确定放射性标记抗体与固定抗原的结合亲和力（KD）

Summary

在这里，描述了一种确定放射性标记抗体与固定化抗原的结合亲和力（K_D）的方法。K_D 是平衡解离常数，可以通过测量放射性标记抗体在不同浓度下与其抗原的总，特异性和非特异性结合来确定饱和结合实验。

Abstract

确定结合亲和力（K_D）是放射性标记抗体（rAb）表征的一个重要方面。通常，结合亲和力由平衡解离常数K_D表示，并且可以计算为抗体的浓度，其中一半抗体结合位点在平衡时被占据。该方法可推广到任何放射性标记的抗体或其它蛋白质和肽支架。与基于细胞的方法相比，固定化抗原的选择对于验证抗体长期储存后的结合亲和力，区分双特异性抗体构建体中片段抗原结合区（Fab）臂的结合亲和力以及确定不同细胞系之间抗原表达是否存在变异性特别有用。该方法涉及将固定量的抗原固定到可破碎的96孔板上的指定孔中。然后，用牛血清白蛋白（BSA）在所有孔中阻断非特异性结合。随后，将rAb以浓度梯度添加到所有孔中。选择一系列浓度以使rAb达到饱和，即所有抗原都由rAb连续结合的抗体浓度。在没有固定抗原的指定孔中，可以确定rAb的非特异性结合。通过从孔中与固定抗原的总结合中减去非特异性结合，可以确定rAb与抗原的特异性结合。根据得到的饱和结合曲线计算rAb的K_D 。例如，使用放射性标记的amivantamab（表皮生长因子受体（EGFR）和细胞质间充质 – 上皮转化（cMET）蛋白的双特异性抗体）测定结合亲和力。

Introduction

放射性标记抗体（rAb）在医学上有多种用途。虽然大多数在肿瘤学中用作成像和治疗剂，但也有用于风湿病相关炎症，心脏病学和神经病学的成像应用¹。影像学 rAbs 对检测病变具有高敏感性，并有可能帮助患者选择治疗^{2，3，4，5}。它们也用于治疗，因为它们对各自的抗原具有特异性。在称为治疗诊断学的策略中，相同的rAb用于成像和治疗⁶。

理想情况下，选择用于放射性标记的抗体是一种已经证明具有使用非放射性标记方法具有高结合亲和力和特异性的抗体。抗体的放射性标记可以通过用放射性核素直接化学修饰抗体来实现，放射性核素形成稳定的共价键（例如放射性碘），或者间接通过与随后与放射性金属配位的螯合剂偶联来实现7^，8。直接放射性标记如用放射性碘特异性修饰抗体上的酪氨酸和组氨酸残基。如果这些残基对抗原结合很重要，那么这种放射性结合会改变结合亲和力。相反，抗体的偶联和间接放射性标记有多种既定的方案。例如，用于结合锆-89 （⁸⁹Zr）用于抗体PET成像的常用螯合剂是p-异硫氰酸苄基-去铁胺（DFO），它与抗体^9，10的赖氨酸残基随机偶联。如果抗原结合区有赖氨酸残基，这些位点的偶联可能会在空间上阻碍抗原结合，从而损害抗体-抗原结合。因此，用于抗体的间接或直接放射性标记的不同放射性偶联方法可以潜在地影响免疫反应性，定义为抗体放射性偶联物与其抗原^7，11结合的能力。位点特异性偶联方法可以规避这一限制，但这些技术需要抗体工程来结合额外的半胱氨酸残基或碳水化合物残基酶促反应的专业知识^{12，13，14，15，16}。一旦抗体被放射性标记，重要的是要测试免疫反应性是否作为rAb表征的一部分保留。测量免疫反应性的一种方法是确定rAb的结合亲和力。

该协议的目的是描述使用已建立的放射性配体饱和度测定来确定rAb的结合亲和力以量化rAb-抗原结合的过程。图 1 概述了绑定趋势。随着更多的rAb加入到固定量的固定化抗原中，抗原结合的量将增加。一旦所有抗原结合位点饱和，将达到平台，并且添加更多的rAbs将对结合抗原的量没有影响。在该模型中，平衡解离常数（K_D）是占据抗原受体¹⁷一半的抗体的浓度。K_D表示抗体与其靶标的结合程度，较低的K_D对应于较高的结合亲和力。以前报道过，理想的rAb应具有1纳摩尔或更小的¹⁸纳摩尔的K_D。然而，最近的rAbs已经用K_D在低纳摩尔范围内开发出来，并且被认为适用于无创成像应用^{19，20，21，22}。在rAb的放射性配体饱和测定中可以确定的另一个参数是B_max，它对应于抗原结合的最大量。如果需要，B_max可用于计算抗原分子的数量。

图1：代表性饱和结合曲线。 将抗原结合的百分比与添加到固定量抗原中的抗体浓度的增加相对。弹出窗口演示了在各个点的绑定。分别显示对应于K_D 和B_max的浓度和结合。这个数字是用 BioRender.com 创建的。 请点击此处查看此图的大图。

该测定对于放射性标记的双特异性抗体构建体特别重要，以确定放射性标记的双特异性抗体与其各自抗原结合的每个片段抗原结合区（Fab）臂的K_D 。该协议可用于在固定抗原上分别测定每个Fab臂的K_D ，以独立表征每个Fab臂对其各自抗原的结合亲和力在放射偶联后是否受到影响。该方案通过使用放射性标记的amivantamab（一种用于表皮生长因子受体（EGFR）和细胞质间充质 – 上皮转化（cMET）蛋白的双特异性抗体¹⁹来证明。放射性标记的单臂抗体，其中一个Fab组与EGFR（α-EGFR）或cMET（α-cMET）结合，另一个Fab组是同种型对照，也被用作示例¹⁹。该方案也适用于任何具有可固定的已知抗原的放射性标记抗体。在该协议中，将一系列rAb的稀释液添加到rAb的每个Fab臂特异性指定孔中的固定化抗原中。rAb也被添加到仅被牛血清白蛋白（BSA）阻断的孔中，没有抗原，以确定非特异性结合。为了确定特异性结合，从总rAb结合中减去与固定抗原的非特异性结合。然后使用得到的饱和结合曲线来确定K_D，如上所述。

与使用细胞系作为抗原来源相比，该方法的一个优点是使用纯化抗原时具有更高的再现性，因为在细胞培养过程中可能会影响抗原表达水平，并且不同的细胞系具有不同水平的抗原表达。在放射性标记的双特异性抗体的情况下，仅表达一种抗原而没有另一种抗原的细胞系可能不可用，这将使表征单个Fab臂的结合亲和力变得非常具有挑战性。值得注意的是，与非放射性标记方法相比，放射性配体饱和度测定方法的关键优势是可以特异性表征rAb的结合亲和力，而无需rAb的未结合部分的贡献。据作者所知，目前尚无纯化技术将rAb与其母体非偶联抗体分离。鉴于螯合剂和放射性核素的尺寸相对较小，它们在尺寸排阻色谱中对rAb总分子量的贡献微不足道。因此，从任何放射性标记技术产生的产物几乎总是rAb及其母体非偶联抗体的混合物。使用放射性标记的饱和度测定法表征结合亲和力可确保被测产品仅是 rAb。

Protocol

注：有关协议的图形表示，请参阅 图 2 。 图 2：协议示意图。 行和柱标签指示为设置可破碎的96孔板的指南。预期结合在抗原和BSA的示例中显示。弯曲的箭头表示预计仅用BSA从孔中冲洗出来的rAb。这个数字是用 BioRender.com ?…

Representative Results

该方法基于饱和结合测定计算rAb的结合亲和力（KD），其中将不同浓度的rAb加入到固定量的固定化抗原中。结合曲线应遵循对数生长，其初始陡峭，然后随着抗原饱和而趋于平稳。为了确保确定的KD是准确的，rAb的浓度必须足够高才能达到饱和。对于该测定，放射性标记的抗体与DFO偶联并用89Zr进行放射性标记，如前所述19。图3显示?…

Discussion

作为rAb开发的一部分，重要的是要确保rAb特异性地结合到其具有高结合亲和力的靶标。确定结合亲和力可以告知rAb的免疫反应性是否受到使用固定抗原的放射性配体饱和度测定的放射性结合的影响。确定 rAb 与 BSA 的结合可用于量化非特异性结合，以更准确地测量与固定抗原的特异性结合。该方法测试不同浓度的rAb的结合，以产生饱和结合曲线，以计算K_D 并确定结合亲和力。

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Materials

Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9647
Gamma Counter	Hidex	Hidex Automatic Gamma Counter
GraphPad Prism Software	GraphPad		version 9.2; used for statistical analyses in this study
Immuno Breakable MaxiSorp 96-well plates	Thermo Scientific	473768
Microplate Sealing Tape	Corning	4612
Microsoft Excel	Microsoft
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190144
Sodium Bicarbonate	JT Baker	3506-01
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich	S7795
Tween-20	Sigma-Aldrich	P7949