Bestimmung der Bindungsaffinität (KD) von radioaktiv markierten Antikörpern gegen immobilisierte Antigene
Summary
Hierbei wird ein Verfahren beschrieben, um die Bindungsaffinität (KD) von radioaktiv markierten Antikörpern an immobilisierte Antigene zu bestimmen. KD ist die Gleichgewichtsdissoziationskonstante, die aus einem Sättigungsbindungsexperiment bestimmt werden kann, indem die gesamte, spezifische und unspezifische Bindung eines radioaktiv markierten Antikörpers in verschiedenen Konzentrationen an sein Antigen gemessen wird.
Abstract
Die Bestimmung der Bindungsaffinität (KD) ist ein wichtiger Aspekt bei der Charakterisierung radioaktiv markierter Antikörper (rAb). Typischerweise wird die Bindungsaffinität durch die Gleichgewichtsdissoziationskonstante KD dargestellt und kann als die Konzentration von Antikörpern berechnet werden, bei der die Hälfte der Antikörperbindungsstellen im Gleichgewicht besetzt ist. Diese Methode kann auf jeden radioaktiv markierten Antikörper oder andere Protein- und Peptidgerüste verallgemeinert werden. Im Gegensatz zu zellbasierten Methoden ist die Wahl immobilisierter Antigene besonders nützlich, um Bindungsaffinitäten nach Langzeitlagerung von Antikörpern zu validieren, Bindungsaffinitäten von Fragment-Antigen-Bindungsregion-Armen (Fab) in bispezifischen Antikörperkonstrukten zu unterscheiden und festzustellen, ob es eine Variabilität in der Antigenexpression zwischen verschiedenen Zelllinien gibt. Bei dieser Methode wird eine feste Menge Antigen in spezifizierte Vertiefungen auf einer zerbrechlichen 96-Well-Platte immobilisiert. Dann wurde die unspezifische Bindung in allen Vertiefungen mit Rinderserumalbumin (BSA) blockiert. Anschließend wurde der rAb in einem Konzentrationsgradienten zu allen Vertiefungen gegeben. Es wurde ein Konzentrationsbereich gewählt, damit der rAb eine Sättigung erreichen kann, d. h. eine Antikörperkonzentration, bei der alle Antigene kontinuierlich an das rAb gebunden sind. In bestimmten Vertiefungen ohne immobilisiertes Antigen kann eine unspezifische Bindung des rAb bestimmt werden. Durch Subtrahieren der unspezifischen Bindung von der Gesamtbindung in den Vertiefungen mit immobilisiertem Antigen kann die spezifische Bindung des rAb an das Antigen bestimmt werden. Das KD des rAb wurde aus der resultierenden Sättigungsbindungskurve berechnet. Als Beispiel wurde die Bindungsaffinität mit radioaktiv markiertem Amivantamab bestimmt, einem bispezifischen Antikörper für epidermale Wachstumsfaktorrezeptoren (EGFR) und zytoplasmatische mesenchymal-epitheliale Übergangsproteine (cMET).
Introduction
Radioaktiv markierte Antikörper (rAb) haben eine Vielzahl von Anwendungen in der Medizin. Während die Mehrheit in der Onkologie als bildgebende und therapeutische Mittel eingesetzt wird, gibt es bildgebende Anwendungen für rheumatologische Entzündungen, Kardiologie und Neurologie1. Imaging rAbs hat eine hohe Empfindlichkeit, Läsionen zu erkennen und hat das Potenzial, bei der Patientenauswahl für die Behandlung zu helfen 2,3,4,5. Sie werden auch wegen ihrer Spezifität für ihre jeweiligen Antigene zur Therapie eingesetzt. In einer Strategie, die als Theranostik bekannt ist, wird derselbe rAb sowohl für die Bildgebung als auch für die Behandlungverwendet 6.
Im Idealfall ist der für die Radiomarkierung gewählte Antikörper einer, der bereits mit nicht radioaktiv markierten Methoden eine hohe Bindungsaffinität und Spezifität aufweist. Die Radiomarkierung von Antikörpern kann durch direkte chemische Modifikation von Antikörpern mit einem Radionuklid, das stabile kovalente Bindungen bildet (z. B. Radiojod), oder indirekt durch Konjugation mit Chelatoren, die sich anschließend mit Radiometallen koordinieren 7,8, erreicht werden. Die direkte Radiomarkierung wie mit Radiojod modifiziert spezifisch Tyrosin- und Histidinreste auf dem Antikörper. Wenn diese Rückstände für die Antigenbindung wichtig sind, dann würde diese Radiokonjugation die Bindungsaffinität verändern. Umgekehrt gibt es mehrere etablierte Protokolle für die Konjugation und indirekte radioaktive Markierung von Antikörpern. Ein gebräuchlicher Chelator, der zur Bindung von Zirkonium-89 (89Zr) für die PET-Bildgebung von Antikörpern verwendet wird, ist beispielsweise das p-Isothiocyanatobenzyl-Desferrioxamin (DFO), das zufällig an Lysinreste des Antikörpers 9,10 konjugiert wird. Wenn Lysinreste in der Antigenbindungsregion vorhanden sind, könnte die Konjugation an diesen Stellen die Antigenbindung sterisch behindern und somit die Antikörper-Antigen-Bindung beeinträchtigen. Daher können die verschiedenen Radiokonjugationsmethoden, die für die indirekte oder direkte Radiomarkierung von Antikörpern verwendet werden, möglicherweise die Immunreaktivität beeinflussen, definiert als die Fähigkeit des Antikörper-Radiokonjugats, an sein Antigen 7,11 zu binden. Ortsspezifische Konjugationsmethoden können diese Einschränkung umgehen, aber diese Techniken erfordern Antikörper-Engineering, um zusätzliche Cysteinreste oder Fachwissen in enzymatischen Reaktionen auf Kohlenhydratrestezu integrieren 12,13,14,15,16. Sobald ein Antikörper radioaktiv markiert ist, ist es wichtig zu testen, ob die Immunreaktivität als Teil der Charakterisierung des rAb erhalten bleibt. Eine Möglichkeit, die Immunreaktivität zu messen, besteht darin, die Bindungsaffinität des rAb zu bestimmen.
Der Zweck dieses Protokolls ist es, ein Verfahren zur Bestimmung der Bindungsaffinität für rAbs unter Verwendung eines etablierten Radioligandensättigungsassays zur Quantifizierung der rAb-Antigenbindung zu beschreiben. Der Bindungstrend ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Menge des gebundenen Antigens nimmt zu, wenn mehr rAb zu einer festen Menge an immobilisiertem Antigen hinzugefügt wird. Sobald alle Antigenbindungsstellen gesättigt sind, wird ein Plateau erreicht, und das Hinzufügen weiterer rAbs hat keinen Einfluss auf die Menge des gebundenen Antigens. In diesem Modell ist die Gleichgewichtsdissoziationskonstante (KD) die Konzentration von Antikörpern, die die Hälfte der Antigenrezeptoren einnimmt17. Der K D stellt dar, wie gut ein Antikörper mit einem niedrigeren KD, der einer höheren Bindungsaffinität entspricht, an sein Ziel bindet. Es wurde bereits berichtet, dass ein idealer rAb ein KD von 1 Nanomolar oder weniger18 haben sollte. Neuere rAbs wurden jedoch mit KD im niedrigen nanomolaren Bereich entwickelt und gelten als geeignet für nichtinvasive Bildgebungsanwendungen 19,20,21,22. Ein weiterer Parameter, der im Radioligandensättigungsassay von rAbs bestimmt werden kann, ist Bmax, was der maximalen Menge an Antigenbindung entspricht. Bmax kann verwendet werden, um die Anzahl der Antigenmoleküle bei Bedarf zu berechnen.
Abbildung 1: Repräsentative Sättigungsbindungskurve. Der Prozentsatz des gebundenen Antigens wird gegen steigende Konzentrationen von Antikörpern aufgetragen, die einer festen Menge an Antigen zugesetzt werden. Pop-Outs demonstrieren an verschiedenen Stellen die Bindung. Die Konzentration und Bindung entsprechend KD bzw. Bmax sind dargestellt. Diese Figur wurde mit BioRender.com erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Dieser Assay ist besonders wichtig für radioaktiv markierte bispezifische Antikörperkonstrukte, um das KD für jeden Fragment Antigen-bindenden Region (Fab) Arm des radioaktiv markierten bispezifischen Antikörpers zu bestimmen, der mit ihren jeweiligen Antigenen bindet. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um das KD jedes Fab-Arms separat auf immobilisierten Antigenen zu bestimmen, um unabhängig zu charakterisieren, ob die Bindungsaffinität jedes Fab-Arms für sein jeweiliges Antigen nach der Radiokonjugation beeinflusst wurde. Dieses Protokoll wird durch die Verwendung von radioaktiv markiertem Amivantamab demonstriert, einem bispezifischen Antikörper für epidermale Wachstumsfaktorrezeptoren (EGFR) und zytoplasmatische mesenchymal-epitheliale Übergangsproteine (cMET)19. Radiomarkierte einarmige Antikörper, bei denen ein Fab-Arm an EGFR (α-EGFR) oder cMET (α-cMET) bindet und der andere Fab-Arm eine Isotypkontrolle ist, wurden ebenfalls als Beispiele19 verwendet. Dieses Protokoll ist auch für jeden radioaktiv markierten Antikörper mit einem bekannten Antigen geeignet, der immobilisiert werden kann. In diesem Protokoll wird eine Verdünnungsreihe des rAb zu einer festen Menge immobilisiertem Antigen in bestimmten Vertiefungen zugegeben, die für jeden Fab-Arm des rAb spezifisch sind. Der rAb wird auch zu Vertiefungen gegeben, die nur mit Rinderserumalbumin (BSA) ohne Antigen blockiert wurden, um die unspezifische Bindung zu bestimmen. Um die spezifische Bindung zu bestimmen, wird die unspezifische Bindung an immobilisiertes Antigen von der gesamten rAb-Bindung subtrahiert. Die resultierende Sättigungsbindungskurve wird dann verwendet, um KD zu bestimmen, wie oben beschrieben.
Ein Vorteil dieser Methode ist die höhere Reproduzierbarkeit bei der Verwendung von gereinigten Antigenen im Vergleich zur Verwendung von Zelllinien als Quelle von Antigenen, da die Antigenexpressionsniveaus während der Zellkultur beeinflusst werden können und dass verschiedene Zelllinien unterschiedliche Antigenexpressionsniveaus aufweisen. Bei radioaktiv markierten bispezifischen Antikörpern sind Zelllinien, die nur eines der Antigene ohne das andere exprimieren, möglicherweise nicht verfügbar, was eine Charakterisierung der Bindungsaffinität der einzelnen Fab-Arme sehr schwierig machen würde. Insbesondere ist der Hauptvorteil der Radioligandensättigungsmethode gegenüber nicht radioaktiv markierten Methoden die spezifische Charakterisierung der Bindungsaffinität des rAb ohne den Beitrag der unkonjugierten Fraktion des rAb. Nach bestem Wissen der Autoren gibt es derzeit keine Reinigungstechniken, um den rAb von seinem übergeordneten unkonjugierten Antikörper zu trennen. Angesichts der relativ geringen Größe des Chelators und des Radionuklids ist ihr Beitrag zum Gesamtmolekulargewicht des rAb in der Größenausschlusschromatographie unbedeutend. Daher ist das Produkt, das bei jeder radioaktiven Markierungstechnik erzeugt wird, fast immer eine Mischung aus dem rAb und seinem unkonjugierten Antikörper aus Eltern. Die Charakterisierung der Bindungsaffinität mit dem radioaktiv markierten Sättigungsassay stellt sicher, dass das zu prüfende Produkt ausschließlich das rAb ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Im Rahmen der Entwicklung von rAbs ist es wichtig sicherzustellen, dass ein rAb mit hoher Bindungsaffinität spezifisch an sein Ziel bindet. Die Bestimmung der Bindungsaffinität kann darüber informieren, ob die Immunreaktivität des rAb durch Radiokonjugation durch den Radioligandensättigungsassay unter Verwendung eines immobilisierten Antigens beeinflusst wird. Die Bestimmung der rAb-Bindung an BSA kann verwendet werden, um die unspezifische Bindung zu quantifizieren, um die spezifische Bindung an das immobilisierte …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken 3D Imaging für die Produktion von [89Zr]Zr-Oxalat und Dr. Sheri Moores von Janssen Pharmaceuticals für die Bereitstellung von Antikörpern.
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Gamma Counter | Hidex | Hidex Automatic Gamma Counter | |
| GraphPad Prism Software | GraphPad | version 9.2; used for statistical analyses in this study | |
| Immuno Breakable MaxiSorp 96-well plates | Thermo Scientific | 473768 | |
| Microplate Sealing Tape | Corning | 4612 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Sodium Bicarbonate | JT Baker | 3506-01 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 |
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