Подготовка ткани миокарда человека к длительному культивированию
Summary
Представлен протокол культивирования ex vivo желудочковой ткани миокарда человека. Это позволяет проводить детальный анализ силы сжатия и кинетики, а также применять пред- и послегрузку для более точной имитации физиологической среды in vivo .
Abstract
Культивирование кардиомиоцитов видело огромное количество разработок, начиная от двумерного (2D) культивирования клеток до органоидов, полученных из iPSC. В 2019 году был продемонстрирован способ ex vivo культивирования срезов миокарда, полученных из образцов сердца человека, при приближении in vivo к состоянию сокращения миокарда. Эти образцы происходят в основном из трансплантации сердца или размещения вспомогательных устройств левого желудочка. Используя вибратом и специально разработанную систему культивирования, ломтики толщиной 300 мкм помещают между фиксированной и пружинной проволокой, что позволяет стабильно и воспроизводимо культивировать в течение нескольких недель. Во время выращивания ломтики непрерывно стимулируются в соответствии с индивидуальными настройками. Схватки могут отображаться и регистрироваться в режиме реального времени, а фармакологические средства могут быть легко применены. Пользовательские протоколы стимуляции могут быть запланированы и выполнены для оценки жизненно важных параметров сокращения, таких как пост-пауза-потенцирование, порог стимуляции, соотношение силы и частоты и рефрактерный период. Кроме того, система позволяет изменять настройку предварительной и последующей нагрузки для более физиологичного культивирования.
Здесь мы представляем пошаговое руководство о том, как создать успешное долгосрочное культивирование срезов миокарда левого желудочка человека, используя коммерческий раствор для биомиметического культивирования.
Introduction
За последнее десятилетие культивирование клеток миокарда in vitro достигло больших успехов, начиная от 2D и трехмерных (3D) методов до использования органоидов и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, дифференцированных в сердечные миоциты 1,2,3. Культивирование ex vivo и первичных клеток показало большую ценность, особенно для генетических исследований и разработки лекарств 4,5,6. Использование тканей человека улучшает трансляционную ценность результатов. Однако длительное 3D-культивирование тканей миокарда с интактной геометрией не является устоявшимся. Неповрежденная геометрия является ключевой особенностью для имитации условий in vivo, поскольку правильная сердечная функция, связь между различными клетками, а также взаимодействия между клетками и матрицами являются предпосылками. Культивирование тканей миокарда проходило через различные фазы развития. Успешность и стабильность культивирования ткани миокарда ex vivo изначально были довольно низкими, но последние подходы дали многообещающие результаты 7,8,9,10,11.
Среди них Фишер и др. были первыми, кто продемонстрировал, что жизнеспособность и сократительная производительность ткани миокарда человека могут поддерживаться при культивировании клеток ex vivo в течение многих недель7. Их метод был основан на тонких срезах тканей, вырезанных из эксплантированного миокарда человека, которые были установлены в недавно разработанных культивационных камерах, которые обеспечивали определенные биомеханические условия и непрерывную электрическую стимуляцию. Этот метод культивирования очень похож на функцию in vivo ткани миокарда и был воспроизведен несколькими независимыми исследовательскими группами 2,12,13,14,15. Важно отметить, что камеры, используемые Fischer et al., также позволяли непрерывно регистрировать развитые силы в течение 4 месяцев и, таким образом, открывали беспрецедентные возможности для физиологических и фармакологических исследований интактного миокардачеловека 7.
Подобные методики были независимо разработаны другими группами и применены к миокарду человека, крыс, свиней и кроликов 7,10,11. Pitoulis et al. впоследствии разработали более физиологический метод, который воспроизводит нормальное соотношение сила-длина во время цикла сжатия, но менее подходит для высокопроизводительного анализа16. Таким образом, общий подход биомиметического культивирования можно рассматривать как дальнейший шаг к сокращению, уточнению и замене (3R) экспериментов на животных.
Однако использование этого потенциала требует стандартизированных процедур, анализа высокого содержания и высокого уровня пропускной способности. Представлена методика, сочетающая автоматизированную нарезку живого миокарда человека с поддержанием in vitro в биомиметической системе культивирования, которая стала коммерчески доступной (см. Таблицу материалов). При предложенном подходе количество отдельных срезов, которые могут быть получены из одного трансмурального образца миокарда, ограничено только временем обработки. Образец достаточного размера и качества (3 см х 3 см) часто дает 20-40 срезов ткани, которые удобно разрезаются с помощью автоматизированного вибратома. Эти срезы могут быть помещены в камеры культивирования, принадлежащие системе. Камеры позволяют проводить электрическую стимуляцию, параметры которой могут модулироваться (т.е. длительность импульса, полярность, скорость и ток), а также регулировку предварительной и послегрузки с помощью пружинных проводов внутри камер. Сжатие каждого среза регистрируется от движения небольшого магнита, прикрепленного к пружинному проводу, и отображается в виде интерпретируемого графика. Данные могут быть записаны в любое время и проанализированы с помощью свободно доступного программного обеспечения. Помимо постоянного базового темпа, могут быть выполнены запланированные протоколы для функциональной оценки их рефрактерного периода, порога стимуляции, потенцирования после паузы и соотношения силы и частоты.
Это долгосрочное биомиметическое культивирование нескольких срезов миокарда из отдельного сердца прокладывает путь для будущих исследований ex vivo как в тканях человека, так и в тканях животных и облегчает скрининг на терапевтические и кардиотоксические эффекты лекарств в сердечно-сосудистой медицине. Он уже применялся к различным экспериментальным подходам 2,12,13,15. Здесь мы дадим подробное пошаговое описание подготовки тканей человека и предложим решения часто встречающихся проблем культивирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
В прошлом сердечно-сосудистые исследования добились больших успехов в культивировании кардиомиоцитов. Однако 3D-культивирование кардиомиоцитов с интактной геометрией еще не устоялось. По сравнению с предыдущими протоколами, применяемыми для культивирования ex vivo ткани миокарда, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования финансировались грантами DZHK 81Z0600207 (JH, PS и DM) и 81X2600253 (AD и TS).
Авторы хотели бы поблагодарить Клаудию Фани, Мэй-Пин Ву и Маттиаса Семиша за их поддержку в подготовке установок, а также за регулярное поддержание культивирования тканей.
Materials
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish bioreactor system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
Riferimenti
- George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices. Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).
- Lu, K., et al. Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium. Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).
- Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS one. 7 (5), 38147 (2012).
- Klumm, M. J., et al. Long-term cultivation of human atrial myocardium. Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).
- Krane, M., et al. Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome. Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).
- Miller, J. M., et al. Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Kang, C., et al. Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Ou, Q., et al. Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).
- Ou, Q., et al. Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices. Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).
- Abu-Khousa, M., et al. The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium. Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).
- Bojkova, D., et al. SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).
- Esfandyari, D. A. -. O., et al. MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Moretti, A., et al. Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy. Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).
- Pitoulis, F. G., et al. Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro. Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).
- Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
- de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).
- Schleifer, K. J. Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).
- Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent. Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
