Beredning av mänsklig myokardvävnad för långsiktig odling
Summary
Vi presenterar ett protokoll för ex vivo odling av human ventrikulär myokardiell vävnad. Det möjliggör detaljerad analys av sammandragningskraft och kinetik, samt applicering av för- och efterbelastning för att efterlikna den fysiologiska miljön in vivo närmare.
Abstract
Kardiomyocytodling har sett ett stort antal utvecklingar, allt från tvådimensionell (2D) cellodling till iPSC-härledda organoider. År 2019 demonstrerades ett ex vivo-sätt att odla myokardskivor erhållna från humana hjärtprover, samtidigt som man närmade sig in vivo-tillstånd av myokardiell sammandragning. Dessa prover kommer främst från hjärttransplantationer eller placeringar av vänsterkammarassistansanordningar. Med hjälp av ett vibratom och ett specialutvecklat odlingssystem placeras 300 μm tjocka skivor mellan en fast och en fjädertråd, vilket möjliggör stabil och reproducerbar odling i flera veckor. Under odlingen stimuleras skivorna kontinuerligt enligt individuella inställningar. Sammandragningar kan visas och registreras i realtid, och farmakologiska medel kan lätt appliceras. Användardefinierade stimuleringsprotokoll kan schemaläggas och utföras för att bedöma vitala sammandragningsparametrar som potentiering efter paus, stimuleringströskel, kraftfrekvensrelation och eldfast period. Dessutom möjliggör systemet en variabel för- och efterspänningsinställning för en mer fysiologisk odling.
Här presenterar vi en steg-för-steg-guide om hur man genererar en framgångsrik långsiktig odling av mänskliga vänstra ventrikulära myokardskivor med hjälp av en kommersiell biomimetisk odlingslösning.
Introduction
Under det senaste decenniet har in vitro-odling av myokardceller gjort stora framsteg, allt från 2D- och tredimensionella (3D) tekniker till användning av organoider och inducerade pluripotenta stamceller differentierade till hjärtmyocyter 1,2,3. Ex vivo– och primärcellsodlingar har visat sig vara av stort värde, särskilt för genetiska studier och läkemedelsutveckling 4,5,6. Att använda mänskliga vävnader förbättrar resultatens translationella värde. Långsiktig 3D-odling av myokardvävnader med intakt geometri är dock inte väletablerad. Den intakta geometrin är en nyckelfunktion för att efterlikna in vivo-förhållanden, eftersom korrekt hjärtfunktion, kommunikation mellan olika celler samt cell-matrisinteraktioner är förutsättningar. Odling av myokardvävnad gick igenom olika utvecklingsfaser. Framgångsgraden och stabiliteten för odling av ex vivo myokardvävnad var initialt ganska låg, men de senaste metoderna har gett lovande resultat 7,8,9,10,11.
var bland dem de första som visade att livskraft och kontraktil prestanda hos mänsklig myokardvävnad kan bibehållas vid ex vivo-cellodling under många veckor7. Deras teknik baserades på tunna vävnadsskivor skurna från explanterat humant myokardium, som monterades i nyutvecklade odlingskammare som gav definierade biomekaniska förhållanden och kontinuerlig elektrisk stimulering. Denna odlingsmetod liknar myokardvävnadens in vivo-funktion och har reproducerats av flera oberoende forskargrupper 2,12,13,14,15. Viktigt är att kamrarna som användes av Fischer m.fl. också möjliggjorde kontinuerlig registrering av utvecklade krafter i upp till 4 månader och därmed öppnade oöverträffade möjligheter för fysiologisk och farmakologisk forskning om intakt humant myokardium7.
Liknande tekniker utvecklades oberoende av andra grupper och tillämpades på humant, råtta, svin och kaninmyokardium 7,10,11. utvecklade därefter en mer fysiologisk metod, som reproducerar det normala kraft-längdförhållandet under en sammandragningscykel, men är mindre lämplig för analys med hög genomströmning16. Som sådan kan det allmänna tillvägagångssättet för biomimetisk odling betraktas som ett ytterligare steg in i minskning, förfining och ersättning (3R) av djurförsök.
Utnyttjandet av denna potential kräver dock standardiserade procedurer, analyser med högt innehåll och en hög genomströmningsnivå. Vi presenterar en teknik som kombinerar automatiserad skivning av levande mänskligt myokardium med in vitro-underhåll i ett biomimetiskt odlingssystem som har blivit kommersiellt tillgängligt (se materialtabell). Med det föreslagna tillvägagångssättet begränsas antalet enskilda skivor som kan genereras från ett enda transmuralt myokardprov endast av bearbetningstiden. Ett prov av tillräcklig storlek och kvalitet (3 cm x 3 cm) ger ofta 20-40 vävnadsskivor som bekvämt skärs med ett automatiserat vibratom. Dessa skivor kan placeras i odlingskamrar som tillhör systemet. Kamrarna möjliggör elektrisk stimulering, vars parametrar kan moduleras (dvs pulsvaraktighet, polaritet, hastighet och ström), samt justering av för- och efterbelastning med hjälp av fjädertrådar inuti kamrarna. Sammandragningen av varje skiva registreras från rörelsen av en liten magnet fäst vid en fjädertråd och visas som en tolkningsbar graf. Data kan spelas in hela tiden och analyseras med hjälp av fritt tillgänglig programvara. Bortsett från den konstanta baslinjepacing kan schemalagda protokoll utföras för att funktionellt bedöma deras eldfasta period, stimuleringströskel, post-paus-potentiering och kraft-frekvensrelation.
Denna långsiktiga biomimetiska odling av flera myokardskivor från ett enskilt hjärta banar väg för framtida ex vivo-forskning i både mänsklig och djurvävnad och underlättar screening för terapeutiska och kardiotoxiska läkemedelseffekter inom kardiovaskulär medicin. Det har redan tillämpats på olika experimentella tillvägagångssätt 2,12,13,15. Här ger vi en detaljerad steg-för-steg-beskrivning av beredningen av mänsklig vävnad och ger lösningar för ofta förekommande odlingsproblem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidigare har kardiovaskulär forskning gjort stora framsteg inom odling av kardiomyocyter. 3D-odlingen av kardiomyocyter med intakt geometri är dock ännu inte väletablerad. Jämfört med tidigare protokoll som tillämpats för ex vivo-odling av myokardvävnad, liknar protokollet som vi beskrev här vävnadens in vivo-miljö närmare. Dessutom möjliggör tillämpningen av för- och efterlast en mer biomimetisk miljö. Vi kan fullt ut analysera och förstå den kontinuerliga registreringen av sammandr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen finansierades av DZHK-bidrag 81Z0600207 (JH, PS och DM) och 81X2600253 (AD och TS).
Författarna vill tacka Claudia Fahney, Mei-Ping Wu och Matthias Semisch för deras stöd i förberedelserna av uppläggen, samt för det regelbundna underhållet av vävnadsodlingen.
Materials
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish bioreactor system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
Riferimenti
- George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices. Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).
- Lu, K., et al. Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium. Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).
- Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS one. 7 (5), 38147 (2012).
- Klumm, M. J., et al. Long-term cultivation of human atrial myocardium. Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).
- Krane, M., et al. Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome. Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).
- Miller, J. M., et al. Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Kang, C., et al. Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Ou, Q., et al. Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).
- Ou, Q., et al. Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices. Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).
- Abu-Khousa, M., et al. The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium. Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).
- Bojkova, D., et al. SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).
- Esfandyari, D. A. -. O., et al. MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Moretti, A., et al. Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy. Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).
- Pitoulis, F. G., et al. Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro. Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).
- Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
- de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).
- Schleifer, K. J. Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).
- Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent. Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
