . Fokus här ligger på leukocytrekrytering och kapillärfunktion. Initiering av leukocytrekrytering i lungmikrocirkulationen involverar övergående rullande interaktioner och fasta liminteraktioner mellan leukocyter och endotelceller, som båda ökar under inflammatoriska tillstånd16,17. Typiskt kvantifieras rullning med antalet leukocyter som passerar en operatörsdefinierad referenslinje, medan vidhäftning kvantifieras av antalet leukocyter som är immobila på endotelet16. Kapillärfunktionen kan också påverkas i inflammatoriska tillstånd, vilket ofta resulterar i minskad perfusion. Detta kan hänföras till flera faktorer, inklusive en minskning av deformerbarheten av röda blodkroppar18 och varierat uttryck av inducerbart NO-syntas av endotelceller vilket resulterar i patologisk shunting19. Vanligtvis mäts och rapporteras den sammanlagda längden av perfuserade kapillärer per område som funktionell kapillärdensitet (FCD).
Att studera leukocytrekrytering i lungorna i realtid kräver märkning av biologiska mål med fluorescerande färgämnen eller fluorescerande märkta antikroppar20. Alternativt kan olika transgena musstammar såsom lysozym M-gröna fluorescerande protein (LysM-GFP) möss användas för att avbilda specifika immuncellsundergrupper såsom neutrofiler21,22. De fluorescerande märkta leukocyterna kan sedan visualiseras med hjälp av widefield fluorescensmikroskopi, konfokalmikroskopi eller multifotonmikroskopi. Dessa tekniker uppnår kontrast genom att använda specifika excitationsvåglängder och detektera utsänd fluorescens samtidigt som de blockerar detekteringen av excitationsvåglängden och därmed markerar det märkta objektet.
Befintlig forskning om kvantifiering av leukocytvalsning, vidhäftning och funktionell kapillärdensitet i den murina lungan har främst förlitat sig på manuell videoanalys. Detta möjliggörs genom programvara med öppen källkod som Fiji 6,23, proprietär programvara som CapImage12 eller skräddarsydda bildbehandlingssystem24. Omvänt möjliggör olika proprietära mjukvaruplattformar (t.ex. NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) automatiserad mätning av ett brett spektrum av andra fysiologiska parametrar, inklusive många av de som tidigare nämnts här 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Viktiga observationer har gjorts avseende patologin för akut lungskada (ALI) och akut respiratoriskt nödsyndrom (ARDS) med hjälp av lung-IVM. ARDS kännetecknas av en mängd patofysiologiska processer i lungan, inklusive lungödem och alveolära skador orsakade av dysfunktion i endotelet och epitelbarriären25. Med hjälp av en murinmodell har det visat sig att sepsisinducerad ALI är associerad med signifikanta skadliga förändringar i immuncellshandel i lungmiljön26. Neutrofiler som rekryterades till kapillärerna hos möss med sepsisinducerad ALI visade sig hindra mikrocirkulationen och därmed öka hypoxi i ALI26. Dessutom har IVM använts för att få insikter i den underliggande reparationsmekanismen efter starten av ARDS27. Lung-IVM har också varit ett värdefullt verktyg för att förstå patofysiologiska förändringar vid olika obstruktiva lungsjukdomar. Till exempel har visualisering av slemtransport vid sjukdomar som cystisk fibros (CF) och kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) underlättat studien av nya och befintliga behandlingar för slemhinnor28. Leukocythandel under dessa förhållanden har också analyserats17.
Detta protokoll utökar det tillvägagångssätt som ursprungligen beskrevs av Lamm et al.29 för att studera leukocyt-endotelinteraktioner med användning av konventionell fluorescensmikroskopi. De beskrivna procedurerna använder ett in vivo lungavbildningssystem, som inkluderar ett 16,5 cm x 12,7 cm metallbas-, mikromanipulator- och vakuumavbildningsfönster (figur 1). Systemet är monterat i en 20 cm x 23,5 cm 3D-tryckt plattform (tilläggsfil 1) för att ge säker fastsättning för ventilatorslangen och värmedynan. Denna metod erbjuder reproducerbar och kvantifierbar avbildning av murin lungmikrocirkulation in vivo. Viktiga aspekter av den kirurgiska beredningen samt korrekt användning av ett vakuumstabiliserat lungavbildningssystem förklaras i detalj. Slutligen används en experimentell modell av ALI för att tillhandahålla representativ avbildning och analys av förändrad leukocytrullning, leukocytadhesion och kapillärperfusion associerad med inflammation. Användningen av detta protokoll bör underlätta ytterligare viktiga undersökningar av patofysiologiska förändringar i lungmikrocirkulationen under akuta sjukdomstillstånd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som presenteras här kräver övning och uppmärksamhet på några kritiska steg. För det första är det viktigt att förbereda bildfönstret innan intubation och operation påbörjas. Använd en minimal mängd vakuumfett för att belägga bildfönstrets yttre ring, applicera täckglaset och provsug med en droppe destillerat vatten. Att förbereda detta i förväg förhindrar att den exponerade lungan torkar ut under installationen annars. Även om det är möjligt att spola med varm saltlösning, kan det r…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr. Pina Colarusso, som tillhandahöll betydande expertis i redigering och revidering av detta manuskript.
Materials
| 1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use | Becton, Dickinson and Company | 309659 | 1 mL syringe |
| ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm | RWD Life Science Co. | F12002-12 | Blunt forceps |
| Albumin-Fluorescein Isothiocyanate | Sigma-Aldrich | A9771-1G | FITC-albumin |
| Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v | Canadian Custom Packaging Company | 80002455 | Alcohol wipe |
| AVDC110 Advanced Digital Video Converter | Canopus | 00631069602029 | Digital video converter |
| B/W – CCD – Camera | Horn Imaging | BC-71 | Camera |
| Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Cauterizer |
| C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories International | C57BL/6NCrl | C57BL/6 Mice |
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | Cotton applicator |
| CS-8R 8mm Round Glass Coverslip | Warner Instruments | 64-0701 | Glass coverslip |
| Digital Pressure Gauge | ITM Instruments Inc. | DG2551L0NAM02L0IM&V | Digital Pressure Gauge |
| Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope | Dr. Mom Otoscopes | 1001 | Otoscope |
| Ethyl Alchohol 95% Vol | Commercial Alcohols | P016EA95 | 95% ethanol |
| Fine Scissors – Martensitic Stainless Steel | Fine Science Tools | 14094-11 | Scissors |
| Fisherbrand Colored Labeling Tape | Fisher Scientific | 1590110 | Labeling tape |
| Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump | Cole-Parmer Canada Company | ZA-07061-40 | Vacuum pump |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13003-10 | Hemostatic forceps |
| High Vacuum Grease | Dow Corning | DC976VF | Vacuum grease |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Isoflurane |
| LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL | Teligent Canada | 0121AD01 | Lidocaine HCl 1% |
| Lung SurgiBoard | Luxidea, Inc. | IMCH-0001 | Designed for intravital microscopy of the lung |
| Mineral Oil | Teva Canada | 00485802 | Mineral oil |
| Mouse Endotracheal Intubation Kit | Kent Scientific Corporation | ETI-MSE | Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable |
| MST49 Fluorescence Microscope | Leica Microsystems | 10 450 022 | Fluorescence Microscope |
| N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective | Leica Microsystems | 566035 | 20x objective |
| Non-Woven Sponges 2" x 2" | AMD-Ritmed | A2101-CH | Gauze |
| Optixcare Eye Lube Plus | Aventix | 5914322 | Tear gel |
| Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer | Prusa Research | PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI | 3D printer |
| Oxygen, Compressed | Linde Canada Inc. | Oxygen | |
| PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) | Becton, Dickinson and Company | 305106 | 30 G needle |
| Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL | Cole-Parmer Canada Company | 5340-2L | Vacuum flask |
| Rhodamine 6 G | Sigma-Aldrich | 252433 | Rhodamine 6G |
| Secure Soft Cloth Medical Tape – 3" | Primed | PM5-630709 | Cloth tape |
| Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD | Dow Corning | 602-205 | 1.0 mm I.D. polyethylene tubing |
| Somnosuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | SS-01, SS-04-module | Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter |
| Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth | World Precision Instruments | 501216 | Toothed forceps |
| Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) | 3M | 7000002795 | Medical tape |
| Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia. | Grainger Canada | USSZUSA-HT3314 | 1.0 cm I.D. polyethylene tubing |
| Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 µm | Cole-Parmer Canada Company | 6720-5002 | Inline 0.2µm filter |
Riferimenti
- Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471 (2021).
- Gaertner, M., et al. Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009 (2015).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Looney, M., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).
- Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice. IntraVital. 3 (2), 29748 (2014).
- Blueschke, G., et al. Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630 (2014).
- Tabuchi, A., et al. Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).
- Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
- Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation. Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).
- Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
- Tschernig, T., et al. Direct visualisation of microparticles in the living lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).
- Mertens, M., et al. Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse. Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).
- Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy. Frontiers in Physiology. 11, 291 (2020).
- Margraf, A., et al. 6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice. Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).
- Roller, J., et al. Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice. Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).
- Marques, P., et al. Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease. Frontiers in Immunology. 8, 1766 (2017).
- Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).
- Trzeciak, S., et al. Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival. Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).
- Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Orthgiess, J., et al. Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research. European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
- Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. Acute lung injury: A clinical and molecular review. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).
- Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., Hüttmann, G., König, P. Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).
- Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-µm microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Amato, M. B. P., et al. Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).
- Looney, M. R., Bhattacharya, J. Live imaging of the lung. Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).
