장기 재배를 위한 인간 심근 조직의 제조
Summary
우리는 인간 심실 심근 조직의 생체 외 배양을 위한 프로토콜을 제시한다. 수축력 및 동역학에 대한 상세한 분석뿐만 아니라 생체 내 생리 환경을보다 면밀히 모방하기 위해 사전 및 후부하의 적용을 허용합니다.
Abstract
심근세포 배양은 2차원(2D) 세포 배양에서 iPSC 유래 오가노이드에 이르기까지 방대한 수의 발전을 이뤘다. 2019 년에는 심근 수축의 생체 내 상태에 접근하면서 인간 심장 샘플에서 얻은 심근 절편을 배양하는 생체 외 방법이 입증되었습니다. 이 샘플은 주로 심장 이식 또는 좌심실 보조 장치 배치에서 비롯됩니다. 비브라톰과 특별히 개발된 재배 시스템을 사용하여 300μm 두께의 슬라이스를 고정된 와이어와 스프링 와이어 사이에 배치하여 몇 주 동안 안정적이고 재현 가능한 재배가 가능합니다. 재배하는 동안 조각은 개별 설정에 따라 지속적으로 자극됩니다. 수축은 실시간으로 표시되고 기록 될 수 있으며 약리학 적 제제를 쉽게 적용 할 수 있습니다. 사용자-정의된 자극 프로토콜은 일시정지-강화, 자극 임계값, 힘-주파수 관계, 내화 기간과 같은 중요한 수축 파라미터를 평가하기 위해 스케줄링되고 수행될 수 있다. 더욱이, 상기 시스템은 보다 생리학적 재배를 위한 가변 사전-후 하중 설정을 가능하게 한다.
여기에서, 우리는 상업적 생체 모방 재배 용액을 사용하여 인간 좌심실 심근 절편의 성공적인 장기 배양을 생성하는 방법에 대한 단계별 가이드를 제시합니다.
Introduction
지난 10년 동안, 심근 세포의 시험관내 배양은 2D 및 3차원(3D) 기술에서부터 심장 심근세포 1,2,3으로 분화된 오가노이드 및 유도만능 줄기 세포의 사용에 이르기까지 큰 발전을 이루었다. Ex vivo 및 일차 세포 배양은 특히 유전 연구 및 약물 개발 4,5,6에 큰 가치를 지닌다. 인간 조직을 사용하면 결과의 번역 값이 향상됩니다. 그러나 손상되지 않은 기하학을 가진 심근 조직의 장기적인 3D 배양은 잘 확립되어 있지 않습니다. 손상되지 않은 기하학은 적절한 심장 기능, 다른 세포 간의 의사 소통 및 세포 – 매트릭스 상호 작용이 전제 조건이기 때문에 생체 내 조건을 모방하는 핵심 기능입니다. 심근 조직 재배는 다양한 발달 단계를 거쳤습니다. 생체외 심근 조직 배양의 성공률과 안정성은 처음에는 상당히 낮았지만, 최근의 접근법은 유망한 결과 7,8,9,10,11을 산출했다.
그 중에서도, Fischer 등은 인간 심근 조직의 생존력 및 수축성 성능이수년 7주 동안 생체외 세포 배양에서 유지될 수 있다는 것을 최초로 입증하였다. 그들의 기술은 외래 된 인간 심근에서 절단 된 얇은 조직 조각을 기반으로했으며, 이는 정의 된 생체 역학 조건과 지속적인 전기 자극을 제공하는 새로 개발 된 재배 챔버에 장착되었습니다. 이 배양 방법은 심근 조직의 생체 내 기능과 매우 유사하며 여러 독립적 인 연구 그룹2,12,13,14,15에 의해 재현되었습니다. 중요하게도, Fischer et al.이 사용하는 챔버는 또한 최대 4 개월 동안 개발 된 힘의 지속적인 등록을 가능하게하여 손상되지 않은 인간 심근에 대한 생리 학적 및 약리학 적 연구를위한 전례없는 기회를 열었습니다7.
유사한 기술이 다른 그룹에 의해 독립적으로 개발되어 인간, 래트, 돼지 및 토끼 심근7,10,11에 적용되었다. Pitoulis et al.은 수축 사이클 동안 정상적인 힘-길이 관계를 재현하는 보다 생리학적인 방법을 개발했지만, 고처리량 분석(16)에는 덜 적합하다. 이와 같이, 생체모방 재배의 일반적인 접근법은 동물 실험의 감소, 정제 및 대체(3R)를 위한 추가의 단계로 간주될 수 있다.
그러나 이러한 잠재력을 활용하려면 표준화된 절차, 높은 콘텐츠 분석 및 높은 처리량 수준이 필요합니다. 우리는 상용화 된 생체 모방 재배 시스템에서 살아있는 인간 심근의 자동화 된 슬라이싱과 시험관 내 유지 보수를 결합한 기술을 제시합니다 ( 재료 표 참조). 제안된 접근법으로, 단일 경막 심근 표본으로부터 생성될 수 있는 개별 슬라이스의 수는 처리 시간에 의해서만 제한된다. 충분한 크기와 품질 (3cm x 3cm)의 표본은 종종 자동화 된 vibratome으로 편리하게 절단되는 20-40 개의 조직 조각을 산출합니다. 이들 슬라이스는 시스템에 속하는 재배 챔버에 배치될 수 있다. 챔버는 전기 자극을 허용하며, 그 파라미터는 변조 될 수 있습니다 (즉, 펄스 지속 시간, 극성, 속도 및 전류), 챔버 내부의 스프링 와이어를 사용하여 사전 및 후부하의 조정. 각 슬라이스의 수축은 스프링 와이어에 부착 된 작은 자석의 움직임으로부터 등록되고 해석 가능한 그래프로 표시됩니다. 데이터는 항상 기록되고 자유롭게 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 분석 할 수 있습니다. 일정한 기준선 페이싱을 제외하고, 스케줄링된 프로토콜은 그들의 내화 기간, 자극 임계치, 포스트-일시정지-강화 및 힘-주파수 관계를 기능적으로 평가하기 위해 수행될 수 있다.
개별 심장에서 여러 심근 절편의 이러한 장기간의 생체 모방 배양은 인간과 동물 조직 모두에서 미래의 생체 외 연구를위한 길을 열어주고 심혈관 의학에서 치료 및 심장 독성 약물 효과에 대한 스크리닝을 용이하게합니다. 이미 다양한 실험적 접근법 2,12,13,15에 적용되었다. 여기에서는 인간 조직 준비에 대한 자세한 단계별 설명을 제공하고 자주 발생하는 재배 문제에 대한 솔루션을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
과거에는 심혈관 연구가 심근 세포 배양에 큰 발전을 이루었습니다. 그러나 손상되지 않은 기하학을 가진 심근 세포의 3D 배양은 아직 잘 확립되지 않았습니다. 심근 조직의 생체 외 배양에 적용된 이전의 프로토콜과 비교하여, 우리가 여기서 기술한 프로토콜은 조직의 생체내 환경과 더 밀접하게 닮았다. 또한, 사전 및 후부하의 적용은 더 많은 생체 모방 환경을 허용합니다. 우리는 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
연구는 DZHK 보조금 81Z0600207 (JH, PS 및 DM) 및 81X2600253 (AD 및 TS)이 자금을 지원했습니다.
저자들은 Claudia Fahney, Mei-Ping Wu 및 Matthias Semisch에게 셋업 준비와 조직 재배의 정기적 인 유지 보수에 대한 지원에 감사드립니다.
Materials
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish bioreactor system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
Riferimenti
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