Voorbereiding van menselijk myocardiale weefsel voor langdurige teelt
Summary
We presenteren een protocol voor ex vivo kweek van humaan ventriculaire myocardiale weefsel. Het maakt een gedetailleerde analyse van contractiekracht en kinetiek mogelijk, evenals de toepassing van pre- en afterload om de in vivo fysiologische omgeving beter na te bootsen.
Abstract
Cardiomyocytenteelt heeft een groot aantal ontwikkelingen doorgemaakt, variërend van tweedimensionale (2D) celkweek tot van iPSC afgeleide organoïden. In 2019 werd een ex vivo manier aangetoond om myocardiale plakjes verkregen uit menselijke hartmonsters te cultiveren, terwijl de in vivo toestand van myocardiale contractie werd benaderd. Deze monsters zijn meestal afkomstig van harttransplantaties of plaatsingen van linkerventrikelhulpmiddelen. Met behulp van een vibratoom en een speciaal ontwikkeld teeltsysteem worden 300 μm dikke plakken tussen een vaste en een veerdraad geplaatst, waardoor een stabiele en reproduceerbare teelt gedurende enkele weken mogelijk is. Tijdens de teelt worden de plakjes continu gestimuleerd volgens individuele settings. Contracties kunnen in realtime worden weergegeven en geregistreerd en farmacologische middelen kunnen gemakkelijk worden toegepast. Door de gebruiker gedefinieerde stimulatieprotocollen kunnen worden gepland en uitgevoerd om vitale contractieparameters zoals post-pauze-potentiatie, stimulatiedrempel, kracht-frequentierelatie en refractaire periode te beoordelen. Bovendien maakt het systeem een variabele voor- en nabelastingsinstelling mogelijk voor een meer fysiologische teelt.
Hier presenteren we een stapsgewijze handleiding over het genereren van een succesvolle langetermijnkweek van menselijke linkerventrikel myocardiale plakjes, met behulp van een commerciële biomimetische teeltoplossing.
Introduction
In het afgelopen decennium heeft de in vitro kweek van myocardiale cellen grote vooruitgang geboekt, variërend van 2D- en driedimensionale (3D) technieken tot het gebruik van organoïden en geïnduceerde pluripotente stamcellen gedifferentieerd tot cardiale myocyten 1,2,3. Ex vivo en primaire celkweek is van grote waarde gebleken, vooral voor genetisch onderzoek en medicijnontwikkeling 4,5,6. Het gebruik van menselijke weefsels verbetert de translationele waarde van de resultaten. Langdurige 3D-teelt van myocardiale weefsels met intacte geometrie is echter niet goed ingeburgerd. De intacte geometrie is een belangrijk kenmerk om in vivo omstandigheden na te bootsen, omdat een goede hartfunctie, communicatie tussen verschillende cellen en cel-matrixinteracties vereisten zijn. Myocardiale weefselkweek ging door verschillende ontwikkelingsfasen. Het succespercentage en de stabiliteit van ex vivo myocardiale weefselkweek waren aanvankelijk vrij laag, maar recente benaderingen hebben veelbelovende resultaten opgeleverd 7,8,9,10,11.
Fischer et al. waren de eersten die aantoonden dat de levensvatbaarheid en contractiele prestaties van menselijk myocardiaal weefsel gedurende vele weken kunnen worden gehandhaafd in ex vivo celkweek7. Hun techniek was gebaseerd op dunne weefselschijfjes gesneden uit geëxplanteerd menselijk myocardium, die werden gemonteerd in nieuw ontwikkelde kweekkamers die gedefinieerde biomechanische omstandigheden en continue elektrische stimulatie boden. Deze kweekmethode lijkt sterk op de in vivo functie van myocardiaal weefsel en is gereproduceerd door verschillende onafhankelijke onderzoeksgroepen 2,12,13,14,15. Belangrijk is dat de door Fischer et al. gebruikte kamers ook een continue registratie van ontwikkelde krachten gedurende maximaal 4 maanden mogelijk maakten en zo ongekende mogelijkheden openden voor fysiologisch en farmacologisch onderzoek naar intact humaan myocardium7.
Vergelijkbare technieken werden onafhankelijk ontwikkeld door andere groepen en toegepast op menselijk, ratten-, varkens- en konijnenmyocardium 7,10,11. Pitoulis et al. ontwikkelden vervolgens een meer fysiologische methode, die de normale kracht-lengterelatie tijdens een contractiecyclus reproduceert, maar minder geschikt is voor high-throughput analyse16. Als zodanig kan de algemene benadering van biomimetische teelt worden beschouwd als een verdere stap in de reductie, verfijning en vervanging (3R) van dierproeven.
Het benutten van dit potentieel vereist echter gestandaardiseerde procedures, analyses met een hoog gehalte en een hoog doorvoerniveau. We presenteren een techniek die geautomatiseerd snijden van levend menselijk myocardium combineert met in vitro onderhoud in een biomimetisch teeltsysteem dat commercieel beschikbaar is geworden (zie Materiaaltabel). Met de voorgestelde aanpak wordt het aantal afzonderlijke plakjes dat kan worden gegenereerd uit een enkel transmuraal myocardiaal specimen alleen beperkt door de verwerkingstijd. Een exemplaar van voldoende grootte en kwaliteit (3 cm x 3 cm) levert vaak 20-40 plakjes weefsel op die gemakkelijk worden gesneden met een geautomatiseerd vibratoom. Deze plakjes kunnen in teeltkamers van het systeem worden geplaatst. De kamers maken elektrische stimulatie mogelijk, waarvan de parameters kunnen worden gemoduleerd (d.w.z. pulsduur, polariteit, snelheid en stroom), evenals de aanpassing van voor- en nabelasting, met behulp van veerdraden in de kamers. De samentrekking van elke plak wordt geregistreerd door de beweging van een kleine magneet die aan een veerdraad is bevestigd en weergegeven als een interpreteerbare grafiek. Gegevens kunnen te allen tijde worden vastgelegd en geanalyseerd met behulp van vrij beschikbare software. Afgezien van de constante baseline pacing, kunnen geplande protocollen worden uitgevoerd om hun refractaire periode, stimulatiedrempel, post-pauze-potentiatie en kracht-frequentierelatie functioneel te beoordelen.
Deze biomimetische teelt op lange termijn van meerdere myocardiale plakjes uit een individueel hart maakt de weg vrij voor toekomstig ex vivo onderzoek in zowel menselijk als dierlijk weefsel en vergemakkelijkt de screening op therapeutische en cardiotoxische geneesmiddeleffecten in de cardiovasculaire geneeskunde. Het is al toegepast op verschillende experimentele benaderingen 2,12,13,15. Hier geven we een gedetailleerde stapsgewijze beschrijving van de voorbereiding van menselijk weefsel en bieden we oplossingen voor vaak voorkomende teeltproblemen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In het verleden heeft cardiovasculair onderzoek grote vooruitgang geboekt bij de teelt van cardiomyocyten. De 3D-teelt van cardiomyocyten met intacte geometrie is echter nog niet goed ingeburgerd. Vergeleken met eerdere protocollen die werden toegepast voor ex vivo kweek van myocardiaal weefsel, lijkt het protocol dat we hier beschreven meer op de in vivo omgeving van het weefsel. Bovendien zorgt de toepassing van pre- en afterload voor een meer biomimetische omgeving. We zijn in staat om de continue re…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek werd gefinancierd door DZHK-subsidies 81Z0600207 (JH, PS en DM) en 81X2600253 (AD en TS).
De auteurs willen Claudia Fahney, Mei-Ping Wu en Matthias Semisch bedanken voor hun steun bij het voorbereiden van de opstellingen, evenals voor het regelmatige onderhoud van de weefselkweek.
Materials
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish bioreactor system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
Riferimenti
- George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices. Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).
- Lu, K., et al. Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium. Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).
- Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS one. 7 (5), 38147 (2012).
- Klumm, M. J., et al. Long-term cultivation of human atrial myocardium. Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).
- Krane, M., et al. Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome. Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).
- Miller, J. M., et al. Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Kang, C., et al. Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Ou, Q., et al. Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).
- Ou, Q., et al. Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices. Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).
- Abu-Khousa, M., et al. The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium. Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).
- Bojkova, D., et al. SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).
- Esfandyari, D. A. -. O., et al. MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Moretti, A., et al. Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy. Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).
- Pitoulis, F. G., et al. Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro. Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).
- Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
- de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).
- Schleifer, K. J. Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).
- Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent. Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
